天然蚕丝纤维制成的制品的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蚕丝（silk)加工领域，尤其是提供医用蚕丝材料。
【背景技术】
[0002] 蚕丝用于生物医学缝线已有几十年历史，观察到了潜在的宿主免疫反应。这可能 是蚕丝在过往的生物医学应用中不予考虑的主要原因。引发免疫反应的主因与丝胶蛋白 (sericin)有关（综述：Altman等，Biomaterials24 (2003) ,401-416)。故，从生丝（raw silk)彻底除去丝胶蛋白，是组织工程化和再生医学应用中制备丝织物、但避免生物相容性 问题的关键步骤。
[0003] 大多数情况下，蚕丝是从家蚕（Bombyxmori)幼虫的蚕苗获得的。单个蚕苗纤维 由被称为丝胶蛋白的胶状蛋白包绕两个丝素蛋白（fibroin)链核心而成，其中由丝胶蛋白 将多个丝素蛋白纤维互相固定。丝素蛋白和丝胶蛋白分别占约75和25%wt.。
[0004] 蚕丝丝素蛋白在形态上以高度有序的晶态纤维结构为特征。这种结构使它不溶于 诸如水、乙醇、稀酸和碱等大多数溶剂。与丝素蛋白相反，球状的丝胶蛋白易溶于水性溶剂。 纺织业对于去除丝胶蛋白也有极大兴趣，因为蚕丝服装的光泽会被丝胶掩盖。因此，不光是 生物材料领域要研宄蚕丝，纺织业也在寻找最佳的脱胶方法。这导致出现多种脱胶方法，包 括，碱性溶液（不加表面活性剂）、尿素、酒石酸、柠檬酸、或诸如木瓜蛋白酶或内肽酶等酶 类。用硼酸加硼酸盐作为脱胶剂的可能性在纺织工程化领域已有人描述。在这些研宄中， 硼酸盐缓冲液被单独用于使未经处理的原料蚕丝纤维脱胶（Jiang等MaterialsLetters 60/7(2006),919-925)或与表面活性剂组合使用（JP2 269870A)或作为所谓"洗毛剂 (scouringagent)"用于单根纤维或梭织物（wovenfabric)。在后一种情况中，硼酸盐缓 冲液被用于擦洗纤维表面，使之易于接受诸如漂白、染色等其它纺织工程化处理、但不必完 全除去丝胶蛋白（JP1 229803A)。这类制品因此仍包含较多丝胶蛋白（例如，超过丝胶蛋 白总量的半数仍存在于制品中）。丝胶蛋白的不完全去除对于医学领域而言是不够的，因为 残余的丝胶蛋白会引发免疫反应。因此，这方面与本申请的领域无关。
[0005] 由于其应用非常广泛且功能稳定，硼酸盐缓冲液在传统上用于多项生物医学和生 物技术应用。在此上下文中，应注意硼酸盐缓冲液已用在基于酶的脱胶方法中将特定蛋白 酶的pH值保持在最佳工作范围（CN102605439A(摘要））。这意味着该缓冲液并未将其自 身当做脱胶剂，而是当做给脱胶酶提供最佳PH工作范围的试剂。同样地，硼酸也已用于在 使用肥皂的纺织工程化脱胶工艺中控制pH(FR2528076A1)。
[0006] 传统的脱胶法是将生丝置于有或无表面活性剂的碱性溶液中煮沸，表面活性剂有 助于使丝胶蛋白从纤维结构中脱离出来。值得注意的是，通常是用0.02M碳酸钠溶液在 KKTC处理30-60min来完成脱胶，尤其是在组织工程化研宄领域。这种碱性脱胶常常以批 量处理，使用的是肥皂或表面活性剂加碱。
[0007] 但是，不同的研宄显示，丝胶蛋白的去除引起蚕丝纤维磨损，削弱其结构特性，难 以将它们纺织改造（如编织或编辫）成适合组织工程化应用的骨架（LiU等J.Biomed. Mater.Res.BAppl.Biomater. 82 (2007) ,129-138)。因此，在一些研宄中，先构建蚕丝骨 架再进行脱胶工艺（Fan等，Biomaterials30 (2009) ,4967-4977;Fan等，Biomaterials 29 (2008)，3324-3337;Chen等，Biomaterials29 (2008)，3683-3692)。但应注意，所有这些 研宄的骨架基础都是"普通（plain) "网格（Chen等，Biomaterials29 (2008)，3683-3692)， 厚度不超过500ym。而且，他们描述的网都以低水平几何层级为特征，例如只有简单的纺织 编织技术。与高层级纺织工程化改造的骨架相比，单个的蚕丝纤维能很好地暴露于脱胶液， 并可以因此用传统的碳酸钠溶液脱胶（见图IlA和11B)。
[0008] Liu等，2007提议了一种增加无丝胶蛋白型纤维的加工特性、但劳动强度较大的 方案。此研宄描述了一种通过将不含丝胶蛋白的蚕丝纤维与明胶进行化学交联、而用明胶 替代丝胶蛋白的方法。
