一种铂-氧化锌异质结纳米粒子的制备方法及其应用

1.本发明属于生物医学纳米材料及其制备领域，更具体地，涉及一种半导体异质结声敏剂的制备方法与应用。


背景技术：

2.超声(us)激活的声动力疗法(sonodynamic therapy，sdt)是一种非侵入性的疾病治疗方法，具有靶向性高、毒副反应小、可达深部肿瘤组织的优点，已成为肿瘤治疗的新方法(angew.chem.int.ed.2020,59,14212)。与光疗法(光热疗法、光动力疗法)相比，sdt以对人体无害的外源性超声波(us)激发声敏剂，产生高细胞毒性的活性氧(ros)，破坏肿瘤细胞而不会对正常组织造成副作用。并且可以通过调节超声波的功率、频率和照射时间来调整组织穿透的深度，与近红外光相比，超声波不会因组织深度增加而显著衰减。由于其具有无创、成本低、组织穿透深度高等优点，sdt已被证明比光疗法更具发展潜力。
3.声敏剂作为声动力疗法最重要的介质，迫切需要高效的声敏剂以提高sdt的治疗效果。常见的声敏剂类型有有机声敏剂与无机声敏剂两种，传统的有机声敏剂分子生物利用度低，体内清除速度快，肿瘤积聚能力差。与有机声敏剂相比，无机纳米声敏剂具有较高的化学/生理稳定性和多功能性(adv.mater.2021,33,2101467)，许多无机纳米材料具有声学活化能力。但基于无机纳米粒子的声敏剂如二氧化钛纳米粒子等具有ros的量子产率较低等局限性，阻碍了sdt的广泛临床应用，目前迫切需要高效的无机声敏剂以提高sdt的治疗效果。
4.本发明我们合成一种铂氧化锌异质结(pt-zno)用于肿瘤声动力治疗的应用。pt-zno是以(ch3coo)2zn为前体，naoh为ph调节剂，nabh4为还原剂，原位还原h2ptcl6，在ch3oh与h2o体系中一步合成的。本发明通过调节(ch3coo)2zn与naoh的浓度、水与甲醇的体积比、还原时间可以有效控制pt-zno的尺寸，所制备的pt-zno水合粒径约为160nm。本方法操作简单、耗时短、耗材少、合成条件温和可控、再现性强。在超声作用下，pt-zno能够表现出声敏剂特性，产生大量单线态氧，从而杀死肿瘤细胞，并且pt-zno具有类过氧化物酶及类过氧化氢酶双重纳米酶活性双酶活性，可催化肿瘤细胞内源性过氧化氢产生氧气及羟基自由基，缓解肿瘤乏氧环境，协同增强声动力治疗效果。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种具有声敏剂特性的金属-半导体异质结纳米粒子，用于抗肿瘤声动力-催化疗法协同治疗。即以zno纳米粒子(zno nps)为模板，表面修饰铂纳米颗粒(pt nps)，实现声动力-催化疗法的协同治疗。
6.一种铂-氧化锌异质结纳米粒子的制备方法，其特征在于，醋酸锌与氢氧化钠反应生成氢氧化锌zn(oh)2，其后在甲醇体系中脱水形成zno；使用还原剂硼氢化钠nabh4将氯铂酸h2ptcl6原位还原于zno表面，离心去除上清，真空干燥后即得到pt-zno异质结纳米粒子；
7.进一步，将(ch3coo)2zn溶解在甲醇溶液中，搅拌至完全溶解；将naoh溶解在甲醇水
溶液中，搅拌至完全溶解；将(ch3coo)2zn溶液滴入naoh溶液中，搅拌反应3h生成zno溶液；将h2ptcl6水溶液加入至上述zno溶液中，搅拌1h；将nabh4溶解在甲醇溶液中，将其加入到上述zno溶液中，反应1h，离心去除上清，清洗三次，真空干燥后得到pt-zno纳米粒子；
8.所述的(ch3coo)2zn甲醇溶液浓度为60mm，naoh甲醇水溶液的浓度为60mm，甲醇与水的体积比为4：1，h2ptcl6水溶液浓度为50mm，nabh4甲醇溶液浓度为160mm；所述的(ch3coo)2zn甲醇溶液、naoh甲醇水溶液、h2ptcl6水溶液、nabh4甲醇溶液的体积比为1：1：0.005：0.25。
9.进一步，所述的离心转速为10000rpm，离心时间为5min；所述的真空干燥的温度为60℃，干燥时间为12h。
10.由所述制备方法制得的pt-zno异质结纳米粒子。.所制备的pt-zno异质结纳米粒子作为半导体异质结声敏剂。
11.该异质结纳米粒子具有如下特征：
12.(1)具有均一的尺寸，水合粒径约为160nm左右；
13.(2)有良好的声敏剂性质，超声作用下产生大量1o2；
14.(3)有良好的类过氧化氢酶纳米酶性质，能够改善肿瘤乏氧环境；
15.(4)有良好的类过氧化物酶纳米酶性质，可以催化过氧化氢产生大量
·
oh；
16.(5)有良好的体外细胞治疗效果；
附图说明
17.图1：本发明实施例1纳米粒子的粒径分布图。
18.图2：本发明实施例1纳米粒子的透射电镜图。
19.图3：本发明实施例2纳米粒子超声产生1o2图。
20.图4：本发明实施例3纳米粒子类过氧化物酶催化产生
·
oh图。
21.图5：本发明实施例4纳米粒子类过氧化氢酶催化产生氧气浓度图。
