分级酶解法制备含寡糖海藻有机肥的方法与流程

本发明属于农业肥料领域，具体涉及一种酶解法制备含寡糖海藻有机肥的方法。

背景技术：

目前，针对海藻有机肥的生产方法主要有化学法、物理法以及生物法。化学法主要是利用酸、碱及有机溶剂处理海藻细胞，使细胞消解释放内源物质，该方法操作简单，容易实现，也是国内外绝大多数海藻肥生产企业采用的方法。但是，化学试剂对海藻细胞内的活性物质成分的破坏是相当大的，并且残留的有机试剂对环境也是潜在的危害。物理法的原理是控制压力，温度等物理环境条件，利用机械力使海藻细胞破碎，内容物释放。该方法虽然工艺清洁、环境友好，但是对于仪器设备的要求严苛，反应条件变化剧烈，成本较高，难以实现大规模生产。生物法包括酶法降解和微生物发酵两种方法，其主要原理是破坏海藻细胞壁结构并降解大分子物质为植物容易吸收利用的小分子物质，该方法反应温和，整个生产过程安全环保无污染。

酶解法比微生物发酵的优势在于过程可控性更高，目标更明确，而且生产效率更高。目前国内利用酶解法法生产海藻肥料的研究很少，仅有的几例研究普遍存在产酶效率不高，酶解产物不明确，有效物质含量低等问题，大大影响了产品的的质量。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种分级酶解法制备含寡糖海藻有机肥的方法。通过多种酶分级酶解，使各类酶发挥协同作用，提高活性物质褐藻寡糖的含量，增强肥效。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种分级酶解法制备含寡糖海藻有机肥的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、制备产品A：将新鲜的海洋藻类植物洗净、除杂，浸泡12-48h后，磨浆，转入发酵罐内，在110-150℃灭菌15-30min，冷却至20-35℃得到产品A，备用；

并制备酶溶液：将蜡样芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌分别活化后接种到同一个种子发酵罐混合富集培养，接种量均为10％-20％，温度为30℃-38℃，培养10h-24h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到纤维素分解酶溶液甲；将嗜糖芽孢杆菌活化后转入种子发酵罐富集培养，接种量为10％-20％，，温度为30℃-38℃，培养10h-24h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到褐藻酸降解酶溶液乙；

所述的接种量是指种子液占发酵培养基的质量百分比；

2)、制备产品B：按酶溶液甲和产品A的重量比为1∶3-10，将酶溶液甲加入到产品A中，控制温度为30-40℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5-8，反应时间为2-10h，得到产品B；

3)、制备产品C：按酶溶液乙和产品B的重量比为1∶3-10，将酶溶液乙加入到产品B中，控制温度为30-40℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5-8，反应时间为2-10h，得到产品C；

4)、制备产品D：将发酵罐内产品C温度冷却至0℃～5℃，保存2～7天，然后将温度恢复至25℃～35℃，得到产品D；

5)、制备海藻有机肥：向产品D中加入硝酸钾10-15重量份、磷酸二氢钾5-15重量份、尿素10-15份，搅拌使溶解均匀得到100重量份的海藻有机肥。

所述的海洋藻类植物为铜藻、海带、褐藻、鼠尾藻和马尾藻中的一种或者任意比例的两种以上。

所述混合富集培养所用的培养基配方为：豆粕粉20g，蛋白胨15g，酵母膏6g，海藻酸钠1.2g，磷酸二氢钾0.04g，碳酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，甘露醇4.5g，水1000mL，调节pH6.8-7.0。

嗜糖芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：红薯粉22g，谷氨酸0.03g，酵母膏5g，蛋白胨11g，二氧化锰0.02g，磷酸二氢钾0.02g，氯化铁0.005g，硫酸镁0.2g，硫酸钙0.1g，新鲜海水1000mL，调节pH7.2-7.5。

所述的步骤2)至步骤3)中的酸碱调节剂为柠檬酸，草酸，醋酸，氨水，碳酸钠，醋酸钠中的一种或几种。

所述海藻有机肥料的寡糖含量在20g/L以上，褐藻酸含量在20g/L以上，pH值为7.0-8.5，N、P、K含量比例为1-2∶1∶0.8-1.5。

所述嗜糖芽孢杆菌是嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3，其保藏号为CGMCC No12155。

