本发明涉及肥料制备技术领域，具体涉及一种兼具抗病促生作用的生物有机肥及其制备方法与应用。
背景技术：
由于在农业生产中的秸秆还田、机械跨区作业、高密度密度栽培等人为因素，为土壤有害生物的积累、远距离传播、滋生蔓延创造了非常有利的条件。近年来，小麦全蚀病、纹枯病、根腐病、茎基腐病在小麦主产区普遍发生，而且逐年加重。土传病害已经对小麦生产构成严重威胁，但人们可资利用的防治手段极为有限。农药、化肥不合理使用，造成作物药害、品质下降、残留超标、农业生态环境遭到破坏。
土壤主要由矿物质、有机质和微生物三大部分组成，土壤微生态区系的微生物的活性大小，对植物根部营养非常重要，因为土壤中的有益微生物直接参与土壤肥力的形成，包括土壤中物质和能量的转化、腐植质的形成和分解、养分的释放、氮素的固定等。但纯自然状态下有益微生物数量不够，作用力也有限。因此，采用“人为方式”向土壤中增加有益微生物数量，就能够增强土壤中微生物的数量和整体活性，从而明显提高土壤的肥力。
微生物菌肥是根据土壤微生态学原理、植物营养学原理、以及现代“有机农业”的基本概念而研制出来的。微生物肥料是以活性（可繁殖）微生物的生命活动导致作物得到所需养分的一种新型肥料生物制品，在农业生产中被称为第三代肥料。
然而，当前的生物有机肥多是从提高土壤肥力的角度考虑的，而生物有机肥在兼具抗病促生方面鲜有报道或可实用化的产品推出。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种兼具抗病促生作用的生物有机肥及其制备方法与应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
设计一种兼具抗病促生作用的生物有机肥，该生物有机肥含枯草芽孢杆菌cgmccno.6498（参见专利文献cn103074271a）菌液、腐殖酸和草炭；所述枯草芽孢杆菌cgmccno.6498菌液、腐殖酸和所述草炭的重量比为：0.1～5：10：85～89.9。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌菌液的有效活菌数为3～5亿/克。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌菌液的制备方法为：
（1）培养皿培养：将枯草芽孢杆菌cgmccno.6498接种固体培养基，在28～32℃下，培养32～48小时；
（2）一级种子培养：将步骤（1）培养的菌种接种液体培养基，在24～37℃下，培养20～24小时，制得一级种子；所述液体培养基的初始ph值为7.0～7.2；
（3）二级种子培养：按体积比为1～6％的接种量将所述一级种子接种到发酵罐中，曝气，培养28～40小时，制得二级种子；
（4）发酵培养：按体积比为1～6％的接种量将所述二级种子接种到发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得该菌种的菌悬液；
（5）浓缩菌液。
优选的，所述液体培养基的配方为：玉米粉10g，葡萄糖5g，豆饼粉15g，鱼粉5g，caco35g，(nh4)2so41g，k2hpo40.3g，mgso4·7h2o0.2g，水1000ml。
兼具抗病促生作用的生物有机肥的制备方法，包括以下步骤：
向枯草芽孢杆菌cgmccno.6498菌液中加入细度为55～65目、有机质含量为35～45%的草炭，再添加腐殖酸，造粒或制粉剂，在70～90℃下烘干，即得。
所述的兼具抗病促生作用的生物有机肥在小麦抗病促生中的应用。
优选的，该生物有机肥在小麦抗病促生中的应用施用方法为：播种前整地时撒施和/或播种时与麦粒同播。
所述的兼具抗病促生作用的生物有机肥在花生、辣椒、白菜等陆地作物抗病促生中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1.本发明的生物有机肥在防治小麦根部病害的同时能够改善土壤肥力，活化改良土壤，消除板结，环保无污染。
2.本发明的生物有机肥可提高小麦抗病能力，可促生增加小麦产量，可促进植物根系生长，增强根系吸收能力。
3.本发明开发的生物有机肥环境友好，能够实现作物抗病促生、病害绿色防控，能够提升农产品质量安全和保护农业生态安全。
4.本发明的生物有机肥生产成本低廉，从源头上降低化肥农药使用量，能够减少农药残留风险，引导绿色防控，提升农产品国际竞争力，易推广普及。
5.本发明通过生物有机肥合理施用，减少化肥农药的施用，不仅合理促进农业和经济的发展，而且对保障国家粮食安全，维护社会稳定具有重要意义。
附图说明
图1为生物有机肥对小麦叶部防御相关酶的诱导作用分析图；
图2为生物有机肥对小麦根部防御相关酶的诱导作用分析图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一：生物有机肥的制备
1.生物有机肥中微生物菌株为枯草芽孢杆菌cgmccno.6498（参见专利文献cn103074271a）。
