用于对样本进行显微分析的系统和方法与流程

本说明书涉及用于对样本进行显微分析的系统和方法，并且特别涉及对生物组织(特别而言，皮肤)进行显微分析的系统和方法。

背景技术：

1、特别是在皮肤病学检查的背景下，已知可进行皮肤镜检查(也就是说使用放大光学仪器观察皮肤表面)，然后可根据在通过皮肤镜检查获得的宽场图像上进行的观察来进行局部显微分析。

2、显微分析包括例如显微成像或光谱分析。

3、在成像技术中，特别地并且以非限制性方式已知共聚焦显微术，例如rajadhyaksha等人的文章[参考文献1]或k.等人的文章[参考文献2]中描述的关于非线性显微术的技术。光学相干断层摄影显微术(ocm)(在时域中(时域ocm)或在频域中(频域ocm))的技术也是已知的。已知的ocm技术包括将光学相干断层摄影和共聚焦显微术进行组合以便提高横向分辨率的技术(参见例如schmitt等人的文章[参考文献3])。

4、更具体而言，专利申请第wo2015092019号[参考文献4]描述了一种使布置在显微镜物镜的焦点处的半透明物体(例如生物组织)的内部结构可视化的技术，以便以高速率(每秒几个截面)获得具有高空间分辨率(也就是说，轴向和横向均为1μm的量级)以及毫米量级的令人满意的穿透深度的垂直截面或b扫描，该垂直截面或b扫描与物体表面正交。该技术基于光学相干显微术，但具有线性或一维(在一个方向上)的共聚焦过滤配置。为此，照明线特别地通过显微镜物镜与线性检测器光学共轭，线性检测器的检测区域的宽度与该线的图像的宽度基本相等，从而对待观察物体的区域进行空间过滤。因此，这样的技术被称为线场共聚焦光学相干断层摄影(lc-oct)。

5、y.chen等人的文章[参考文献5]也提出了一种线扫描光学相干断层摄影显微设备，但是在该设备中，样本在垂直于显微镜物镜的光轴的平面中以垂直于照明线的方向移动，使得可以形成样本的正面(en-face)图像(或c扫描)。

6、在用于对样本(特别是诸如皮肤之类的生物组织)进行光谱分析的技术中，例如并且以非限制性的方式已知拉曼光谱技术，其使得可以形成生物组织的分子指纹，正如在schleusener等人的文章[参考文献6]中所描述的。e.drakaki等人的综述文章[参考文献7]概括介绍了应用于皮肤的显微分析的不同光谱技术。

7、无论是用于成像还是用于光谱分析，上述所有的显微分析技术都使用具有相当大的标称数值孔径的显微镜物镜，对于给定的视场(通常在约0.2mm和约1.5mm之间)，该标称数值孔径通常大于或等于0.5。

8、在实践中，为了在显微分析期间获得相关信息，从业者在显微分析期间找到在皮肤镜检查期间获得的图像中对他来说似乎可疑的区域是重要的。

9、然而，在显微分析中精确地找到在皮肤镜检查中已经识别出的可疑区域是一件复杂的事情，因为可以依赖用于瞄准的图像是在比皮肤镜检查小得多的场中获得的，并且这些图像具有非常不同的外观。在显微分析不产生图像的情况下(例如在拉曼显微光谱技术中)，这甚至更关键。

10、已经提出了不同的解决方案来允许从业者在皮肤镜图像上识别用于显微分析的分析场。

11、例如，专利申请第wo2017139712号[参考文献8]描述了一种将共聚焦显微术(或反射共聚焦显微术(rcm))与宽场皮肤镜(wfd)进行组合的系统。为此，将微型摄像头直接集成在显微镜物镜中，以便在宽场反射中形成表面图像。然而，这样的系统制造和集成都较复杂。此外，微型摄像头获得的图像质量较差。

12、专利第us7864996号[参考文献9]描述了一种与皮肤镜耦合的共聚焦成像系统。皮肤镜安装在固定于皮肤的模块上，使得可以对与共聚焦显微镜相同的区域进行成像，共聚焦显微镜可被固定在相同的模块上。进行皮肤镜图像(或“宏观”图像)的获取，然后获取共聚焦图像。在图像之间进行精确的相关，以便在皮肤镜图像上表示由共聚焦成像系统形成的图像的位置。然而，如此描述的系统需要用于固定两个单独探头的附加模块，并且该模块可能难以固定在皮肤上的任何位置。此外，必须遵循复杂的程序来获取图像，以便获得皮肤镜图像和共聚焦图像的相关性。

