本发明涉及一种有机液体肥的制备方法，具体涉及一种含寡糖海洋有机液体肥的制备方法。
背景技术：
：目前，针对海藻有机肥的生产方法主要有化学法、物理法以及生物法。化学法主要是利用酸、碱及有机溶剂处理海藻细胞，使细胞消解释放内源物质，该方法操作简单，容易实现，也是国内外绝大多数海藻肥生产企业采用的方法。但是，紧靠化学提取只能提取海藻原有的物质，没有新的活性物质产生，有效活性成分单一，大分子物质不易被植物吸收利用。物理法的原理是控制压力，温度等物理环境条件，利用机械力使海藻细胞破碎，内容物释放。该方法虽然工艺清洁、环境友好，但是对于仪器设备的要求严苛，反应条件变化剧烈，成本较高，难以实现大规模生产。生物法包括酶法降解和微生物发酵两种方法，其主要原理是破坏海藻细胞壁结构并降解大分子物质为植物容易吸收利用的小分子物质，该方法反应温和，整个生产过程安全环保无污染。酶解法比微生物发酵的优势在于过程可控性更高，目标更明确，而且生产效率更高。目前国内利用酶解法法生产海藻肥料的研究很少，仅有的几例研究普遍存在产酶效率不高，酶解产物不明确，有效物质含量低等问题，大大影响了产品的的质量。另外单独使用酶解法需要消耗大量的酶，生产成本较高，难以控制。技术实现要素：本发明目的在于提供一种碱提和分级酶解联合制备含寡糖海洋有机液体肥的方法。将物料在碱解的基础上，实现分级酶解，提高了活性物质的提取效率，节约生产成本，整个工艺操控性强，绿色节能，环保。本发明的技术方案如下：一种碱提和分级酶解联合制备含寡糖海洋有机液体肥的方法，其特征在于包括以下步骤：1）、制备产品A：将新鲜的海洋藻类植物洗净，除杂，浸泡12-48h后，磨浆，转入发酵罐内，加入碱调节pH值为9-11，反应温度为60-80℃，反应时间为2-5h，冷却至室温，用酸调节物料的pH值为7-8，在110-150℃灭菌15-30min，冷却至20-35℃得到产品A，备用；2）、制备酶溶液：将蜡样芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌分别活化后接种到同一个种子发酵罐混合富集培养，接种量均为10%-20%，温度为30℃-38℃，培养10h-24h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到纤维素分解酶溶液甲；将嗜糖芽孢杆菌活化后转入种子发酵罐富集培养，接种量为10%-20%，温度为30℃-38℃，培养10h-24h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到褐藻酸降解酶溶液乙；所述的接种量是指种子液占发酵培养基的质量百分比；3）、制备产品B：按酶溶液甲和产品A的重量比为1:3-10，将酶溶液甲加入到产品A中，控制温度为30-40℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5-8，反应时间为2-10h，得到产品B；4）、制备产品C：按酶溶液乙和产品B的重量比为1:3-10，将酶溶液乙加入到产品B中，控制温度为30-40℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5-8，反应时间为2-10h，得到产品C；5）、制备产品D：将发酵罐内产品C温度冷却至0℃～5℃，保存2～7天，然后将温度恢复至25℃～35℃，得到产品D；6）、制备海洋有机液体肥：向产品D中加入硝酸钾5-10重量份、磷酸二氢钾5-10重量份、尿素5-10份，有机物料15-20份，搅拌使溶解均匀得到100重量份的海洋有机液体肥；所述的有机物料是壳聚糖、糖蜜、柠檬酸中的一种或任意比例的两种以上。步骤1）中，所述的碱为碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢氨、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或者任意比例的两种以上；所述的酸为稀硫酸、稀盐酸、稀硝酸、柠檬酸、醋酸中的一种或任意比例的两种以上。所述的步骤2）中的混合富集培养所用的培养基配方为：豆粕粉20g，蛋白胨15g，酵母膏6g，海藻酸钠1.2g，磷酸二氢钾0.04g，碳酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，甘露醇4.5g，水1000mL，调节pH6.8-7.0。