22.图6：本发明实施例5纳米粒子的细胞毒性图。
具体实施方式：
23.实施例1
24.(1)将1.2mmol(ch3coo)2zn溶解在20ml甲醇溶液中，搅拌至完全溶解。
25.(2)将12mmolnaoh溶解在20ml甲醇水溶液中，甲醇与水体积比为4：1，搅拌至完全溶解。
26.(3)将(1)溶液滴入(2)溶液中，以1500rpm转速搅拌3h。
27.(4)将100μl，50mmh2ptcl6加入(3)溶液中，以1500rpm转速搅拌1h。
28.(5)将0.8mmolnabh4溶解在5ml甲醇溶液中，搅拌至完全溶解。
29.(6)将(5)溶液加入(4)溶液中，以1500rpm转速搅拌反应1h，5min离心三次，60℃下真空干燥12h得到pt-zno纳米粒子。
30.图1数据显示所得到的pt-zno异质结纳米粒子的粒径约为160nm左右。图2的透射电镜图显示，本发明方法制备出pt-zno异质结纳米粒子呈球形，且球形纳米粒子表面成功的负载铂纳米颗粒。
31.实施例2
32.(1)-(6)同实施例1步骤(1)-(6)
33.(7)电子自旋共振波谱仪(electron spin-resonance spectrometer，esr)检测1o2：对照组设置为control，zno+us，pt-zno+us，pt-zno+us+h2o2。3μl 2,2,6,6-四甲基哌啶(temp)分别加入到0.1ml水，zno(100μg/ml)，pt-zno(100μg/ml)中，50mm h2o2加入到pt-zno+us+h2o2组中，反应30min后，然后超声处理(1.0mhz，1.5w cm-2
，1min)，1o2的信号通过esr波谱显示。作为对比，zno+us，pt-zno+us也在同样条件下检测1o2。图3数据显示材料在超声作用下，能产生较强的1o2信号，具有显著的声动力性能。并且由于材料具有类过氧化氢酶活性，加入h2o2后，提高了氧含量，进一步增强了声动力性能，产生更强的1o2信号。
34.实施例3
35.(1)-(6)同实施例1步骤(1)-(6)
36.(8)酶标仪检测类过氧化物酶产生
·
oh：将50μl的pt-zno溶液(100μg/ml)与42.5μl的naac-hac缓冲液(ph＝4.5)混合。并且将浓度为1m的5μl的h2o2溶液和浓度为8mg ml-1
的2.5μl的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)溶液加入上述反应体系中反应30min后，利用酶标仪测量652nm处吸光度进行类过氧化物酶活性测定。由于催化h2o2可使tmb氧化为在652nm有吸收峰的oxtmb，图4(a)数据显示在h2o2存在下，在625nm处显示出较高吸收，表明pt-zno具有类过氧化物酶活性，可催化h2o2产生大量
·
oh。
37.(1)-(6)同实施例1步骤(1)-(6)
38.(9)电子自旋共振波谱仪(electron spin-resonance spectrometer，esr)检测类过氧化物酶产生
·
oh：对照组设置为control，zno+h2o2，pt-zno+h2o2。10μl5,5-二甲基-1-吡咯啉-n-氧化物(dmpo)分别加入到0.1ml水，zno(100μg/ml)，pt-zno(100μg/ml)中，50mm h2o2加入到zno组与pt-zno组中，反应30min后，
·
oh的信号通过esr波谱显示。图4(b)数据显示，材料具有类过氧化物酶活性，可催化过氧化氢产生
·
oh，能产生较强的
·
oh信号。
39.实施例4
40.(1)-(6)同实施例1步骤(1)-(6)
41.(10)溶氧仪测定类过氧化氢酶活性：在搅拌的作用下将0.5ml pt-zno溶液(100μg/ml)添加到19.5ml 50mm h2o2稀溶液中，使用氧气探针记录不同时间点o2的浓度。图5数据显示在h2o2存在下，单纯zno纳米粒子在加入h2o2的条件下不能有效的产生氧气，而pt-zno异质结纳米粒子能够有效产生氧气，说明本纳米粒子具有类过氧化氢酶活性，从而有助于缓解肿瘤组织的乏氧微环境。
42.实施例5
43.(1)-(6)同实施例1步骤(1)-(6)
44.(11)mtt法检测细胞活性：在细胞治疗实验中，将4t1细胞以10000个细胞每孔接种在96孔板中并培养24h，之后与不同浓度的pt-zno共培养3h，然后用1.0mhz，50％占空比，1.5w cm-2
的超声仪超声处理1min，再培养12h，并通过mtt测定检查细胞活力。细胞治疗实验中对细胞进行单独超声治疗，单独催化治疗，还有超声治疗和催化协同治疗，图6数据结果表明超声治疗和催化协同治疗具有最显著治疗效果。分析其原因为材料进入细胞之后，在超声作用下，产生大量活性氧，破坏细胞内氧化还原平衡，且纳米酶性质对声动力疗法具有增强效果，导致大量细胞凋亡。