大深度双光子三维超分辨成像系统及方法

本发明涉及光学显微镜成像的，尤其是指一种大深度双光子三维超分辨成像系统及方法。

背景技术：

1、光学显微镜具有非侵入性和高分辨率等特点，非常适合于活体生物成像。然而，生物体中许多重要的结构和功能信息都位于深层组织内部。此外，光在传播过程中存在衍射现象，尤其在生物组织内部传播过程中会发生强烈的散射，导致激发和发射光信号随着成像深度的增加迅速衰减，极大地阻碍人类对生物体内部世界的探索。因此，对深层生物组织进行高质量成像并获取有效的结构和功能信息，是当前生物医学光子学研究的热点和难点。

2、双光子显微成像技术(two-photon microscopy,tpm)采用非线性光学效应，即一个基态荧光分子同时吸收两个光子后跃迁到激发态，然后返回基态并释放出荧光信号。双光子显微成像采用长波长激发，具有高信噪比和大穿透深度(几百微米)的优势，已成为现代生物医学研究领域的重要技术支撑。然而，长波长的使用和组织中强散射的存在使得成像分辨率显著下降。此外，传统tpm仍然受到光学衍射极限的限制。为了突破光学衍射极限，超分辨成像技术应运而生。近年来，双光子成像技术结合基于不同原理的超分辨成像方法，包括受激辐射损耗(stimu lated emission depl etion,sted)显微镜、结构光照明显微镜(structured i l l umination microscopy,sim)和单分子定位显微镜(si ngle-mo lecule l oca l ization microscopy,smlm)等，可以将双光子成像的分辨率从几百纳米提高到几十纳米，使其可以分辨更精细的生物组织与结构。但是，上述技术都是基于荧光“开/关”态的超分辨成像原理，不仅需要具有特殊光物理化学特性的荧光探针，而且在追求超分辨率极限时会产生一系列新的问题，比如高的激光功率、低的成像速度、复杂的成像系统和昂贵的实验成本等。此外，这些技术尚未能实现大于100微米深度的超分辨成像。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是：提供一种大深度双光子三维超分辨成像系统，旨在提高成像分辨率。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种大深度双光子三维超分辨成像系统，包括：飞秒脉冲激光器、第一分束镜、空间光调制器、角反射器、第二分束镜、双色镜、光电倍增管、时间相关单光子计数器、成像处理终端、振镜、显微镜及三维移动载物平台；

3、所述第一分束镜设在飞秒脉冲激光器的出光光路上，用于将飞秒脉冲激光器发出的高斯光束一分为二，形成透射光路及反射光路；所述空间光调制器设在透射光路上，用于将透射激光束进行两次非相干调制后转换成中心强度为零的三维笼式光束；所述角反射器设在反射光路上，用于调节高斯光束与三维笼式光束之间的脉冲间隔，脉冲间隔调节至所用荧光染料荧光寿命的50％-100％；所述第二分束镜用于将三维笼式光束与角反射器出来的高斯光束进行合束；

4、所述双色镜、振镜、显微镜及三维移动载物平台依次设在第二分束镜的合束光束的出光光路上，所述双色镜与合束光束呈45°夹角；合束得到的合束光束依次经过振镜、显微镜到达三维移动载物平台，对放置在三维移动载物平台的样品进行照射；样品产生的双光子荧光原路返回到双色镜，双色镜将双光子荧光反射到光电倍增管进行光电信号转换及电信号放大；

5、所述光电倍增管、时间相关单光子计数器、成像处理终端依次电信号连接，所述时间相关单光子计数器用于同时接收飞秒脉冲激光器输入的脉冲同步信号及光电倍增管采集荧光放大后的双光子荧光信号，并测量和记录双光子荧光信号的时空信息；成像处理终端用于对光子荧光信号的时空信息进行处理，形成样品图像。

6、进一步的，所述第一分束镜后设有二分之一玻片及第一反射镜，所述二分之一玻片用于对将透射激光束进行偏振调节；所述第一反射镜用于将调节后的透射激光束以45°偏振方向入射到空间光调制器上。