本发明的有益效果：

1、所用的酶为微生物自身代谢产生，环保无残留。

2、酶的专一性决定了其目标产物明确，而高效性大大缩短了反应时间，提高了反应效率。

3、解淀粉芽孢杆菌产生的纤维素分解酶能够降解藻类细胞壁，加快有效物质的外流；嗜糖芽孢杆菌产生的褐藻酸裂解酶能够将褐藻酸降解为小寡糖被植物吸收利用。两种酶协同作用大大提高了褐藻酸的提取率和转化率，提高了褐藻寡糖的含量。

4、采用本发明制备的有机肥，寡糖含量高，肥效显著，可明显提高作物产量和抵抗力。

5、根据酶的作用不同，最适反应条件存在差别，本发明采用分级酶解工艺，将酶作用发挥到最大化，保证了最好的效果。

6、整个工艺流程经过微生物和酶的双重作用，使得最终产品重金属含量明显降低。

附图说明

图1是显微观察YIC～Alg3菌株的革兰氏染色及聚集成团现象图。

图2是基于16SrDNA序列构建的YIC～Alg3菌株系统发育树示意图。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1

1)制备产品A：将新鲜的铜藻和海带(质量比为1∶1)洗净、除杂，浸泡24h后，磨浆，转入发酵罐内，在115℃灭菌30min，冷却至20℃得到产品A，备用。

2)制备酶溶液：将蜡样芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌分别活化后接种到同一个种子发酵罐混合富集培养，接种量均为10％，温度为37℃，培养15h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到纤维素分解酶溶液甲；将嗜糖芽孢杆菌活化后转入种子发酵罐富集培养，接种量为10％，，温度为30℃，培养12h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到褐藻酸降解酶溶液乙。

所述的接种量是指种子液占发酵培养基的质量百分比。

所述的混合富集培养的培养基配方为：豆粕粉20g，蛋白胨15g，酵母膏6g，海藻酸钠1.2g，磷酸二氢钾0.04g，碳酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，甘露醇4.5g，水1000mL，调节pH6.8-7.0。

所述的嗜糖芽孢杆菌富集培养的培养基配方为：红薯粉22g，谷氨酸0.03g，酵母膏5g，蛋白胨11g，二氧化锰0.02g，磷酸二氢钾0.02g，氯化铁0.005g，硫酸镁0.2g，硫酸钙0.1g，新鲜海水1000mL，调节pH7.2-7.5。

3)制备产品B：按酶溶液甲和产品A的重量比为1∶7，将酶溶液甲加入到产品A中，控制温度为35℃，用草酸和醋酸钠调节反应的pH值为6.8，转速为150r/min，反应时间为2h，得到产品B。

4)制备产品C：按酶溶液乙和产品B的重量比为1∶10，将酶溶液乙加入到产品B中，控制温度为30℃，用草酸和醋酸钠调节反应的pH值为7.0，转速为200r/min，反应时间为3h，得到产品C。

5)制备产品D：将发酵罐内产品C温度冷却至3℃，保存2天，然后将温度恢复至25℃，得到产品D；

6)制备海藻有机肥料：向产品D中加入硝酸钾10重量份、磷酸二氢钾8重量份、尿素15份，搅拌使溶解均匀得到100重量份的海藻有机肥料。

实施例2

1)制备产品A：将新鲜的马尾藻和鼠尾藻(质量比为1∶1)洗净、除杂，浸泡36h后，磨浆，转入发酵罐内，在121℃灭菌30min，冷却至30℃得到产品A，备用。

2)制备酶溶液：将蜡样芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌分别活化后接种到同一个种子发酵罐混 合富集培养，接种量均为15％，温度为37℃，培养18h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到纤维素分解酶溶液甲；将嗜糖芽孢杆菌活化后转入种子发酵罐富集培养，接种量为15％，，温度为35℃，培养14h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到褐藻酸降解酶溶液乙。

所述的接种量是指种子液占发酵培养基的质量百分比。

所述的菌种富集培养基配方均同实施例1。

3)制备产品B：按酶溶液甲和产品A的重量比为1∶6，将酶溶液甲加入到产品A中，控制温度为37℃，用醋酸和氨水调节反应的pH值为7.0，转速为200r/min，反应时间为3h，得到产品B。