13、在拉曼显微光谱技术的情况下，z.wu等人的文章[参考文献10]描述了如何通过反射共聚焦显微术并使用单个激光源来获取和定位组织中的显微拉曼信号。然而，对于从业者而言，共聚焦图像比皮肤镜图像更不容易用作参考图像。

14、本说明书提出了显微分析设备和方法，其允许用户通过简单的获取方法在宽场表面反射图像中精确地定位显微分析场，其中图像质量接近皮肤镜图像的质量。

技术实现思路

1、在本说明书中，术语“包括”与“包含”、“含有”表示相同的含义，是包含性的或开放性的，并且不排除未描述或未示出的其它元素。此外，在本说明书中，术语“约”或“基本上”与相应值的10％(例如5％)的上裕度或/或下裕度同义(表示相同的含义)。

2、根据第一方面，本说明书涉及一种用于对样本进行显微分析的系统，该系统包括：

3、-显微分析路径，该显微分析路径包括：

4、-在给定的视场中具有给定的标称数值孔径的显微镜物镜；

5、-照明路径，该照明路径被配置为根据第一照明图案并且以第一光谱带通过所述显微镜物镜对所述样本进行照明；

6、-包括所述显微镜物镜的检测路径，所述检测路径被配置为在所述视场中根据检测图案检测由所述样本响应于对所述样本的照明而发射的光束，并且生成检测信号；

7、-处理单元，该处理单元被配置为从所述检测信号生成关于对所述样本的显微分析的信息；

8、-瞄准路径，该瞄准路径包括：

9、-所述显微镜物镜；

10、-全场照明设备，该全场照明设备被配置成以第二光谱带对所述样本进行照明；

11、-二维检测器；

12、-一个或多个成像元件，该一个或多个成像元件与所述显微镜物镜一起形成全场成像设备，该全场成像设备被配置为使所述样本的包围所述视场的给定有效场与所述二维检测器的检测区域光学共轭，并且在所述有效场的表面反射中形成瞄准图像；

13、-分束器元件，该分束器元件被布置在显微镜物镜的上游，以便分离所述显微分析路径和所述瞄准路径；

14、-显示模块，该显示模块被配置为示出所述瞄准图像，并且在所述瞄准图像上示出指示所述检测图案的位置的图像元素。

15、在本说明书中，术语显微镜物镜的“视场”指的是显微镜物镜的焦平面的区域，其位于制造商保证标称数值孔径的物空间(样本空间)中。标称数值孔径例如在约0.1和约1.4之间，例如在约0.5和约0.9之间。所述视场可以由直径在约100μm和约5mm之间、例如在约500μm和约1.5mm之间的圆来定义。

16、术语显微镜物镜的“有效场”是物空间(样本空间)中包括在显微镜物镜的总场中的场，其包围所述视场并且其尺寸由所述瞄准路径的所述全场成像设备限制。所述有效场可以由直径在约1mm和约10mm之间、例如在约2mm和约5mm之间的圆来定义。

17、在本说明书中，所述照明图案取决于所述显微分析路径的照明路径，并且可以包括照明点、照明线或照明表面(例如由照明点或照明线的扫描产生的矩形表面。将照明点更精确地定义为由通过所述显微分析路径的显微镜物镜对入射到所述物镜上的准直光束进行聚焦而产生的衍射图案。在全场显微分析路径的情况下，所述照明图案还可以包括不是由扫描产生的照明表面，例如具有圆形几何形状的表面。所述样本响应于对所述样本的照明而发射的光束可以是反射光束、反向散射光束、或以另一波长的发射过程产生的光束(例如荧光、拉曼散射等)。

18、此外，所述检测图案被包括在所述视场中，并且被包括在所述照明图案中或者与其具有相同的数量级，并且所述检测图案取决于所述显微分析路径的检测路径。检测图案可以包括检测点、检测线或检测表面(例如由线的扫描产生的矩形表面，或者在全场显微分析路径的情况下，与检测器的检测区域光学共轭的表面)。检测点在此通过与所述显微分析路径的检测路径的检测器的基本检测器光学共轭的基本区域在所述物空间中定义。

19、申请人已经表明，根据第一方面的用于对样本进行显微分析的系统使得用户能够在宽场表面反射图像或“瞄准图像”中精确地定位显微分析场。由于所述瞄准路径被移开的事实，所述宽场表面反射图像可以呈现出接近皮肤镜图像质量的图像质量。然而，与需要两个探头的现有技术的系统(例如[参考文献9])相比，所述系统保持非常好的紧凑性。

