一种低氧响应型金纳米粒子及其制备方法与应用

本发明属于响应性光学纳米材料领域，具体涉及一种低氧响应型超小发光金纳米粒子及其制备方法与应用。

背景技术：

1、低氧是由于维持细胞功能的氧气供应和消耗之间的失衡造成的身体组织的一种状态，同时也是各种疾病的重要特征，常与多种病理状态并存。低氧程度不仅是许多疾病早期诊断的重要参数，而且还会加重相关疾病，包括癌症、心血管疾病、肝脏和肾脏疾病等。例如，随着实体肿瘤的夸大生长，内部细胞内氧气的消耗远远超过其血液供应，导致肿瘤微环境中的氧气水平较低，低氧在化疗耐药、放射耐药、血管生成和侵袭性方面发挥着重要作用。由于低氧的重要性，准确地描述肿瘤中低氧的分布及其程度将有助于临床医生获得关于肿瘤恶性程度的准确信息，从而提供相应的个性化治疗策略。临床上认为氧气微电极和免疫组织化学是提供缺氧局部信息的最可靠方法，能够获得准确的氧气浓度和缺氧相关的生物标志物。然而，这些治疗方法对患者来说可能是费时且痛苦。因此，开发新的低氧条件下无创活体成像策略对低氧相关疾病的诊断和治疗是非常必要的。

2、超小发光金纳米粒子具备尺寸小、可肾清除、光学性质可调及毒性低这些特点具有更大的临床转化前景，在拥有这些优异特性的同时，这些特性也给超小发光金纳米粒子的实际应用带来了一定的难度，例如，肾清除速度快及与细胞相互作用力弱，导致超小发光金纳米粒子在体内的循环时间短，血管渗透及淋巴引流差，难以聚集到疾病部位。

3、到目前为止，随着研究兴趣从直接的、有创的氧针测量转移到无创成像，已经开发了几种选择性检测低氧的成像方法，例如正电子发射断层扫描/计算机断层扫描(pet/ct)、磁共振成像(mri)和荧光成像(fli)等。然而，磁共振成像是一种相对昂贵的方式，特点是耗时。pet/ct用于实时监测是首选的，但由于成本高和存在辐射风险，其应用受到限制。荧光成像技术提供了一种很有前途的成像缺氧的方法，因为它具有高灵敏度、简单和非侵入性的优点。相比于目前常用的近红外一区(nir-i,750-900nm)荧光成像技术，近红外二区(nir-ii，1000-1700nm)由于发射波长更长，可显著降低在穿透生物组织时的光散射及自荧光效应的影响，使探测深度更深、空间分辨率更高而收到广泛关注。

4、目前可通过表面化学性质的调控，例如配体种类，密度及电荷来改善金纳米粒子的应用局限性，并能实现近红外二区低氧荧光成像。因此对金纳米粒子表面化学性质进行调控具有实际应用价值。

5、根据chun-yan li等人的报道，设计并合成了一种新型荧光探针cy-ap，在探针中，半菁染料被用作荧光团和偶氮基团作为识别基团实现“肠肝轴”的可视化。但该有机小分子探针光化学稳定性差、光漂白现象比较严重，较低的组织穿透能力以及生物体自身背景荧光等诸多因素的干扰，限制了其在生物医学中的应用。(tian y,li y,wang w x,etal.novel strategy for validating the existence and mechanism of the“gut–liveraxis”in vivo by a hypoxia-sensitive nir fluorescent probe[j].analyticalchemistry,2020,92(6):4244-4250.)。zhiyong tang等人利用上转换纳米材料和mof装载低氧传感分子吡啶钌制备了新纳米粒子bmu-ru，利用非小细胞肺癌不同发展阶段低氧的区域和浓度的不同，bmu-ru展现出清晰的低氧渐变增强信号，但其不足之处是近红外一区成像且无法进行肾清除。(li y,liu j,wang z,et al.optimizing energy transfer innanostructures enables in vivo cancer lesion tracking via near-infraredexcited hypoxia imaging[j].advanced materials,2020,32(14):1907718.)。因此通过在金纳米粒子表面修饰上低氧响应基团偶氮苯，可实现对低氧相关疾病近红外二区荧光成像，且同时具备肾清除特性和良好的生物相容性，具有非常重要的科学研究和临床应用价值。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点和不足，本发明提供了一种低氧响应型超小发光金纳米粒子的制备方法及其对低氧诱导的肝损伤和肾损伤成像的方法。本发明提供的金纳米粒子在低氧区域被偶氮还原酶生物还原，尺寸减小，表面大部分聚乙二醇水合层脱去，且表面电荷发生电荷反转，增强与细胞相互作用，在低氧部位滞留时间增强，实现对正常组织和低氧受损组织的区分。因此，本发明制备的低氧响应超小发光金纳米粒子在临床低氧相关疾病诊断领域具有较大的应用前景。

2、本发明的目的通过以下技术方案实现：

3、一种低氧响应型金纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)将3-巯基丙酸配体加入到水相中，配制得到巯基丙酸的溶液；