4)制备产品C：按酶溶液乙和产品B的重量比为1∶6，将酶溶液乙加入到产品B中，控制温度为35℃，用氨水和醋酸调节反应的pH值为7.2，转速为220r/min，反应时间为4h，得到产品C。

5)制备产品D：将发酵罐内产品C温度冷却至3℃，保存3天，然后将温度恢复至30℃，得到产品D；

6)制备海藻有机肥料：向产品D中加入硝酸钾12重量份、磷酸二氢钾10重量份、尿素13份，搅拌使溶解均匀得到100重量份的海藻有机肥料。

对比例1

1)制备产品A：操作方法同实施例2。

2)只制备酶溶液甲：操作方法同实施例2。

3)制备产品B：按酶溶液甲和产品A的重量比为1∶6，将酶溶液甲加入到产品A中，控制温度为37℃，用醋酸和氨水调节反应的pH值为7.0，转速为200r/min，反应时间为3h，得到产品B。

4)制备产品C：将发酵罐内产品B温度冷却至3℃，保存3天，然后将温度恢复至30℃，得到产品C；

5)制备海藻有机肥料：向产品C中加入硝酸钾12重量份、磷酸二氢钾10重量份、尿素13份，搅拌使溶解均匀得到100重量份的海藻有机肥料。

对比例2

1)制备产品A：操作方法与实施例2相同。

2)制备酶溶液：操作方法与实施例2相同。

3)制备产品B：将酶溶液甲和酶溶液乙按照质量比为1∶1混合后加入到产品A中，混合溶液的加入量为产品A质量的20％，控制温度为35℃，用醋酸和氨水调节反应的pH值为7.0，转速为200r/min，反应时间为4h，得到产品B。

4)制备产品C：将发酵罐内产品B温度冷却至3℃，保存3天，然后将温度恢复至30℃，得到产品C；

5)制备海藻有机肥料：向产品C中加入硝酸钾12重量份、磷酸二氢钾10重量份、尿素13份，搅拌使溶解均匀得到100重量份的海藻有机肥料。

产品指标检测结果见表1。

表1：产品检测结果

从表1可见，本发明生产的海藻有机肥，活性物质的含量明显高于市场同类产品，尤其是褐藻寡糖作为本发明产品的特有的功能性成分，优势极为明显。经过微生物和酶的双重作用，重金属含量明显降低。

将本发明的实施例和对比例相关肥料施于西红柿种植地块，亩用量为40kg。种植期为1年，与施用市场购买的类似产品对比，肥效结果见表2。

表2：肥效对比结果

表2表明：在施肥量相当的情况下，使用本发明的海藻有机肥产品，明显提升作物品质，大大降低了作用病虫害，有效增强作物的抗性，能提高作用产量11-12％；

无论从产品质量以及肥效表现上，本发明采用的复合分级发酵技术效果明显好于单一酶解以及简单的将多种酶混合酶解。

本发明所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCC No.12155，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年03月02日，拉丁文分类命名：Bacillus halosaccharovorans。

所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的生物特性如下：

褐藻酸碳源培养基：海藻酸钠5g，硫酸铵5g，硫酸镁1g，磷酸氢二钾2g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.2～7.4。

YIC～Alg3菌株在褐藻酸唯一碳源平板上生长48h后，菌落不规则，淡黄色，中间不透明，边缘半透明，表面褶皱。显微镜观察菌株为杆状，在末端或近末端可产生芽孢，革兰氏阳性，能运动，生长后期菌体易聚集成团(图1)。生长温度范围20～45℃，PH范围6～9，NaCl浓度范围0～15％，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH 7.5。触酶，氧化酶，VP试验阳性，能够利用葡萄糖，甘露糖，甘露醇，果糖，乳糖，半乳糖，淀粉；不能利用山梨醇，纤维素。系统发育树如图2所示。根据其生理生化特征，16SrDNA序列及系统发育树信息，将该菌株鉴定为嗜糖芽孢杆菌Bacillus halosaccharovorans。

注：+表示可以利用，～表示不能利用。