一种单物镜光片的共轴成像系统及方法

1.本发明属于显微成像技术领域，更具体地，涉及一种单物镜光片的共轴成像系统及方法。


背景技术：

2.荧光显微成像是一类对特定样本使用荧光蛋白或分子标记后对其标记物成像的光学显微成像技术，因其特异性标记及高灵敏度高对比度的成像，而被广泛应用于生物与医药领域。相比于普通的光学显微镜，荧光显微镜能够对样本中我们感兴趣的特征或结构进行特异性标记并实时追踪涉及这些特征或结构的动态过程。
3.光片荧光显微镜是一个全新的荧光显微镜，其通过照明光束通过柱面镜或高斯光束的模式产生一层光束薄片从样品的侧面照射样品。这种片状侧向照明方式，激发面积较大且为荧光探测感光面，成像速度较快，同时，光片也尽可能将照明限制在探测器聚焦平面，只有焦面附近的荧光物质才会被激发，减少了非焦面荧光信号的干扰，提高了成像层切能力和纵向分辨率，降低了对样本的光毒性和光漂白性，对生命科学的研究具有重要意义。
4.在传统模态下的光片显微镜下，通常需要垂直排列两个物镜，一个用于激发照明样本，一个用于接收探测荧光，这种排列布局限制了能够定位和观测的样本种类，同时为防止两个物镜发生碰撞，需使用工作距离较长的低倍物镜，不适合na值高的高倍物镜。因此提出了一种创新性的设备设计，即采用一个物镜同时照明和探测，也就是单物镜光片显微镜。
5.单物镜光片使用同一物镜形成光片和探测荧光。入射光从第一物镜后瞳边缘入射，倾斜照亮样品，倾角为θ，并用同一物镜收集荧光信号。由于激发光轴和探测光轴不相互正交，光片激发的倾斜平面上的信息通过物镜成像后的平面也是倾斜平面。为了得到高分辨率的无像差图像，需要用对倾斜的像进行矫正。选用另一物镜即第二物镜，将第一物镜与第二物镜及中间的透镜共轴排列，将倾斜的光片照明平面完美共轭到第二枚物镜的焦面处，采用第三物镜，与第二物镜的光轴成光片倾斜角θ，使得第三物镜的焦面与光片的激发平面重合，从而矫正倾斜的像，使得物面信息被第三枚物镜的收集成像在相机平面上。
6.对于中低倍(10倍以下)的应用场景，由于第三物镜数值孔径的限制，其倾斜设置实现垂直探测的同时损失了一定的收光角，从而造成了横向分辨率的损失。


技术实现要素：

7.针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种单物镜光片的共轴成像系统及方法，其目的在于配合明光片瑞利范围和第三物镜的景深范围设置，使第二物镜和第三物镜得以共轴设置，实现完全收光提横向分辨率的同时，解除了对第一物镜na值的范围限制，拓宽了成像系统整体适用范围，并且方便的实现第三物镜的原位变倍，由此解决现有技术由于采用斜置的第三物镜导致第一物镜只能采用大na的物镜、收光角度优先导致横向分辨率损失的技术问题。
8.为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种单物镜光片的共轴成像系
统，其包括第一物镜、光片照明光路、成像光路、以及载样台；
9.所述光片照明光路产生照明光片，从沿所述第一物镜的后瞳边缘入射，照射在载样台承载的样品上；激发的荧光被所述第一物镜收集进入成像光路；
10.所述成像光路，包括同轴设置的第二物镜与第三物镜，所述第二物镜与第一物镜共轭；
11.所述照明光片瑞利范围的荧光经第二物镜的所成的像落入第三物镜的景深范围。
12.优选地，所述单物镜光片的共轴成像系统，其所述照明光片为高斯光片或贝塞尔光片，优选为轴向扫描的光片。