嗜糖芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：红薯粉22g，谷氨酸0.03g，酵母膏5g，蛋白胨11g，二氧化锰0.02g，磷酸二氢钾0.02g，氯化铁0.005g，硫酸镁0.2g，硫酸钙0.1g，新鲜海水1000mL，调节pH7.2-7.5。所述的步骤3）至步骤4）中的酸碱调节剂为柠檬酸，草酸，醋酸，氨水，碳酸钠，醋酸钠中的一种或几种。所述的海洋藻类植物为铜藻、海带、褐藻、鼠尾藻和马尾藻中的一种或者任意比例的两种以上。所述海藻有机肥料的寡糖含量在25g/L以上，褐藻酸含量在25g/L以上，pH值为7.0-8.5。所述嗜糖芽孢杆菌是嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3，其保藏号为CGMCCNo.12155；所述的巨大芽孢杆菌是巨大芽孢杆菌YIC～BM1，保藏号为CGMCCNo.12156。本发明的有益效果如下：1.本发明将碱提工艺与分级酶解工艺有效结合，各取所长，使得反应时间明显缩短，极大的提升了生产效率。2.单独使用酶解工艺要想达到理想的效果前期需要消耗大量的纤维素酶和果胶酶来破坏海藻细胞壁，本工艺前期使用碱提破坏细胞壁促进胞内物质的释放，代替了部分酶的作用，减少了酶的用量，大大降低了生产成本。3.本发明在酶解工艺之前先进行化学碱提，使得有效物质溶出率大大提高，活性成分海藻酸和寡糖的含量提高，均可达25g/L以上。提高了产品质量。4.本发明得到产品具有水溶性好，易于植物吸收利用，同时作为一种重要的信号分子，能够参与植物的生长调节和诱导抗病过程，促进植物的生长，提高植物对不良环境及病虫害的抵抗力。5.原料来源清洁无污染，生产工艺绿色环保，并且经过微生物和酶的双重作用，使得最终产品的重金属含量大大降低，提高了产品的环保性、安全性。具体实施方式结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不作为对本发明的限定。实施例11）、制备产品A：将新鲜的铜藻洗净，除杂，浸泡22h后，磨浆，转入发酵罐内，加入碳酸钠进行反应，调节pH值10.2，反应温度为70℃，反应时间为3h，冷却至室温，用稀硫酸调节物料的pH值为7.5，在121℃灭菌20min，冷却至25℃得到产品A，备用；2）制备酶溶液：将蜡样芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌分别活化后接种到同一个种子发酵罐混合富集培养，接种量均为10%，温度为37℃，培养15h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到纤维素分解酶溶液甲；将嗜糖芽孢杆菌活化后转入种子发酵罐富集培养，接种量为10%，，温度为30℃，培养12h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到褐藻酸降解酶溶液乙。所述的接种量是指种子液占发酵培养基的质量百分比。所述的混合富集培养的培养基配方为：豆粕粉20g，蛋白胨15g，酵母膏6g，海藻酸钠1.2g，磷酸二氢钾0.04g，碳酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，甘露醇4.5g，水1000mL，调节pH6.8-7.0。所述的嗜糖芽孢杆菌富集培养的培养基配方为：红薯粉22g，谷氨酸0.03g，酵母膏5g，蛋白胨11g，二氧化锰0.02g，磷酸二氢钾0.02g，氯化铁0.005g，硫酸镁0.2g，硫酸钙0.1g，新鲜海水1000mL，调节pH7.2-7.5。3）制备产品B：按酶溶液甲和产品A的重量比为1:7，将酶溶液甲加入到产品A中，控制温度为35℃，用草酸和醋酸钠调节反应的pH值为6.8，转速为150r/min，反应时间为2h，得到产品B。4）制备产品C：按酶溶液乙和产品B的重量比为1:10，将酶溶液乙加入到产品B中，控制温度为30℃，用草酸和醋酸钠调节反应的pH值为7.0，转速为200r/min，反应时间为3h，得到产品C。