大视场超分辨率动态相位无透镜显微成像装置与重构方法与流程

本发明属于无透镜光学显微成像技术，特别是一种面向大视场超分辨率动态相位无透镜显微成像装置与重构方法。

背景技术：

在显微成像领域，高分辨率一直是追求的目标，但是传统显微镜往往牺牲成像视场来获得更高的成像分辨率，即高分辨率提高的同时显微镜的空间带宽积并没有一起提高。由于空间分辨率与视场是一对难以调和的矛盾，简而言之，在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，换成高倍物镜时，就只能看到被检物体的很小一部份。目前，为了突破分辨率与视场大小难以同时兼顾的矛盾，常见的方法是采用常规显微镜系统配合高精度机械扫描和后期空域图像拼接方法将多个小视场高分辨率图像拼接融合生成一幅大视场高分辨率图像(适用于结核杆菌抗酸染色图像拼接的装置，2013205777012)。但是由于引入了机械移动装置，所以系统成像时的稳定性和成像速度又成为一对难以调和的矛盾，提高扫描速度必将影响成像稳定性。所以，想要解决分辨率与视场大小难以同时兼顾的矛盾又不引入了机械移动装置，必须采用近年来提出的计算成像的方法，比如基于合成孔径的成像方法、无透镜显微成像技术。

无透镜显微成像技术作为一种新型的大视场高分辨显微成像技术在最近的十几年获得了快速的发展，其中aydoganozcan团队提出了多种提高无透镜显微成像分辨率的方法，并首次将无透镜成像中的超分辨过程和重构过程融合在统一的数学框架里。在无透镜显微成像中，限制重构分辨率的一个关键因素是成像传感器的像素尺寸大小。受制于传感器制造工艺水平，传感器的像元尺寸不能无限小，所以无透镜显微镜的成像分辨率往往低于相机像元尺寸所决定的奈奎斯特采样分辨率。传统方法是通过对样品/光源进行横向机械亚像素位移(使用光源阵列类比于横向位移光源)，利用像素超分辨率算法对一系列低分辨率的全息图进行处理获得更高分辨率的图。近几年来，还发展出利用多角度照明、轴向扫描等方法来实现强度的像素超分辨。但是上面的这些方法都需要依赖精准的机械移动，如1弧秒精准旋转位移台、亚像素横向位移台等，或者可调多波长光源(需要依赖于高精度的波长可调谐激光器)，这些机械结构显著地提高了系统的成本、降低了鲁棒性。此外，对于无透镜显微成像，目前已有的超分辨率方法大部分都局限于强度超分辨率,难以适应当前生物医学领域非侵入式成像的需求，即在生物成像领域，生物样品进行染色等手段进行标记时将会对样品活性产生影响，但对大部分未染色的生物细胞样本而言，因其在可见光波段的弱吸收性，不能直接由相机直接采集得到，所以必须借助于相位信息成像。所以如何搭建出简单高效的大视场超分辨率动态相位无透镜显微成像装置以及提出相应的重构方法成为了无透镜显微成像技术中必须克服的技术难题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种面向大视场超分辨率动态相位无透镜显微成像装置与重构方法，在极大地简化系统降低成本的同时实现大步进小位移，并在提升成像系统的空间带宽积的同时，实现相位成像，且对噪声的鲁棒性能够有效地提高。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种大视场超分辨率动态相位无透镜显微成像装置，包括依次设置的部分相干或者相干光源、第一平行平板、第二平行平板、样品台、相机构成成像系统，所述部分相干或者相干光源安放于整个成像系统的最上方，并且光源的发光位置位于整个成像系统的光轴上。