2.枯草芽孢杆菌的培养包括以下步骤：
（1）培养皿培养：将枯草芽孢杆菌cgmccno.6498在无菌条件下接种于固体培养基上，在30℃下，培养36小时；
（2）一级种子培养：将步骤（1）培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，初始ph值为7.0～7.2，在30℃下，培养20～24小时，制得一级种子；
其中，液体培养基的配方为：玉米粉10g，葡萄糖5g，豆饼粉15g，鱼粉5g，caco35g，(nh4)2so41g，k2hpo40.3g，mgso4·7h2o0.2g，水1000ml。
（3）二级种子培养：按液体培养基的体积比为2％的接种量将步骤（2）所得一级种子接种到发酵罐中，曝气，培养36小时，制得二级种子；
（4）发酵培养：按液体培养基的体积比为2％的接种量将步骤（3）所得二级种子接种到发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得该菌种的菌悬液；
（5）浓缩至菌液的有效活菌数为5亿/克。
3.枯草芽孢杆菌有机肥的制备
向枯草芽孢杆菌cgmccno.6498浓缩孢子液中加入细度为60目、有机质含量为40%的草炭，再添加腐殖酸，然后造粒，在80℃下烘干，得到枯草芽孢杆菌活菌含量为3～5亿/克有机肥，其中浓缩孢子液、腐殖酸和草炭的重量比为：0.1：10：89.9。
实施例二：生物有机肥的制备
与实施例一不同之处在于，浓缩孢子液、腐殖酸和草炭的重量比为：5：10：85。
实施例三：生物有机肥的制备
与实施例一不同之处在于，浓缩孢子液、腐殖酸和草炭的重量比为：3：10：87。
实施例四：生物有机肥对小麦病原菌的抗性效应试验
（1）盆栽对小麦全蚀病的抗病试验
实验材料：生物有机肥为实施例一所述枯草芽孢杆菌cgmccno.6498有机肥，常温保存备用。小麦全蚀病菌ggt-007为河南省农业科学院实验室从小麦根部分离得到，并在本实验室保存。
小麦催芽处理：挑选大小一致的小麦种子，首先用75%乙醇处理5s，灭菌水冲洗3次，0.1%升汞消毒9min，再用无菌水冲洗5次，然后将消毒处理的小麦种子平铺于无菌平皿（直径12cm），加入5ml无菌水,放置于室温。1d后将露白的小麦种子转移至铺有无菌滤纸的平皿中（直径12cm），每皿放置约50粒种子，加入10ml无菌水，放置于室温。两天后，选取根长约为2～3cm的发芽小麦备用
接种：将上述生物有机肥与土、蛭石（3：5：2）混匀，装盆（直径10cm，高10cm），将上述催芽处理的小麦苗转移到盆中，同时接种提前培养好的小麦全蚀病菌ggt-007小米粒培养基，每株5g。对照组为土和蛭石（4：1）。每盆5株，3次重复。
在25℃下培养28d后洗根检测。待对照完全发病后检测结果计算。
小麦全蚀病苗期分级标准：
0级无病
1级变黑根面积占根总面积的1%～5%；
3级变黑根面积占根总面积的6%～20%；
5级变黑根面积占根总面积的21%～40%；
7级变黑根面积占根总面积的41%～60%；
9级变黑根面积占根总面积的61%以上。
结果如表1所示，经过生物有机肥处理的小麦苗根与对照组相比发病指数明显降低，具有显著的抗病作用。
表1生物有机肥盆栽试验病情指数
（2）盆栽对小麦茎基腐的抗病试验
试验处理与上述实施例四（1）相同，不同的是在pda上培养茎基腐病原菌假禾谷镰刀菌，待长满后，接到小麦粒培养基上25℃培养7d左右。
结果如表2所示，经过生物有机肥处理的小麦苗根与对照组相比小麦茎基腐发病指数明显降低，具有显著的抗病作用。
表2生物有机肥盆栽试验对小麦茎基腐病情指数
（3）对小麦抗病性相关基因的诱导作用
试验前期处理与上述实施例四（1）相同，72小时取小麦根提取rna，检测不同时间小麦体内防御相关基因的表达量。以rnaiso™plus（takara，大连，中国）说明书中的方法提取小麦全蚀病菌ggt-007及其侵染根部的总rna。
选取文献报道的植物抗病基因常用mapk、pr1、pr4、pod3、wrky4和lox2等6个基因作为候选抗病基因。
所用引物碱基序列如表3所示。
通过二步法普通荧光定量pcr，在steponeplus实时荧光定量pcr仪96孔板上进行，反应总体系包括：sybrpremixextaqtmⅱ（tlirnasehplus）（takara,cat.no.rr820a）12.5μl；上下游引物（10µmol/l）各1μl；cdna模板（20ng/µl）1μl；用ddh2o补齐至25μl。扩增条件：95℃30s；95℃5s，56～60℃退火30s，并收集荧光，40个循环，60℃～95℃每隔0.5℃停留0.05s生成熔解曲线。每个样品3次重复。
