一种基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统的制作方法

本实用新型涉及一种基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统和方法，具体是利用位移台控制机制实现倒置显微镜下光学超分辨率显微观测成像，并可以实现宏、微、纳无缝观测，以及具有实时视觉反馈的纳米操作。主要用于需要纳米级超分辨率实时动态观测和操作领域，包括材料、生命科学等各个领域。

背景技术：

19世纪末，德国科学家恩斯特·阿贝定义了光学显微镜的分辨率，认为是光波长的一半，即：约为0.2微米，这就是著名的光学衍射极限。因此，在二十世纪的大部分时间里，科学家们都相信光学显微镜永远无法突破衍射极限的限制。然而，随着科学研究的深入，尤其是生物科学领域的研究，人们早已开始研究细胞的内部结构，因此需要对细胞内部的组织结构进行活体观测。电子显微镜只能观测死亡细胞的表面，无法观测活体细胞的内部结构。近些年来发展起来的利用荧光探针的超分辨荧光显微技术，包括：受激发射损耗显微镜超分辨成像(STED)、饱和结构照明显微技术(SSIM)、以及随机光学显微重构技术 (STORM)和光激活定位显微技术(PALM)，虽然革命性地突破了光学衍射极限的限制，然而他们成像费时并受限于荧光探针，因而不能提供面向全貌和实时的超分辨光学成像。例如：所述的STED是串行扫描工作模式，逐点扫描成像效率低；所述的STORM是以时间换取空间分辨率，成一幅图像近场需要处理成千上万张照片所需时间在十分钟以上。这些方法对荧光染剂具有很强的依赖性，成像前需要对样品进行荧光染色。样品需要特殊荧光染剂，只适用于某些生物样本成像。基于微球透镜的超分辨率的光学成像的技术研究成果最早发表于2009年Nature杂志(www.nature.com/doifinder/10.1038/nature08173)，当时的分辨率为220nm，两年后，这个分辨率被提高到了50nm(Nature Communication, DOI:10.1038/ncomms1211)。不同于荧光显微镜的是，基于隐失波的纳米成像不需荧光染剂，而且是自然光照条件，因而更具有广泛应用的意义，适合任何样本成像。

到目前为止，基于微球透镜的超分辨率成像只能在正置显微镜上实现而不能在倒置显微镜上实现，原因在于由倏逝波被吸收后转化的传播波的传播方向是从样品向微球方向传播。在正置显微镜下，这些转化的传播波正好被物镜采集后成像；而在倒置显微镜下，这些转化的传播波远离显微镜的物镜，因此无法被物镜采集并成像。而倒置显微镜广泛用于观测生物细胞内部结构组织，它是生物学研究细胞功能的重要仪器。同时倒置金相显微镜也是鉴定和分析金属内部结构组织，和金属学研究金相的重要仪器，是工业部门鉴定产品质量的关键设备，该仪器配用摄像装置，可摄取金相图谱，并对图谱进行测量分析，对图像进行编辑、输出、存储、管理等功能。如果能在倒置显微镜下实现光学超分辨率成像，其意义将非常重大。

技术实现要素：

本实用新型所要解决的技术问题是：提供一种可在倒置显微镜下实现光学超分辨率成像的基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统。

为解决上述技术问题，本实用新型采用的技术方案为：一种基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统，包括：光学反光镜1、微球透镜2、原子力显微镜扫描探针3、样品台5、光学倒置显微镜6和位移台7，原子力显微镜扫描探针3通过其基底30粘贴在光学反光镜1上，所述的微球透镜2固定在所述原子力显微镜扫描探针3的悬臂梁31和针尖32上，并且，微球透镜2位于光学反光镜1的下方，光学反光镜1固定在位于其上方的位移台7上；所述的样品台5位于微球透镜2的下方，所述的光学倒置显微镜6位于所述样品台5 的下方，并且，光学倒置显微镜6的物镜位于所述的微球透镜2的正下方。