一种大视场超分辨率动态相位无透镜显微成像的重构方法，步骤如下：

步骤一，图像采集：部分相干或者相干光作为光源，经过平行平板，照射样品后在相机上成像，平行平板每旋转一个角度，相机就采集一幅图像；

步骤二，初始化：拍到的第一帧图像通过光强传输方程来求取相位，将该相位作为初值利用迭代相位恢复方法求得初始化的相位以及光强信息；

步骤三，帧间亚像素位移量判断：利用采集的图像作为限制值，通过光波复振幅信息在空间中的传递模型，计算出理论的光强信息，通过频域特征空间亚像素定位算法判断出与实际的光强信息的相对亚像素位移量；

步骤四，复振幅信息更新以及迭代重构：对理论的光强信息进行亚像素位置更新后，利用迭代更新系数，再次对理论的复振幅信息更新；

步骤五，停止迭代判断：当迭代次数未满足预设次数时，将步骤三中参考光强更新为采集到的第一帧光强上采样后的图；当达到最后一帧时且满足迭代预设次数，停止迭代，此时空域上获得超分辨率的相位信息，即实现大视场超分辨率相位重构。

本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)能够在大步进下实现亚像素级别的小位移，降低了系统对硬件本身的精度要求，从而极大地简化了系统降低了成本。(2)采用频域特征空间亚像素定位算法，利用实际采集的图像作为参考，从上一帧中计算出理论的该帧图像的位置，从而可以精确地获得帧间亚像素位移量，提高了无透镜成像的精度。(3)在每次利用阈值限制时，都采用迭代更新系数(可以是固定值也可以是自适应值)，提高了方法的鲁棒性，降低图像噪声对校正精度的影响，能够非常稳定并且准确地重建出大视场高分辨率图像。(4)在迭代重构的过程中能够同时实现相位重构和像素超分辨率，无需分步进行，解决了显微系统分辨率与视场大小难以同时兼顾的矛盾。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1是大视场超分辨率动态相位无透镜显微成像装置原理图。

图2是平行平板产生亚像素位移的原理图。

图3是大视场超分辨率动态相位无透镜显微成像的重构方法流程示意图。

图4是以分辨率板作为待测样品的大视场超分辨率动态相位显微成像仿真结果图；图4(a)表示理论上应该重构出的高分辨率相位图；图4(b)表示的是仿真的相机采集到的降采样的强度图；图4(c)是传统单幅图限制迭代重构后的相位图；图4(d)使用本方法进行迭代重构后的相位图。图4(e)和图4(f)分别是图4(c)和图4(d)中矩形区域的局部放大图。

图5是以具有活性的宫颈癌细胞为样品，重构出的相位超分辨成像结果图；图5(a)相机直接采集到的大视场原始图；图5(a1-a3)对应于图5(a)的局部区域放大图；图5(b1-b3)利用迭代法获得的重构相位图(未进行超分辨率)，对应图5(a1-a3)所示区域；图5(c1-c3)使用本方法进行迭代重构后的相位图，对应图5(a1-a3)所示区域。

具体实施方式

本发明面向大视场超分辨率动态相位无透镜显微成像装置中，由部分相干或者相干光源1、第一平行平板2、第二平行平板3、样品台4、成像传感器5构成成像系统，光源1作为无透镜显微镜的照明光源，其被直接安置在样品台4上方，并且光源的发光中心位置位于整个成像系统的光轴上。

部分相干或者相干光源1距离样品4的上表面距离h一般在20～40mm之间，相机5与样品4的距离d为5μm～2mm。第一平行平板2、第二平行平板3为两个块玻璃构成，放置在部分相干或者相干光源1与样品台4之间。

由于平行平板玻璃的折射率大于空气折射率，光线入射平行平板后会产生折射，折射角小于入射角，从而使得垂直入射的光线产生横向位移，其中，入射角与折射角之差很小，所以可以实现大步进(平行平板旋转角度大且对其精度要求低)小位移(利用入射角与折射角角度小的特点实现亚像素级别的位移)。第一平行平板2、第二平行平板3均可实现单独的旋转，实现控制第一平行平板2、第二平行平板3旋转的具体方法为现有技术，实现方式可以(但不限于)采用arduino板控制伺服电机，具体实现方法可参考相关文献。通过平行平板的旋转，实现对光束的偏折。