13.优选地，所述单物镜光片的共轴成像系统，其所述照明光片为轴向扫描高斯光片，所述照明光路包括普通高斯光片产生模块及轴向扫描部件；为与所述高斯光片产生模块连接的运动机构，所述运动机构带动所述高斯光片产生模块在高斯光片轴向往复运动实现轴向扫描；或为改变光程的具有运动机构的光学器件，优选为转盘透镜、振镜、或远程扫描反射镜
14.优选地，所述单物镜光片的共轴成像系统，其所述第三物镜为深景深镜头组件；
15.包括沿光路依次设置的物镜镜头和轴棱镜；
16.或包括物镜镜头和位移台；所述位移台带动所述物镜镜头沿第三物镜光轴往复运动。
17.优选地，所述单物镜光片的共轴成像系统，其所述照明光片为贝塞尔光片；所述第三物镜为深景深镜头组件，包括沿光路依次设置的物镜镜头和轴棱镜。
18.优选地，所述单物镜光片的共轴成像系统，其所述照明光片为轴向扫描高斯光片，所述第三物镜为深景深镜头组件，包括物镜镜头和位移台；所述位移台带动所述物镜镜头沿第三物镜光轴往复运动；所述第三物镜镜头与所述轴向扫描高斯光片的瑞利范围同步运动。
19.优选地，所述单物镜光片的共轴成像系统，其所述成像光路包括相机，所述相机逐行曝光成像，其逐行曝光与所述第三物镜镜头运动同步，逐行记录光片瑞利范围所激发的荧光信号；按照所述轴向扫描高斯光片瑞利范围的运动，使所述相机逐行曝光获得样品在所述高斯光片切面的荧光信号图像。
20.优选地，所述单物镜光片的共轴成像系统，其所述第三物镜包括多个放大倍数不同的齐焦镜头，所述多个齐焦镜头原位置换实现变倍。
21.优选地，所述单物镜光片的共轴成像系统，其所述载样台在水平面内运动。
22.按照本发明的另一个方面，提供了应用所述的单物镜光片的共轴成像系统的成像方法，包括以下步骤：
23.所述照明光片为轴向扫描光片；并且
24.所述第三物镜镜头与所述轴向扫描高斯光片的瑞利范围同步运动和/或所述相机逐行曝光成像，其逐行曝光与所述第三物镜镜头运动同步，逐行记录光片瑞利范围所激发的荧光信号；
25.使所述相机逐行曝光获得样品在所述高斯光片切面的荧光信号图像。
26.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
27.本发明提供的单物镜光片的共轴成像系统，采用共轴设置的第二物镜关于第三物镜，呈对射状态，不仅收光角完整，避免了横向分辨率损失；而且解除了对第一物镜na值的限制；同时可以通过切换第三物镜方便的实现原位变倍。
附图说明
28.图1是本发明实施例1提供的光路结构示意图；
29.图2是本发明实施例2提供的光路结构示意图；
30.图3是本发明实施例3提供的光路结构示意图；
31.图4是本发明实施例4提供的光路结构示意图。
具体实施方式
32.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
33.一种单物镜光片的共轴成像系统，包括：光片照明光路、照明探测复用光路、成像光路以及样本载样台；所述光片照明光路产生照明光片，从沿所述第一物镜的后瞳边缘入射，照射在载样台承载的样品上；激发的荧光被所述第一物镜收集进入成像光路；所述载样台在水平面内运动。
34.所述照明探测复用光路，包括第一物镜；第一物镜的na优选0.25-1.3。一般来说单物镜光片由于成像光路的第二物镜和第三物镜斜对，若na较小，则可能造成第三物镜无法收光，故适用的第一物镜na值较大，第一物镜na值适用范围较窄。本发明由于第二物镜和第三物镜共轴设置，形成对射状态，完全收光，故第一物镜na值选择不受限制，可根据最终需要产生光片的瑞利范围选择，第一物镜na值适用范围宽泛，适合各种光片照明光路产生的照明光片。但由于最终光片倾斜打入样品，为获得尽量大的倾角从而投影面获得更多的信息，在满足光片性能参数的情况下可选择较大na值的物镜。
