一种光驱动高纯度一氧化二氮的生产方法与流程

本发明涉及一种光驱动高纯度一氧化二氮的生产方法，属于一氧化二氮生产技术领域。

背景技术：

一氧化二氮(n2o)是一种高能量、高价值的能源物质，可以作为助燃剂或者火箭氧化剂，也可以作为麻醉剂。目前n2o主要的传统生产方式是硝酸铵加热法，但该方法成本高，需要高温操作，硝酸铵对热十分敏感，易引起爆炸事故，硝酸铵是危险化学品，不利存储和运输。因此，急需开发操作简便、安全可靠、经济环保的n2o的生产方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种光驱动高纯度一氧化二氮的生产方法，可以有效解决上述问题。

本发明是这样实现的：

一种光驱动高纯度一氧化二氮的生产方法，将脱氮硫杆菌在无氧条件下培养2～9天，通过离心和重悬获得浓缩菌液，转接到含有空穴捕集剂和蒽醌类有机物的无硫源培养基中，所述无硫源培养基中含硝酸盐，在无氧条件下黑暗放置一段时间，再光照实现高纯度一氧化二氮生产。

作为进一步改进的，所述空穴捕集剂为抗坏血酸、乙醇或三乙醇胺中的一种或几种。

作为进一步改进的，所述蒽醌类有机物为蒽醌-2,6-二磺酸钠、9,10-蒽并醌-2-磺酸钠盐水合物、9,10-二氢-9,10-二氧代-2-蒽羧酸中的一种或几种。

作为进一步改进的，所述脱氮硫杆菌培养至od600nm值为0.10～0.35。

作为进一步改进的，所述空穴捕集剂在无硫源培养基中的终浓度为0.05～0.5wt％。

作为进一步改进的，蒽醌类有机物在无硫源培养基中的终浓度为2100～4000μmol/l。

作为进一步改进的，所述无硫源培养基的配方为nah2po41.0～4.0g/l，nano310.0～20.0g/l，mgcl20.5～1.5g/l，feso4溶液0.08～1.2ml/l，sl-4溶液1.0～4.0ml/l，phosphatebuffer1～10ml/l，其余为水。

作为进一步改进的，所述黑暗放置时间为8～12h。

作为进一步改进的，所述光照的光照强度范围是110～200mw/cm²，光照时的温度为25～40℃，光照时间为20～40min。

作为进一步改进的，所述离心为3000～7000r/min离心4～20min，离心温度为4～25℃。

本发明的有益效果是：

本发明光驱动高纯度一氧化二氮的生产方法以no^3-为底物，而不是传统n2o生产过程中的昂贵、危险的化学品硝酸铵，克服了传统n2o生产过程中存在的能耗大、成本高和安全系数不高等缺点。

本发明的光驱动高纯度一氧化二氮的生产方法创新性地将蒽醌类有机物的光捕集能力与细菌的快速自我繁殖、高选择性优点结合以用于高纯度n2o的生产,n2o的产率高达93.76％，可进行大规模的推广应用。

本发明的光驱动高纯度一氧化二氮的生产方法采用无硫源培养基，避免脱氮硫杆菌能利用还原性的硫化物作为电子供体产生氮气，进一步提高n2o的产率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明实施例1提供为不同菌量对脱氮硫杆菌-aqds杂化体系进行高纯度n2o生产性能的影响。

图2是本发明实施例1提供为不同浓度aqds对脱氮硫杆菌-aqds杂化体系进行高纯度n2o生产性能的影响，所采用的脱氮硫杆菌菌量均为400％。

图3是本发明实施例2提供的无黑暗放置对高纯度n2o生产性能的影响。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明实施例中所述thiobacillusdenitrificans培养基和无硫源培养基的配方分别如表1和表2所示。

表1thiobacillusdenitrificans培养基

*每升sl-4溶液中含有0.05～0.4gfeso4，120mlsl-6溶液，0.3～0.7g乙二胺四乙酸，余量为水；

***每升sl-6溶液含有0.08～0.12gzncl2·6h2o，0.003～0.010gmncl2·4h2o，0.1～0.5gh3bo3，0.3～0.6gcocl2·6h2o，0.01～0.03gcucl2·2h2o，0.01～0.03gniso4·6h2o，0.02～0.04gk2moo4·4h2o，余量为水。