由于平行平板玻璃的折射率大于空气折射率，光线入射平行平板后会产生折射，折射角小于入射角，从而使得垂直入射的光线产生横向位移，其中，入射角与折射角之差很小，所以可以实现大步进(平行平板可以大角度旋转且对其精度要求低)小位移(利用入射角与折射角角度小的特点实现亚像素级别的位移)。结合图2，玻璃的折射率n大于空气中的折射率，利用入射角θ和折射角β之差从而获得单一方向的横向亚像素位移量另一个平行平板操作方式类似，可以获得另一个方向的亚像素位移。

整个成像系统极大地简化了传统无透镜超分辨率成像系统，抛弃了原有的高精度锆钛酸铅压电陶瓷(pzt)位移台(或者高精度旋转台)，降低了整个成像系统的成本，能够在大步、低精度的硬件条件下，利用光线在不同介质中的折射率的差异，实现小步进(亚微米)位移。

结合图3，本发明提出的大视场超分辨率动态相位无透镜显微成像的重构方法，其步骤包括：

步骤一，图像采集：部分相干或者相干光作为光源，经过平行平板，照射样品后在相机上成像，第一平行平板2或者第二平行平板3每旋转一个角度，相机就采集一幅图像，即两个平行平板任意一块平板发生角度的改变时，相机就采集一幅图像。

部分相干或者相干光源1作为无透镜显微镜的照明光源，经过第一平行平板2、第二平行平板3、照射样品4，最后在相机5上成像。第一平行平板2、第二平行平板3依次旋转不同角度(两块平行平板可以随机旋转，旋转角度也可以随机)，每个平行平板最大旋转角度范围在-90°～+90°，每次平行平板2、3旋转后采集一幅低分辨率的图像，ii(t)，i＝1,2,...,n，n为采集的图像总数量，t为时间域上的变量，不同时间采集到的ii(t)存在对应的第一平行平板2、第二平行平板3倾斜角度相同的可能。

步骤二，初始化光强和相位信息：拍到的第一帧图像通过光强传输方程来求取相位，将该相位作为初值利用迭代相位恢复方法求得初始化的相位以及光强信息。

利用部分相干或者相干光源经过第一平行平板2、第二平行平板3后照射样品4所拍摄到第一帧低分辨率图像来初始化高分辨率图像的振幅与相位。假设拍摄到的第一幅图的强度图为i0(t0)，利用相位物体的在聚焦面上光强是均匀的先验知识，第一帧图像对应的在物面上的光强信息记作具体如下式所示

式中，m,n分别表示采集到的低分辨率图像的横向和纵向的像素数，sum表示为将该幅低分辨率图中所有的像素对应的灰度值求和。然后，求解光强的轴向微分值，d为样品4与相机5之间的距离，从而光强传输方程可以表示为

式中，λ为照明光源的波长，表示哈密顿算子。通过解上述光强传输方程，可以解得相位信息φ。然后将光强信息i0(t0)和计算得到的相位信息φ作为初值，代入迭代相位恢复方法求得初始化的相位以及光强信息。该迭代过程具体为：

①利用i0(t0)和φ，获得复振幅信息其中j为迭代次数；

②利用光在空间中的传播模型，计算得到在物面上的复振幅信息其中h代表传递函数，传播距离为-d；

③将作为限制值更新获得新的复振幅为其中abs为取复数的模，angle为取复数的幅角；

④将更新后的传播i0(t0)所在的平面，获得其中h′代表传递函数，传播距离为d；

⑤将i0(t0)作为阈值更新获得新的复振幅为其中abs为取复数的模，angle为取复数的幅角；

⑥重复步骤②-⑤iter次，iter为预先设置的值的大于0的整数。最终获得初始化的强度和相位信息，分别为和

步骤三，帧间亚像素位移量判断：利用采集的图像作为限制值，通过光波复振幅信息在空间中的传递模型，计算出理论的光强信息，通过频域特征空间亚像素定位算法判断出与实际的光强信息的相对亚像素位移量。