35.所述照明光片为轴向的扫描高斯光片或贝塞尔光片。
36.当所述照明感光片为轴向扫描高斯光片时，所述照明光路包括高斯光片产生模块及轴向扫描部件，所述轴向扫描部件用于改变高斯光片瑞利范围在轴向上的位置，轴向扫描部件的形式不受限制，可以为与所述高斯光片产生模块连接的运动机构，所述运动机构带动所述高斯光片产生模块在高斯光片轴向往复运动实现轴向扫描；也可以为改变光程的具有运动机构的光学器件，包括转盘透镜、振镜、远程扫描反射镜等。
37.当所述照明感光片为贝塞尔光片时，瑞利范围一次性可覆盖至数百微米，对于目前的视场要求，无需进行对激发光片进行轴向扫描，当然也可以兼容轴向扫描的贝塞尔光片。其中所述贝塞尔光片可为采用掩膜生成的静态贝塞尔光片、或采用贝塞尔光束扫描形成的动态贝塞尔光片等。
38.所述成像光路，包括同轴设置的第二物镜与第三物镜，所述第二物镜与第一物镜共轭；所述照明光片瑞利范围的荧光经第二物镜的所成的像落入第三物镜的景深范围。在第二物镜与第三物镜同轴对射的模态下，第三物镜固有的景深即可探测到一个投影像。此
时，若照明光片的瑞利范围足够长，那么，在扩展第三物镜景深的情况下就可以探测到一个大范围的清晰投影像。与原有单物镜成像系统倾斜摆放第三物镜相比，第二物镜与第三物镜同轴对射不但可以实现完全利用第三物镜的na，不损失横向分辨率，而且大大降低了实际系统搭建的复杂性，节省了空间。不仅如此，在对射的状态下只需更换第三物镜即可实现系统的原位倍率切换，无需根据第三物镜na再次调整光路，故倍率切换便捷。虽然对射状态下的第二物镜和第三物镜会造成一定程度的信号折叠，但由于荧光信号的稀疏性，故在单物镜光片荧光显微成像系统中，共轴设置的第二物镜和第三物镜几乎不会损失有效信息。
39.故优选方案，所述第三物镜为深景深镜头组件；
40.在一些具体实施例中，所述深景深镜头组件包括沿光路依次共轴设置的物镜镜头和轴棱镜；所述轴棱镜扩展用于第三物镜的探测景深。
41.在一些具体实施例中，所述深景深镜头组件或包括物镜镜头和位移台；所述位移台带动所述物镜镜头沿第三物镜光轴往复运动。
42.在一些具体的实施例中，所述照明光片为贝塞尔光片；所述第三物镜为深景深镜头组件，包括沿光路依次设置的物镜镜头和轴棱镜。
43.在一些具体的实施例中，所述照明光片为轴向扫描高斯光片，所述第三物镜为深景深镜头组件，包括物镜镜头和位移台；所述位移台带动所述物镜镜头沿第三物镜光轴往复运动；所述第三物镜镜头与所述轴向扫描高斯光片的瑞利范围同步运动。这种方案中，单个平面图像有更高的对比度和信噪比，获得的三维图像有均匀的轴向分辨率，优选配合逐行曝光成像。即设置在成像光路的相机逐行曝光成像，其逐行曝光与所述第三物镜镜头运动同步，逐行记录光片瑞利范围所激发的荧光信号；按照所述轴向扫描高斯光片瑞利范围的运动，使所述相机逐行曝光获得样品在所述高斯光片切面的荧光信号图像。
44.本发明提供的单物镜光片的共轴成像方法，包括以下步骤：
45.所述照明光片为轴向扫描光片；并且
46.所述第三物镜镜头与所述轴向扫描高斯光片的瑞利范围同步运动和/或所述相机逐行曝光成像，其逐行曝光与所述第三物镜镜头运动同步，逐行记录光片瑞利范围所激发的荧光信号；
47.使所述相机逐行曝光获得样品在所述高斯光片切面的荧光信号图像。该方式单个平面图像有更高的对比度和信噪比，获得的三维图像有均匀的轴向分辨率。