[0009]Altman等（Biomaterials23 (2002)，4131-4141)探寻了 天然香丝丝素蛋白纤 维（纱线）在有动态机械加载的培养物中作为前交叉韧带（ACL)组织工程化的3D骨架 的潜力：提取丝胶蛋白后，蚕丝丝素蛋白纤维抒成6束缆绳基体（wire-ropematrices)， 与由并行纤维形成的同等基体相比，具有改进的弹性、但不牺牲拉伸强度。这种基 体与天然ACL中胶原纤维相似的层级结构（hierarchalstructure)，而且力学特性 (mechanicalproperties)与天然人ACL在强度、劲度、屈服点（yieldpoint)、和断裂处的 百分比延长方面相当。此外，这种缆绳几何结构增加了用于细胞附着的表面积和胞外基体 (ECM)沉积，弱化了质量转移的限制，都是些引起新组织形成的因素。蚕丝丝素蛋白骨架支 持成人骨髓来源的间质干细胞（MSCs)进行附着、散播、增殖和分化。
[0010] 尽管蚕丝在组织工程学方面的应用很急迫，而且多个生物医学研宄小组和工业研 宄小组正进行大量的脱胶工艺研宄，仍需要了解具有高层级几何结构的纺织工程化构建物 脱胶有哪些选择。因此，目前尚缺能从紧密的高层级原料家蚕蚕丝纤维基体，例如打算用于 前交叉韧带组织工程化的那些，除去丝胶蛋白的脱胶方法。
[0011] 与之截然相反，提供医用蚕丝材料的方法几乎是唯一的：将蚕丝纤维于含水体系 中彻底溶解，然后通过诸如离心（spinning)、电纺丝（electrospinning)、由水性系统或有 机溶剂系统注浆成形（casting)、凝胶化、起泡等等，将该蚕丝溶液再加工为所需形式的材 料（V印ari等，2007,US5, 252, 285A) 〇
[0012] 但这些由丝素蛋白溶液再加工出的蚕丝材料与天然固有蚕丝结构不同，如机械强 度减弱。另一方面，蚕丝纤维已广泛用作伤口缝合线；但这些纤维在用之前必须脱胶，因为 丝胶蛋白会引起副作用（Kaplan等，Biomaterials24(2003)，401-416)。有关蚕丝缝线的 最主要生物相容性问题的报道是关于生丝（virginsilk)，其中的丝胶蛋白仍然覆盖核心 蚕丝丝素蛋白纤维。哮喘的诱导和IgE水平的上调可见于用生丝缝合的患者。在Dewair 等（J.AllergyClin.Immunol. 76(1985)，537-542)的研宄中，经皮肤测试，特异性IgE的峰 值以及蚕丝反应性患者中的阳性反应程度可见于具有最高丝胶蛋白含量（在所测试的蚕 丝样品中）的组。而且，原生蚕丝纤维周围炎症细胞包括巨噬细胞的活化已得到证实，而在 不含丝胶蛋白或丝素蛋白纤维包裹了明胶的对照组中，未发现活化。显然，植入的生物医学 物不应引起这类外源机体反应。因此由蚕丝制得的生物材料必须不含丝胶蛋白。但是，由 于脱胶的蚕丝纤维在形成最终生物材料（例如维系带），尤其三维生物材料的过程中的负 面特性，需要有改进的方法来提供基于蚕丝的生物材料。这些方法应允许稳健、可再现且可 靠的制备方法；另一方面，这些制品应基本不含丝胶蛋白，从而允许制得的生物材料能加以 应用，尤其医用。因此，本发明的一个目标是提供这样的方法，这样的方法应该也特别适于 医学目的，尤其适于疗法和外科手术。
【发明内容】
[0013] 因此，本发明提供了制备三维蚕丝制品的方法，其中天然蚕丝纤维形成三维蚕丝 制品，所形成的蚕丝制品经历脱胶步骤，在该步骤中，用硼酸盐缓冲液作为脱胶剂，而且所 形成的蚕丝制品优选与含水乙醇缓冲液接触后再进行脱胶步骤。
[0014] 本发明的方法允许蚕丝有效脱胶，尤其三维制品脱胶。现有技术的脱胶制品仍含 有至少1% (w/w)(或甚至至少2% (w/w))的丝胶蛋白，本发明的制品基本不含丝胶蛋白， 即，丝胶蛋白含量低于0.1 % (w/w)，优选低于0.05% (w/w)，尤其低于0.01 % (w/w)(实践 中也取决于丝胶蛋白检测方法，有不同的检测极限）。例如，本发明的制品在电镜下看不到 任何丝胶蛋白残留或在丝胶蛋白染色实验中看不到丝胶蛋白着色。显然，丝胶蛋白含量高 的纺织制品（如JP2 269870A或JP1 229803A公开的那些不适于医用，因此原则上排 除在本发明之外（与丝胶蛋白如何（部分）去除无关）。
[0015] 在本发明过程中意外发现，用本发明的脱胶步骤，可以从天然蚕丝纤维制成的复 合三维蚕丝制品中有效去除丝胶蛋白。这允许由天然蚕丝纤维（其中丝胶蛋白仍是纤维的 一部分）制备三维制品，由于天然蚕丝纤维比脱胶的蚕丝纤维或（从丝素蛋白溶液）再加 工的蚕丝纤维有更好的操作特性（handlingproperties)，这提供了显著的优点和潜能。
[0016] 现有技术的方法如碱处理或蛋白酶处理等未报道能从蚕丝纤维成功脱胶（Fan 等，2008, 2009 ;Freddi等，2003)，与之相反，本发明的脱胶方法能获得基本不含丝胶蛋白 的三维蚕丝制品。现有技术的方法未能从高度扭曲的炜线（例如织物等材料中的高度扭曲 炜线）成功除去丝胶蛋白，而本发明的脱胶方法提供医学应用所必需的丝胶蛋白去除。
[0017] 因此，有了本发明，就有可能先产生复杂三维蚕丝结构再进行脱胶步骤。与应用脱 胶的蚕丝纤维或再加工的蚕丝纤维相比，这能提供