将步骤二中获得的强度和相位进行上采样，得到和↑代表图像上采样，即将图像由原始的l像素插值为l个像素。上采样后的响度和相位构成新的复振幅如果更新到采集的第k幅图时，此时新的复振幅为uk，k为采集到的图像的序列(当不是第一次进行步骤三时即k≠0，uk为上一次进行步骤四的第③步获得的复振幅信息，且无需进行上采样操作)。利用快速傅立叶变换，计算abs(uk)²与↑ik(tk)(↑ik(tk)表示上采样采集到的第k幅光强图)之间的互相关，并确定其峰值位置，从而确定出abs(uk)²与↑ik(tk)之间的亚像素位移量

步骤四，复振幅信息更新以及迭代重构：对理论的光强信息进行亚像素位置更新后，利用迭代更新系数，再次对理论的复振幅信息更新。

其步骤具体可以细分为以下四个步骤：

①根据步骤三，获得相对的亚像素位移量后，对uk进行亚像素的位移，得到位移后的复振幅信息为利用第k幅采集到的图ik(tk)对进行更新，更新后的光强为：其中，↓代表图像下采样，即将图像由原始的l个像素降低为l个像素。

②利用更新后的光强信息，更新采集到的第k幅图的所对应的样品复振幅信息。其中α为松弛系数，可以根据需要取0～1之间的值。

③将亚像素平移回初始位置，位移量为得到新的将新的反传播回聚焦面，获得聚焦面上的复振幅信息利用相位物体在聚焦面上光强近似均匀作为先验，即光强信息近似为i′k，然后对进行更新，获得然后将获得的u″k通过波在空间中的传播模型传播到相机平面，得到复振幅信息uk。

④利用下一帧图像作为限制条件，即k＝k+1，重复步骤三以及步骤四中的①-③。

步骤五，停止迭代判断：当达到最后一帧时未达到迭代预设次数nmax时，将实际光强更新为采集到的第一帧光强图，重新进行步骤三、步骤四；当未达到最后一帧图像时，继续迭代循环步骤三、步骤四。当达到最后一帧时且满足迭代预设次数nmax(nmax≥1的整数)，停止迭代，此时空域上可以获得超分辨率的相位信息，即实现大视场超分辨率相位重构。

为了验证大视场超分辨率动态相位无透镜显微成像的重构方法，利用分辨板进行仿真测试，整个仿真过程模拟了光经过样品后的整个传播过程，考虑了相机采集图像时产生的噪声，以及平行平板对光线产生的横向位移。图4(a)表示理论上应该重构的高分辨率相位图；图4(b)表示的仿真的相机采集到的强度图；图4(c)是传统单幅图限制迭代重构后的相位图；图4(d)使用本方法进行迭代重构后的相位图。图4(e)和图4(f)分别是图4(c)和图4(d)中矩形区域的局部放大图。对比其中图4(e)和图4(f)可以明显看出本发明方法能够实现大视场高分辨率相位成像，且重构图像具有良好的信噪比。

为了测试一种面向大视场超分辨率动态相位无透镜显微成像装置与重构方法。以具有活性的宫颈癌细胞为样品(对宫颈癌细胞样品未进行任何染色等预处理)，重构出的相位超分辨成像结果如图5所示。图5(a)相机直接采集到的大视场原始图；图5(a1-a3)对应于图5(a)的局部区域放大图；图5(b1-b3)利用迭代法获得的重构相位图(未进行超分辨率)，对应图5(a1-a3)所示区域；图5(c1-c3)使用本方法进行迭代重构后的相位图，对应图5(a1-a3)所示区域。对比实验结果，可以明显看出，结合面向大视场超分辨率动态相位无透镜显微成像装置，本发明方法能够实现提高相位成像的分辨率，并且重构出的图像具有良好的信噪比。