48.以下为实施例：
49.实施例1贝塞尔光片照明配合轴棱镜扩展景深探测
50.本实施例提供的单物镜光片的共轴成像系统，如图1所示，包括光片照明光路、照明探测复用光路、成像光路以及样本载样台；
51.所述光片照明光路，包括依次设置的贝塞尔光片产生模块a1或a2；
52.照明探测复用光路为：激发探测复用光路b；
53.成像光路为：对射探测景深扩展模块c；
54.载样台为样本装载模块d。
55.贝塞尔光片产生模块a1：激光器1发出激光，经准直器进行准直后平行射出。通过柱面镜2、柱面镜3形成高斯光片并在光高维度上进行整形，经反射镜4反射后通过柱面镜5、柱面镜6对光片厚度的维度进行整形，再经过柱面镜7到达贝塞尔掩膜8处，形成静态贝塞尔
光片。
56.贝塞尔光片产生模块a2：激光器1发出激光，经准直器进行准直后平行射出。通过扩束器2进行扩束，经反射镜3反射后入射到轴棱镜4上，出射为贝塞尔光束，经消色差双胶合透镜5后平行入射在振镜6上，通过振镜6高速扫描形成动态贝塞尔光片，经扫描透镜7后出射平行光。
57.激发探测复用光路：形成的贝塞尔光片经过二向色镜9的反射，通过共轭校正透镜组10、11，再由反射镜12反射到达照明物镜13。其中，通过水平方向一维移动反射镜4位置使得照明光片照射在物镜13后瞳边缘位置，再通过物镜13形成最终的光片。光片参数由柱面镜2、3、5、6、7、透镜组10、11、光入射到物镜13后瞳位置以及物镜13的参数共同决定。光片相对于物镜13光轴的倾斜角度大致约为物镜13的收光角。产生的荧光通过照明物镜13，经反射镜12反射后，通过透镜组11、10，透过二向色镜9，经过物镜14形成与光片平面共轭的中间像面。激光波长小于荧光波长，所以二向色镜9选取长通短反型(透射长波长光，反射短波长光)；共轭校正透镜组11、10分别共轭校正物镜13、14，是与物镜13、14的参数适配的管透镜，最终满足完美成像要求(物平面到共轭校正物镜14后焦面的放大倍率满足物空间和共轭校正物镜14所在空间的折射率比值)。
58.对射探测景深扩展模块：物镜15与物镜14对射，实现共轴探测，经管透镜16到达轴棱镜17后，实现了景深的扩展，最终成像在相机18上。
59.样本装载模块：三维位移台移动样本以实现三维体积成像。
60.实施例2：轴向扫描高斯光片照明配合第三物镜轴向扫描探测
61.本实施例提供的单物镜光片的共轴成像系统，如图2所示，包括光片照明光路、照明探测复用光路、成像光路以及样本载样台；
62.所述光片照明光路，包括轴向扫描光片产生模块a3或a4或a5；
63.照明探测复用光路为：激发探测复用光路b；
64.成像光路为：对射轴向扫描探测模块c
65.载样台为样本装载模块d。
66.轴向扫描光片产生模块a3：激光器1发出激光，经准直器进行准直后平行射出。通过柱面镜2、柱面镜3形成高斯光片并在光高维度上进行整形，经反射镜4反射后通过柱面镜5、柱面镜6对光片厚度的维度进行整形，再通过共轭消色差双胶合透镜组7、8后入射在偏振分束器9上，经偏振分束器9反射后通过消色差四分之一波延迟器10，再经振镜11、扫描透镜12、管透镜13、物镜14入射在反射镜15上。通过振镜11的高速扫描改变光入射在物镜14的角度，从而使物镜14产生的焦点横向移动，再经反射镜15反射回物镜14，依次通过管透镜13、扫描透镜12，经过振镜11解扫描，通过消色差四分之一波延迟器10后透射过偏振分束器9，再经过柱面镜16形成轴向扫描高斯光片。通过轴向扫描模块使得光片的瑞利范围在光片光轴方向实现移动，从而在保证轴向分辨率的同时扩大成像视野。