为了验证6个候选抗病相关基因的引物特异性，用以上二步法pcr反应的产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行检测显示，每种引物均扩增出预期大小的片段，没有出现引物二聚体，说明引物的特异性较好。6个基因在不添加生物有机肥的根系中表现出相对较低的表达，而在添加生物有机肥的根系中在72小时表达出现峰值，72h即小麦全蚀病菌ggt-007使根系发生病变的时候。以上结果表明，生物有机肥能够激发小麦水杨酸、茉莉酸信号通路，从而诱导小麦表现出抗病性。
表3引物序列
（4）对小麦叶部抗病性相关防御酶系的诱导作用
诱导抗性测定：试验前期处理与实施例四（1）相同，分别于处理后24、48、72、96、120h取小麦幼叶提取粗酶液，检测不同时间小麦叶内相关防御酶的活性变化。分别取0.1g叶片用于提取粗酶，pal、pod、sod、cat等酶活均按照酶活性试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）步骤测定。
结果如图1所示，经生物有机肥处理后，处理组的小麦叶片pal、pod、sod、cat活性均高于对照处理组。
处理组小麦叶片中pal活性明显高于对照组，并在处理后的第96h达到峰值，峰值达到46.705u/g。
处理组中的cat活性在试验期间均高于其它3组处理，且在72h达到高峰，峰值为1259.565u/g。3组处理cat活性均高于空白对照。没有进行任何处理的对照组cat活性在120h内变化不大。
pod活性处理组均呈先上升后下降的变化趋势，pod活性在24-48h急剧上升。与对照组相比pod活性显著增高，峰值是对照组的2倍左右。对照组pod活性变化范围不大。
处理组的sod酶活均在第96h达到峰值，分别为对照组的1.63倍和1.91倍，达到73.52、86.32u/g，与对照组差异显著。对照组的sod酶活在试验期间变化较小。
（5）对小麦根部抗病性相关防御酶系的诱导作用
诱导抗性测定：试验前期处理与实施例四（1）相同，分别于处理后24、48、72、96、120h取小麦根部提取粗酶液，检测不同时间小麦根部相关防御酶的活性变化。分别取0.1g根部用于提取粗酶，pal、pod、sod、cat等酶活均按照酶活性试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）步骤测定。
结果如图2所示，经生物有机肥处理后，处理组的小麦叶片pal、pod、sod、cat活性均高于对照处理组。
处理组的小麦根部pal活性均高于对照处理组。空白对照组小麦根部的pal活性活力最低，在试验期间无明显变化。在处理后的第72h达到峰值。
pod活性在24～48h急剧上升。与对照组相比pod活性显著增高，峰值是对照组的2倍左右。对照组pod活性变化范围不大。
处理组中的sod活性在试验期间均高于其它3组处理，且在第72h达到高峰，峰值为1977.04u/g。
处理组小麦根部cat活性在第96h分别达到206.241、184.518、173.46u/g峰值。与对照组相比cat活性显著增高，小麦全蚀病菌的小麦根部pod活性显著高于其它3个处理组，诱导效果最佳。
可见生物有机肥和全蚀病菌共同诱导对小麦根部抗病性具有协同增效作用。
实施例五：生物有机肥对小麦生长趋势和产量的影响
（1）盆摘对小麦促生作用
对小麦生长量的影响：试验处理与实施例四（1）相同，培养20天后分别测量株高、根长度和重量。利用microsoftexcel进行数据分析，利用spss软件进行方差分析。
结果如表4所示，经过生物有机肥处理的小麦株高和根长均明显优于对照，对小麦生物量的影响分析表明生物有机肥处理的小麦根干重和地上部分干重显著高于对照，达到极显著水平。
表4生物有机肥对小麦生长量的影响
（2）田间对小麦产量的影响
试验设于河南省农业科学院试验示范基地，小区面积30m2。试验共3个处理，生物有机肥、化肥和空白对照（不施用任何肥料），所施用化肥为复合肥（n-p2o5-k2o含量均为150g·kg-1），每个处理3次重复。调查方法为收获前采取每小区五点取样、每点调查1米双行，测平均行距（本试验统一机播，平均行距21厘米），调查小麦穗数折合亩穗数；选有代表性的不间断查20个穗计算平均穗粒数，烘干后称千粒重，打85折计算理论产量。
对小麦增产效果分析如表5所示，以生物有机肥处理效果最好，增产率15.9%，显著高于未施用肥料和复合肥处理。施用复合肥为次之增产率为11.3%。生物有机肥使小麦叶功能期延长，成熟期推迟3天，对小麦后期灌浆和千粒重提高十分有利。另外生物有机肥对环境友好，对提高小麦产量和质量具有明显的促进作用，推广前景巨大。
表5生物有机肥对小麦产量的影响
结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
sequencelisting
<110>河南省农业科学院植物保护研究所
<120>兼具抗病促生作用的生物有机肥及其制备方法与应用
<130>2017
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