20、根据一个或多个示例性实施例，所述瞄准路径的全场成像设备在所述显微镜物镜的物空间中具有严格低于所述显微镜物镜的标称数值孔径的数值孔径。然后，所述瞄准路径可以在限制像差和潜在渐晕的同时受益于大于所述视场的有效场，同时保持形成所述全场成像设备的成像元件的有限尺寸。因此，进一步提高了所述瞄准图像的质量。

21、根据一个或多个示例性实施例，所述瞄准路径还包括光阑，该光阑使得可以限制所述全场成像设备的数值孔径。根据其它示例性实施例，直接将形成所述全场成像设备的所述成像元件中的一个配置为另外形成用于限制所述全场成像设备的数值孔径的光阑。

22、根据一个或多个示例性实施例，所述瞄准路径的全场成像设备的聚焦是可调节的。这使得即使在所述显微分析路径的成像深入所述样本的情况下(例如ocm成像的情况)，也可以在所述样本的表面反射中形成瞄准图像。

23、根据一个或多个示例性实施例，所述瞄准路径的全场照明设备包括多个光源，所述多个光源被布置在所述显微镜物镜的远端面(即显微镜物镜的在样本空间中的面)的周围。该配置允许对所述样本进行直接照明。或者，所述瞄准路径的全场照明设备可以包括被布置在所述显微镜物镜和分束器元件(例如分光立方体)上游的光源，该分束器元件被配置为将照明光束通过所述显微镜物镜引导向所述样本。

24、根据一个或多个示例性实施例，所述第二光谱带至少部分地不同于所述第一光谱带，并且所述瞄准路径包括用于降低至少所述第一光谱带中的光功率的装置。实际上，在一些情况下，所述显微分析路径的照明路径中对所述样本的照明光束可能具有足够强的光功率以对所述瞄准路径的检测器产生眩光。通过降低至少所述第一光谱带中的光功率，限制了这种眩光的风险。

25、根据一个或多个示例性实施例，所述第二光谱带至少部分地不同于所述第一光谱带，并且所述分束器元件包括二向色板或二向色立方体，该二向色板或二向色立方体被配置为分离所述第一和第二光谱带中的每一个光谱带的光束。然后，所述二向色板形成用于降低所述第一光谱带中的光功率的装置。根据一个或多个示例性实施例，所述显微分析路径包括用于扫描对所述样本的照明光束以及由所述样本响应于对所述样本的照明而发射的光束的设备，并且所述分束器元件形成扫描设备的一部分。

26、根据一个或多个示例性实施例，指示所述检测图案的位置的所述图像元素包括通过预先校准确定的图形元素。该配置尤其在照明图案未被所述瞄准路径的检测器检测到(例如因为所述瞄准路径的检测器对所述第一光谱带不敏感或者因为所述瞄准路径中的第一光谱带被切断以限制眩光)的情况下特别有利。在所述照明图案难以在所述瞄准图像中识别的情况下，或者如果所述检测图案与所述照明图案基本不同，则该配置也是有利的。

27、根据一个或多个示例性实施例，所述显微分析路径是共聚焦和/或光学相干断层成像路径，并且关于对所述样本的显微分析的所述信息包括所述样本的至少一个图像。例如，所述显微分析路径是如现有技术中所描述的光学相干断层成像路径，并且被配置为形成样本的b扫描、c扫描(或正面图像)或样本的3d图像。以已知的方式，所述样本的被称为b扫描的截面图像是在平行于所述显微镜物镜的光轴的平面中形成的图像。所述样本的被称为c扫描或正面图像的截面图像是在垂直于所述显微镜物镜的光轴的平面中形成的图像，所述样本的3d图像由多个b扫描图像或c扫描图像的获取产生，因此允许在体积中对样本进行分析。

28、根据一个或多个示例性实施例，所述显微分析路径是光谱分析路径，并且关于对所述样本的显微分析的所述信息包括由所述样本在所述样本的至少一个点处发射的所述光束的至少一个光谱。