67.轴向扫描光片产生模块a4：激光器1发出激光，经准直器进行准直后平行射出。通过柱面镜2、柱面镜3形成高斯光片并在光高维度上进行整形，经反射镜4反射后通过柱面镜5、柱面镜6对光片厚度的维度进行整形，再通过共轭消色差双胶合透镜组7、8后入射在偏振分束器9上，经偏振分束器9反射后通过消色差四分之一波延迟器10，经物镜11会聚后入射在y压电陶瓷反射镜12上。经反射镜12反射回物镜11、消色差四分之一波延迟器10，透射过
偏振分束器9，再经过柱面镜13形成轴向扫描高斯光片。
68.轴向扫描光片产生模块a5：激光器1发出激光，经准直器进行准直后平行射出。通过柱面镜2、柱面镜3形成高斯光片并在光高维度上进行整形，经反射镜4反射后通过柱面镜5、柱面镜6对光片厚度的维度进行整形；之后通过轴向扫描部件，包括消色差双胶合透镜组7、9以及梯度变化的转盘透镜8；再经过柱面镜10形成轴向扫描高斯光片。
69.激发探测复用光路：形成的轴向扫描高斯光片经过二向色镜17的反射，通过共轭校正透镜组18、19，再由反射镜20反射到达照明物镜21。其中，通过水平方向一维移动反射镜4位置使得照明光片照射在物镜21后瞳边缘位置，再通过物镜21形成最终的光片。光片相对于物镜21光轴的倾斜角度大致约为物镜21的收光角。产生的荧光通过照明物镜21，经反射镜20反射后，通过透镜组19、18，透过二向色镜17，经过物镜22形成与光片平面共轭的中间像面。
70.对射轴向扫描探测模块：经物镜22产生的中间像面通过物镜23、管透镜24，最终成像在相机上25。其中，物镜23放置在压电位移台上，其移动频率与照明光路中的轴向扫描装置同步，以保证轴向扫描过程中光片平面始终与物镜23的焦平面重合；相机的行曝光也需与压电位移台等轴向扫描装置同步。
71.获取样本三维信息方法与实施例一相同。
72.实施例3贝塞尔光片照明配合第三物镜轴向扫描探测
73.本实施例提供的单物镜光片的共轴成像系统，如图3所示，与实施例1类似，包括光片照明光路、照明探测复用光路、成像光路以及样本载样台；
74.包括所述光片照明光路，包括依次设置的贝塞尔光片产生模块a1或a2；
75.照明探测复用光路为：激发探测复用光路b；
76.成像光路为：对射轴向扫描探测模块c
77.载样台为样本装载模块d。
78.与实施例1不同之处在于对射轴向扫描探测模块，经物镜14产生的中间像面通过物镜15、管透镜16，最终成像在相机上。其中，物镜15放置在压电位移台上，其移动频率与照明光路中的轴向扫描装置同步，同时配合相机的逐行曝光进行成像。
79.获取样本三维信息方法与实施例一相同。
80.实施例4：轴向扫描高斯光片照明配合轴棱镜扩展景深探测
81.本实施例提供的单物镜光片的共轴成像系统，如图4所示，与实施例2类似，包括光片照明光路、照明探测复用光路、成像光路以及样本载样台；
82.所述光片照明光路，包括轴向扫描光片产生模块a3或a4或a5；
83.照明探测复用光路为：激发探测复用光路b
84.成像光路为：对射探测景深扩展模块c
85.载样台为样本装载模块d。
86.与实施例2不同之处在于对射探测景深扩展模块，经物镜22产生的中间像面通过了物镜23、管透镜24，轴棱镜25实现了景深的扩展，最终成像在相机26上。
87.获取样本三维信息方法与实施例一相同。
88.本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含
在本发明的保护范围之内。