5）制备产品D：将发酵罐内产品C温度冷却至3℃，保存2天，然后将温度恢复至25℃，得到产品D；6）、制备海洋有机液体肥：向产品D中加入硝酸钾7重量份、磷酸二氢钾8重量份、尿素10份，糖蜜17份，搅拌使溶解均匀得到100重量份的海洋有机液体肥。实施例21）、制备产品A：将新鲜的马尾藻洗净，除杂，浸泡30h后，磨浆，转入发酵罐内，加入碳酸钠进行反应，调节pH值10.5，反应温度为80℃，反应时间为2.5h，冷却至室温，用稀硫酸调节物料的pH值为8.0，在115℃灭菌30min，冷却至25℃得到产品A，备用；2）制备酶溶液：将蜡样芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌分别活化后接种到同一个种子发酵罐混合富集培养，接种量均为15%，温度为37℃，培养18h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到纤维素分解酶溶液甲；将嗜糖芽孢杆菌活化后转入种子发酵罐富集培养，接种量为15%，，温度为35℃，培养14h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到褐藻酸降解酶溶液乙。所述的接种量是指种子液占发酵培养基的质量百分比。所述的菌种富集培养基配方均同实施例1。3）制备产品B：按酶溶液甲和产品A的重量比为1:6，将酶溶液甲加入到产品A中，控制温度为37℃，用醋酸和氨水调节反应的pH值为7.0，转速为200r/min，反应时间为3h，得到产品B。4）制备产品C：按酶溶液乙和产品B的重量比为1:6，将酶溶液乙加入到产品B中，控制温度为35℃，用氨水和醋酸调节反应的pH值为7.2，转速为220r/min，反应时间为4h，得到产品C。5）制备产品D：将发酵罐内产品C温度冷却至3℃，保存3天，然后将温度恢复至30℃，得到产品D；6）、制备海洋有机液体肥：向产品D中加入硝酸钾8重量份、磷酸二氢钾5重量份、尿素9份，糖蜜20份，搅拌使溶解均匀得到100重量份的海洋有机液体肥。对比例1仅做碱解，不做发酵。1）、制备产品A：将新鲜的铜藻洗净，除杂，浸泡22h后，磨浆，转入发酵罐内，加入碳酸钠进行反应，调节pH值10.2，反应温度为70℃，反应时间为3h，冷却至室温，用稀硫酸调节物料的pH值为8.5，得到产品A，备用；2）、制备海洋有机液体肥：向产品D中加入硝酸钾7重量份、磷酸二氢钾8重量份、尿素10份，糖蜜17份，搅拌使溶解均匀得到100重量份的海洋有机液体肥。对比例2仅做发酵，不做碱解。1）制备产品A：将新鲜的铜藻洗净、除杂，浸泡22h后，磨浆，转入发酵罐内，在121℃灭菌20min，冷却至25℃得到产品A，备用。2）制备酶溶液：将蜡样芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌分别活化后接种到同一个种子发酵罐混合富集培养，接种量均为10%，温度为37℃，培养15h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到纤维素分解酶溶液甲；将嗜糖芽孢杆菌活化后转入种子发酵罐富集培养，接种量为10%，，温度为30℃，培养12h，将发酵液离心后经过膜过滤除去菌体得到褐藻酸降解酶溶液乙。所述的接种量是指种子液占发酵培养基的质量百分比。所述的菌种富集培养基配方均同实施例1。3）制备产品B：按酶溶液甲和产品A的重量比为1:7，将酶溶液甲加入到产品A中，控制温度为35℃，用草酸和醋酸钠调节反应的pH值为6.8，转速为150r/min，反应时间为2h，得到产品B。4）制备产品C：按酶溶液乙和产品B的重量比为1:10，将酶溶液乙加入到产品B中，控制温度为30℃，用草酸和醋酸钠调节反应的pH值为7.0，转速为200r/min，反应时间为3h，得到产品C。5）制备产品D：将发酵罐内产品C温度冷却至3℃，保存2天，然后将温度恢复至25℃，得到产品D；6）、制备海洋有机液体肥：向产品D中加入硝酸钾7重量份、磷酸二氢钾8重量份、尿素10份，糖蜜17份，搅拌使溶解均匀得到100重量份的海洋有机液体肥。产品指标检测结果见表1。