5、(2)将另一种巯基配体甲氧基聚乙二醇硫醇加入水相中，配制得到甲氧基聚乙二醇硫醇的溶液；

6、(3)将氯金酸与3-巯基丙酸溶液和另一种巯基配体甲氧基聚乙二醇硫醇的溶液加入还原剂，搅拌反应；

7、(4)将反应液超滤提纯得到非低氧响应型金纳米粒子；

8、(5)在非低氧响应型金纳米粒子中加入edc/nhs，搅拌反应；

9、(6)在反应液中加入偶氮苯基团的配体mpeg-azo-nh2，搅拌反应；

10、(7)将反应液超滤提纯得到低氧响应型超小发光金纳米粒子。

11、进一步地，步骤(1)中，所述3-巯基丙酸的摩尔浓度为1mmol/l-8mmol/l，优选5mmol/l。

12、进一步地，步骤(2)中，所述另一种巯基配体甲氧基聚乙二醇硫醇的溶液的摩尔浓度为1mmol/l-8mmol/l，优选5mmol/l。

13、进一步地，步骤(3)所述氯金酸与总巯基配体(r-sh)的物质的量比值为1:1-1:5，优选1:2；所述总巯基配体为3-巯基丙酸和甲氧基聚乙二醇硫醇的总和；3-巯基丙酸和甲氧基聚乙二醇硫醇的物质的量比值为1:0.1-1:0.5，优选1:0.2。

14、进一步地，步骤(3)所述还原剂为硼氢化钠。

15、进一步地，步骤(3)所述氯金酸与步骤(5)所述还原剂的物质的量的比值为1:1-1:5，优选1:2。

16、进一步地，步骤(3)所述搅拌反应温度为室温，搅拌转速为1000rpm，搅拌时间为40min。

17、进一步地，步骤(4)所述超滤提纯为用超滤管超滤离心去掉未反应的底物并浓缩；所述超滤离心温度为20℃，超滤离心转速为3750rpm，超滤离心时间为10min；超滤次数为4次；超滤管的膜孔径为10kda。

18、进一步地，步骤(5)所述edc/nhs与步骤(3)所述3-巯基丙酸的物质的量的比值为1:1-5:1优选5:1，搅拌时间为15min，反应ph＝6.1。

19、进一步地，步骤(6)所述mpeg-azo-nh2与步骤(3)所述3-巯基丙酸的物质的量的比值为5:1。

20、优选的，步骤(6)所述搅拌反应的ph＝7.4，温度为35℃，搅拌转速为1000rpm，搅拌时间为12h。

21、进一步优选的，步骤(7)所述超滤提纯为用超滤管超滤离心去掉未反应的底物并浓缩；所述超滤离心温度为20℃，超滤离心转速为3750rpm，超滤离心时间为10min；超滤次数为8次；超滤管的膜孔径为10kda。

22、上述的制备方法制备得到的低氧响应型金纳米粒子，所述的金纳米粒子粒径大小为～2.3nm，水合粒径为～5.0nm，在体外用连二亚硫酸钠模拟的低氧环境中，纳米粒子核尺寸保持不变，水合粒径减小为～2.9nm。

23、上述的制备方法制备得到的低氧响应型金纳米粒子，所述的金纳米粒子荧光发射波长最大值在954nm，并且拖尾至近红外二区；所述的低氧响应型金纳米粒子在体外用连二亚硫酸钠模拟的低氧环境中，荧光发射波长最大值不变，荧光强度略有下降。

24、本发明还提供了上述低氧响应型金纳米粒子在低氧响应成像中的应用。所述低氧响应金纳米粒子在低氧微环境中尺寸的减小和表面电荷由负电到正电的变化可以用来对低氧诱导的肝损伤和肾损伤进行成像。

25、上述低氧响应金纳米粒子用于低氧诱导的肝损伤和肾损伤成像的方法，包括以下步骤：

26、在密闭容器中通入氮气，形成低氧环境，将balb/c5周雌性小白鼠放置在低氧的密闭容器中一段时间造成肝损伤和肾损伤，随后尾静脉注射低氧响应型金纳米粒子使用深冷ingaas相机进行成像。

27、优选的，低氧环境氧气浓度为10％，低氧时间为2h，相机配备970nm长通滤光片，808nm激光器功率为200mw/cm2，曝光时间为0.2s，所述静脉注射低氧响应型金纳米粒子的浓度为2μm，成像时间为72h。

28、与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

29、(1)本发明方法制备的低氧响应型超小发光金纳米粒子，合成路线简单，操作难度低，产率高，易于工业化生产；

30、(2)本发明方法制备的低氧响应型超小发光金纳米粒子，发射波长长，并且拖尾至近红外二区，具有更高的空间分辨率，更深的生物穿透深度，更小的组织自发荧光背景；

31、(3)本发明方法制备的低氧响应型超小发光金纳米粒子尺寸小，可肾清除，具有良好的生物相容性和低毒性；

32、(4)本发明方法制备的低氧响应型超小发光金纳米粒子，在低氧微环境和正常生理环境中表面电荷和尺寸的不同，与细胞的相互作用不同，使其能够显著区分低氧受损部位，在低氧相关疾病的诊断领域具有良好的应用前景。