作为一种优选方案，在所述的一种基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统中，所述微球透镜2的尺寸直径在20～100微米之间。

作为一种优选方案，在所述的一种基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统中，所述的微球透镜2设置于所述原子力显微镜探针3的悬臂梁 31的末端。

作为一种优选方案，在所述的一种基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统中，所述微球透镜2的最底端位置与样品4表面的距离小于1微米。

作为一种优选方案，在所述的一种基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统中，所述的光学倒置显微镜6的物镜放大倍数大于等于20倍。

本实用新型还提供了一种基于微球透镜和倒置显微镜的光学超分辨率系统的动态成像方法，其步骤包括：将样品4置于样品台5上，并使得样品4位于微球透镜2的下方；将光学倒置显微镜6的工作平面聚焦到微球透镜2的虚像像平面上，通过位移台7移动微球透镜2到待观测或操作区域；通过光学倒置显微镜6观测微球透镜2的位置，并使用位移台7来移动微球透镜2，使微球透镜2与样品4之间保持在设定的距离范围内，然后，光学倒置显微镜6获取通过微球透镜2所呈现的超分辨率图像。

作为一种优选方案，在所述的一种基于微球透镜和倒置显微镜的光学超分辨率动态成像方法中，所述的光学倒置显微镜6将通过微球透镜2所呈现的超分辨率图像发送至计算机。

作为一种优选方案，在所述的一种基于微球透镜和倒置显微镜的光学超分辨率动态成像方法中，通过控制位移台7和/或样品台5的移动来控制微球透镜 2与样品4之间的相对运动，实现光学倒置显微镜6通过微球透镜2对样品4的动态观测成像

本实用新型的有益效果是：

1、本实用新型采用微球透镜打破了光学倒置显微镜下光学衍射极限，在自然光照条件下，利用普通光学倒置显微镜就能实现纳米级的分辨率，为实现活体细胞内部纳米结构的观测研究提供了有效技术手段，并且，将位移台和微球透镜显微技术相融合，实现超分辨率动态光学显微成像，为光学倒置显微镜提供视觉定位观测和实时视觉反馈纳米操作，拓展了光学倒置显微镜纳米观测成像及纳米操作能力。

2、构建了基于光学显微镜成像、基于反光微球透镜的超分辨率成像宏、微、纳无缝观测。针对待观测的纳米尺度目标，可以先利用光学倒置显微镜锁定待观测目标的大致位置，再利用微球透镜进行超分辨率动态观测成像，实现观测目标的初步定位，从而实现宏、微、纳无缝定位观测。

3、本实用新型可以实现倒置显微镜对纳米物体进行视觉观测定位问题，以及纳米操作时的实时视觉反馈问题，提高了纳米观测和纳米操作的效率和成功率。

4、在对纳米操作对象进行实时成像时，无需额外对样品进行修饰，因而不局限于荧光成像，成像范围不受待观测物体的自身属性的限制。

附图说明

图1为本实用新型的系统结构原理示意图。

图2为本实用新型的系统工作原理示意图。

图1至图2中的附图标记为：1、光学反光镜，2、微球透镜，21、微球透镜镜像，3、原子力显微镜扫描探针，30、基底，31、悬臂梁，32、针尖，4、样品，41、样品表面镜像，42、超分辨率的虚像的镜像位置，43、样品表面的超分辨率虚像，5、样品台，6、光学倒置显微镜，61、物镜，7、位移台。

图3为微球透镜远离样品时在光学倒置显微镜下的图像。

图4为蓝光DVD轨道样品超分辨率光学的图像。

具体实施方式

下面结合附图，详细描述本实用新型所述的一种基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统及采用该系统的动态成像方法的具体实施方案：