7、进一步的，所述透射光路上还设有四分之一玻片、第一透镜及第二反射镜；所述空间光调制器的液晶面分成左右相等的两个区域，在空间光调制器的液晶面左侧区域加载涡旋相位，对入射光束的偏振p分量进行调制，反射光依次经过第一透镜和四分之一玻片，被第二反射镜反射后再经过第一透镜和四分之一玻片到达空间光调制器的液晶面右侧区域，空间光调制器的液晶面右侧区域加载0/π相位，对入射光束的另一个垂直分量进行调制，四分之一玻片将光束的偏振矢量旋转90°，允许通过空间光调制器的右侧调制入射光的垂直分量，即s分量；第二反射镜和光调制器分别设在第一透镜的前后焦点处，以保持激光波前的共轭调制。

8、进一步的，透射光路上还设有第三反射镜及第四反射镜，所述第三反射镜将空间光调制器的液晶面右侧区域出来的出射光束反射到第四反射镜；所述第四反射镜将第三反射镜反射过来的出射光束反射到第二分束镜。

9、进一步的，所述反射光路上设有第五反射镜及第六反射镜，所述第五反射镜将第一分束镜的反射光反射到角反射器上，所述第六反射镜将角反射器上出来的高斯光束反射到第二分束镜上。

10、进一步的，所述双色镜到光电倍增管之间还设有第二透镜及滤光片。

11、进一步的，所述显微镜依次包括扫描透镜、管镜及物镜。

12、本发明还提供了一种大深度双光子三维超分辨成像方法，应用于上述的大深度双光子三维超分辨成像系统，包括：

13、将飞秒脉冲激光器发出的高斯光束通过第一分束镜一分为二，形成透射光路及反射光路；

14、透射光路的高斯光束通过空间光调制器进行两次非相干调制后产生中心强度为零的三维笼式光束；

15、反射光路的高斯光束通过角反射器调节高斯光束与三维笼式光束之间的脉冲间隔，脉冲间隔调节至所用荧光染料荧光寿命的50％-100％；

16、将空间光调制器调制出来的三维笼式光束和角反射器调节出来的高斯光束通过第二分束镜进行合束；

17、将合束光束依次经过双色镜透射、振镜反射、扫描透镜透射及显微镜透射聚焦后照射到样品；

18、样品产生的双光子荧光原路返回到双色镜，双色镜将双光子荧光反射到光电倍增管进行光电信号转换及电信号放大；

19、时间相关单光子计数器用于同时接收飞秒脉冲激光器输入的脉冲同步信号及光电倍增管采集荧光放大后的双光子荧光信号，并测量和记录双光子荧光信号的时空信息；

20、成像处理终端对双光子荧光信号的时空信息进行处理，形成样品图像。

21、进一步的，时间相关单光子计数器用于同时接收飞秒脉冲激光器输入的脉冲同步信号及光电倍增管采集荧光放大后的双光子荧光信号，并测量和记录双光子荧光信号的时空信息具体包括，

22、通过时间相关单光子计数器采集两束激光脉冲后产生的双光子荧光，得到荧光寿命数据；

23、将荧光衰减曲线中强度突变位置所在的时间通道作为界限，提取通道之前的信号组成光笼图像，提取通道之后的信号组成混合图像，此时混合图像中包含部分光笼光束激发的荧光信号，混合图像的混合点扩展函数包含高斯点扩展函数和光笼点扩展函数；

24、当得到混合图像和光笼图像后，对混合图像和强度增强的光笼图像进行强度差分，即i超分辨图像(x,y)＝i混合图像(x,y)-k×i光笼图像(x,y)，其中k>1；

25、对样品进行三维成像并采集荧光寿命数据，对所有数据进行处理后得到一系列二维超分辨图像，将所有二维超分辨图像进行叠加后得到最终的三维超分辨图像。

26、进一步的，大深度双光子三维超分辨成像方法，还包括：根据实时成像的样品图像调整扫描透镜及所述显微镜以进行光斑调节，使所述合束光束的三维笼式光束及高斯光束的焦平面在空间上重合。

27、本发明的有益效果在于：结合双光子成像、信号时空调制和光场调控技术来提升光学显微成像深度和三维成像分辨率，通过对激发光束外围光子的进行强度差分来提取光束中心的高频信号，在深度500微米内，能够实现优于100nm的横向分辨率和120nm的轴向分辨率。