表1：产品检测结果项目寡糖含量g/L褐藻酸含量g/L有机质含量g/LpH水不溶物g/L汞含量mg/L砷含量mg/L镉含量mg/L铅含量mg/L实施例127.328.51188.25.9640.65实施例226.828.31228.06.1550.64对比例13.530.51168.06.110111.49对比例221.720.81198.26.0560.75市售海藻液体肥3.618.8779.06.216183.115实验表明：将碱提与分级酶解工艺相结合，活性成分海藻酸和寡糖的含量均可达25g/L以上。相比单独碱解和单独发酵，有效成分总提取率明显提高。由该发明制备的产品的重金属含量显著降低。将本发明的实施例和对比例相关肥料施于西红柿种植地块，亩用量为40kg。种植期为1年，与施用市场购买的类似产品对比，肥效结果见表2。表2：肥效对比结果项目产量提高畸形果率降低商品果率提高冻害率降低虫害率降低病害率降低实施例113.5%9.6%11.7%16%15%12%实施例213.0%9.0%11.0%15%13%12%对比例17.0%4.7%4.0%8%7%6%对比例211.2%6.9%7.2%10%10%8%市售海藻液体肥6.8%5.0%4.2%9%7%7%表2表明：在施肥量相当的情况下，使用本发明的海洋有机液体肥产品，明显提升作物品质，大大降低了作用病虫害，有效增强作物的抗性，能提高作用产量最高超过13%；无论从产品质量以及肥效表现上，本发明采用的碱提和分级酶解联合制备含寡糖海洋有机液体肥的方法效果明显好于单一化学碱提以及单一分级酶解。本发明所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCCNo.12156；保藏单位名称是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分类命名为：Bacillusmegaterium。所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的生物特性如下：YIC～BM1菌株在纤维素培养基平板上生长48h后，菌落圆形，白色，表面平整。显微镜观察菌株为革兰氏阳性，杆状，能运动，产芽孢。生长温度范围20～40℃，PH范围6-10，NaCl浓度范围0～20%，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH7.5。触酶，氧化酶，半乳糖苷酶阳性，吲哚，VP实验阴性，不还原硝酸；能够利用葡萄糖，甘露糖，乳糖，棉子糖，蔗糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇，山梨醇。根据其生理生化特征，基因序列及系统发育树信息，将该菌株鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium。本发明所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCCNo.12155；保藏单位名称是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分类命名为：Bacillushalosaccharovorans。所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的生物特性如下：YIC～Alg3菌株在褐藻酸唯一碳源平板上生长48h后，菌落不规则，淡黄色，中间不透明，边缘半透明，表面褶皱。显微镜观察菌株为杆状，在末端或近末端可产生芽孢，革兰氏阳性，能运动，生长后期菌体易聚集成团。生长温度范围20～45℃，PH范围6～9，NaCl浓度范围0～15%，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH7.5。触酶，氧化酶，VP试验阳性，能够利用葡萄糖，甘露糖，甘露醇，果糖，乳糖，半乳糖，淀粉；不能利用山梨醇，纤维素。根据其生理生化特征，基因序列及系统发育树信息，将该菌株鉴定为嗜糖芽孢杆菌Bacillushalosaccharovorans。生化特性结果生化特性结果触酶+乳糖～氧化酶+半乳糖～VP试验+淀粉～葡萄糖+山梨醇～甘露糖+维生素～甘露醇+果糖+注：+表示可以利用，～表示不能利用。当前第1页1 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