29、根据第二方面，本说明书涉及一种用于对样本进行分析的方法，该方法包括：

30、-通过显微分析路径对所述样本进行显微分析，所述显微分析路径包括在给定的视场中具有给定的标称数值孔径的显微镜物镜，所述显微分析包括：

31、-根据第一给定照明图案并且以第一光谱带通过所述显微镜物镜对所述样本进行照明；

32、-在所述视场中根据检测图案检测由所述样本响应于对所述样本的所述照明而发射的光束，以便形成检测信号；

33、-处理所述检测信号，以便生成关于对所述样本的显微分析的信息；

34、-通过瞄准路径在所述样本的包围所述视场的给定有效场的表面反射中形成瞄准图像，所述瞄准路径包括所述显微镜物镜、二维检测器、一个或多个成像元件，该一个或多个成像元件被配置为与所述显微镜物镜一起形成全场成像设备，所述瞄准图像的形成包括：

35、-以第二光谱带对所述样本进行全场照明；

36、-通过所述全场成像设备使所述样本的有效场与所述二维检测器的检测区域光学共轭，以便形成所述瞄准图像；

37、-显示所述瞄准图像，并且在所述瞄准图像上显示指示所述检测图案的位置的图像元素。

38、根据一个或多个示例性实施例，连续地进行对所述样本的显微分析和瞄准图像的形成，这意味着在使用显微分析系统的情况下，分析路径和瞄准路径的照明源都处于运行中。特别是在所述显微分析路径中对所述样本的照明光束在所述瞄准路径中不可见或衰减很大的情况下，或者更一般地在所述显微分析路径中对所述样本的照明光束不干扰所述瞄准图像的获取的情况下，该配置是可能的。

39、根据一个或多个示例性实施例，根据第一方面的用于分析样本的方法包括：

40、-第一步骤，在不对所述显微分析路径进行照明的情况下形成所述样本的瞄准图像，

41、-在所述样本的所述瞄准图像中检测感兴趣的分析区域，并且

42、-在所述感兴趣的分析区域中对所述样本进行显微分析。

43、特别是在所述显微分析路径中对所述样本的照明光束可能干扰所述瞄准路径中的检测，但所述瞄准路径中对所述样本的照明不干扰所述显微分析路径中的检测的情况下，该配置是令人感兴趣的。

44、如果在所述瞄准路径中对所述样本的照明干扰了所述显微分析路径中的检测，则还可以在对所述样本的显微分析期间关闭所述瞄准路径的照明。在这种情况下，接连进行对所述样本的显微分析和所述瞄准图像的形成。

45、根据一个或多个示例性实施例，对所述样本的显微分析包括所述样本的共聚焦和/或光学相干断层成像，使得可以形成所述样本的b扫描、c扫描或3d图像。

46、根据一个或多个示例性实施例，所述方法还包括显示所述b扫描图像和c扫描图像中的至少一种，和/或在形成3d图像的情况下，显示从3d图像提取的所述b扫描图像和c扫描图像中的至少一种。

47、例如，对所述样本的显微分析包括以给定成像速率形成b扫描图像，并且所述成像速率与瞄准图像的获取速率同步。由于b扫描图像的获取可能需要例如通过所述显微镜物镜的轴向位移来扫描所述样本深处的照明光束，所以所述同步确保了以所述显微镜物镜相对于所述样本表面的相同位置来获取所述瞄准图像。

48、根据一个或多个示例性实施例，对所述样本的显微分析包括所述样本的光谱分析。

49、根据一个或多个示例性实施例，根据第二方面的方法包括预先校准步骤，该预先校准步骤使得可以针对所述图像元素确定指示所述检测图案的位置的图形元素。

50、根据一个或多个示例性实施例，根据第二方面的方法还包括显示叠加在瞄准图像的所述图像元素上的标记，所述标记使得用户能够在检测图案中瞄准感兴趣的点。因此，在某些实施例中，用户能够将标记定位在所述图像元素上，以便在所述标记的层面在所述样本中获得微观分析信息。在某些示例性实施例中，用户还能够在显微分析信息的层面选择感兴趣的点，并且在所述图像元素的相应位置处看到标记位置本身。因此，例如，在对所述样本的显微分析包括形成所述样本的b扫描和/或c扫描图像的情况下，用户将能够例如通过十字线瞄准与所述瞄准图像同时显示的所述图像之一中的点，并且将能够看到所述瞄准图像上的标记位置本身，所述标记对应于所瞄准的点在所述样本表面上的投影。用户还将能够在瞄准图像上定位所述标记，并且在与标记的位置相对应的位置看到十字线自身在所述图像之一上的位置。

51、根据一个或多个示例性实施例，所述样本是生物组织，例如皮肤。