如图1所示，本实用新型所述的一种基于倒置显微镜和微球透镜的光学超分辨率成像系统，包括：光学反光镱1、微球透镜2、原子力显微镜扫描探针3、样品台5、光学倒置显微镜6以及可作三维精密运动的位移台7，所述的原子力显微镜扫描探针3的具体结构包括：基底30、设置在基底30上的悬臂梁31、以及设置在悬臂梁31上的针尖32；原子力显微镜扫描探针3的基底30粘贴在所述的光学反光镜1上，所述的微球透镜2通常采用胶水固定在原子力显微镜扫描探针3的针尖32和悬臂梁31的末端上，微球透镜2的直径在20～100微米之间，微球透镜2位于光学反光镜1的下方，光学反光镜1固定在位于其上方的位移台7上；所述的样品台5位于微球透镜2的下方，所述的光学倒置显微镜6位于所述样品台5的下方，并且，光学倒置显微镜6的物镜位于所述的微球透镜2的正下方。在本实施例中，所述的光学倒置显微镜6的物镜放大倍数大于等于20倍；所述的微球透镜2的最底端位置与所述样品4表面的距离小于 1微米。

在实际应用时，所述的原子力显微镜扫描探针也可以由扫描隧道显微镜探针或扫描离子电导显微镜毛细管探针替代；并且，在动态观测成像时，微球透镜2和光学倒置显微镜6的物镜的相对位置要固定不变；所使用微球透镜2的材料、尺寸和形状与观测环境相关，比如在空气中时，可采用2微米至9微米二氧化硅微球透镜或30微米至300微米聚苯乙烯微球透镜等；在液体中时，可采用2微米至300微米，折射率为1.8～2.2的微球透镜，如钛酸钡玻璃微球透镜等能够实现超分辨率观测的微球透镜。

本实用新型的近场光学成像原理与一般显微镜的远场光学成像原理不同，如图2所示，本实用新型利用光照射到样品4的表面形成的倏逝波(隐失波)来进行成像，通过检测倏逝波分量就可以实现物体的亚波长成像。微球透镜2及样品4通过光学反光镜1形成微球透镜镜像21及样品表面镜像41，把微球透镜 2靠近样品4的表面，倏逝波会被吸收转化为传播波并向远处传播，样品4的倏逝波转化为传播波后，经微球透镜2折射和光学反光镜1的反射，被光学倒置显微镜6的物镜61采集并聚焦，如果光学倒置显微镜6的物镜61的焦平面正好落在超分辨率的虚像的镜像位置42，则可以在光学倒置显微镜中观测到样品 4表面的超分辨率虚像成像43。

下面以观察蓝光DVD光学超分辨率图像为例，来详细描述本实用新型所述的一种基于微球透镜和倒置显微镜的光学超分辨率系统的动态成像方法，其步骤包括：调整微球透镜2和原子力显微镜扫描探针3的位置到光学倒置显微镜6 的视野内，并调整到最清晰的位置，然后，利用位移台7的移动来调整原子力显微镜扫描探针3的位置，使得原子力显微镜扫描探针3的针尖32逐渐逼近样品4，使微球透镜2与样品4轻微接触或保持间距在纳米至微米尺度，这时，通过光学倒置显微镜6的显示器来观测微球透镜2内是否有清晰的纳米尺度形貌图像，如果没有，则需要对光学倒置显微镜6进行重新调节，将光学倒置显微镜6的工作平面聚焦到微球透镜2的虚像像平面上，从而获得清晰图像，图4 是利用上述方法获得的蓝光DVD光学超分辨率图像。在实际工作过程中，通过控制位移台7和/或样品台5的移动来控制微球透镜2与样品4之间的相对运动，光学倒置显微镜6对微球透镜2显示的超分辨率图像进行实时数据采集成像，获得动态超分辨率视觉图像，并将这些动态超分辨率视觉图像传送至作为上位机的计算机中。

综上所述，仅为本实用新型的较佳实施例而已，并非用来限定本实用新型实施的范围，凡依本实用新型权利要求范围所述的形状、构造、特征及精神所作的均等变化与修饰，均应包括在本实用新型的权利要求范围内。