***每升feso4溶液含有0.05～3mgfeso4·7h2o和1～3mlh2so4。

表2无硫源培养基

*每升磷酸盐缓冲液中含有6.8gkh2po4，291ml的0.1mol/lnaoh溶液，余量为水。

本发明提供一种光驱动高纯度一氧化二氮的生产方法，将脱氮硫杆菌在无氧条件下培养2～9天，通过离心和重悬获得浓缩菌液，转接到含有空穴捕集剂和蒽醌类有机物的无硫源培养基中，所述无硫源培养基中含硝酸盐，在无氧条件下黑暗放置一段时间，再光照实现高纯度n2o生产。脱氮硫杆菌菌株可以为购自德国微生物菌种保藏中心的thiobacillusdenitrificansatcc25259、thiobacillusdenitrificansdsm12475或thiobacillusdenitrificansjcm3870中的至少一种。

作为进一步改进的，所述空穴捕集剂为抗坏血酸、乙醇或三乙醇胺中的一种或几种。

作为进一步改进的，所述蒽醌类有机物为蒽醌-2,6-二磺酸钠、9,10-蒽并醌-2-磺酸钠盐水合物、9,10-二氢-9,10-二氧代-2-蒽羧酸中的一种或几种。此蒽醌类具有良好的光捕捉能力，利于n2o的产生。

作为进一步改进的，所述脱氮硫杆菌培养至od600nm值为0.10～0.35。此浓度下，脱氮硫杆菌处于对数生长期，代谢旺盛，有利于n2o的产生。

作为进一步改进的，所述空穴捕集剂在无硫源培养基中的终浓度为0.05～0.5wt％。蒽醌类有机物在无硫源培养基中的终浓度为2100～4000μmol/l。

作为进一步改进的，所述无硫源培养基的配方为nah2po41.0～4.0g/l，nano310.0～20.0g/l，mgcl20.5～1.5g/l，feso4溶液0.08～1.2ml/l，sl-4溶液1.0～4.0ml/l，phosphatebuffer1～10ml/l，其余为水。采用此无硫源培养基为脱氮硫杆菌的生长提供足够的生长营养，硝酸盐nano3的浓度足够高，可以作为脱氮硫杆菌的底物产生n2o，同时可以避免脱氮硫杆菌能利用还原性的硫化物作为电子供体产生氮气，提高n2o的产率。

作为进一步改进的，所述黑暗放置是将含有自养反硝化菌的无硫源培养基避光包封起来，所述黑暗放置时间为8～12h。此黑暗放置能消耗非光驱动的反消化过程，避免产生过多的氮气，从而提高n2o的产率。

作为进一步改进的，所述光照的光照强度范围是110～200mw/cm²，光照时的温度为25～40℃，光照时间为20～40min。在此光照条件下，可以保证最佳的驱动条件，驱动脱氮硫杆菌在所述无硫源培养基中能以高浓度no^3-为底物进行高纯度n2o生产。

作为进一步改进的，所述离心为3000～7000r/min离心4～20min，离心温度为4～25℃。此离心条件能够在不降低菌体活性的条件下有效分离菌体。

本发明的各个参数条件相互配合，协同作用，共同促进n2o生产。

实施例1

(1)在超净工作台中将脱氮硫杆菌菌株thiobacillusdenitrificansatcc25259(购买于德国微生物菌种保藏中心(dsmz))接种至1l的thiobacillusdenitrificans培养基中，摇匀，转移至培养箱中，37℃，厌氧生长2～9天。监测脱氮硫杆菌的od600nm值以确定细菌的生长情况。

(2)当步骤(1)中脱氮硫杆菌od600nm值为0.16时，将脱氮硫杆菌以6000r/min离心分离5min、加入50ml的生理盐水重悬浮、涡旋仪振荡，震荡时间为2～10s，重复三次后，获得含有50ml生理盐水的浓缩的脱氮硫杆菌菌液。

(3)将浓缩的脱氮硫杆菌菌液转接至含有抗坏血酸、蒽醌-2,6-磺酸钠(aqds)的无硫源培养基的厌氧瓶中，抗坏血酸、蒽醌-2,6-磺酸钠的终浓度分别为0.5wt％、3000μmol/l，通入高纯度氮气(99.99％)除去无硫源培养基中的溶解氧和顶空空气，则成功构建蒽醌-2,6-磺酸钠-脱氮硫杆菌杂化体系；

(4)将蒽醌-2,6-磺酸钠-脱氮硫杆菌杂化体系在30℃恒温条件下，黑暗放置12h后，再次通入高纯度氮气(99.99％)。

(5)利用光强为120mw/cm²的氙灯对杂化体系进行光照，杂化体系中蒽醌-2,6-磺酸钠受光激发产生光生电子，随后蒽醌-2,6-磺酸钠将光生电子传递给脱氮硫杆菌，在脱氮硫杆菌体内实现高纯度n2o生产。

(6)最后，在氙灯光照30min后，利用气相色谱检测厌氧瓶中n2o的含量。

为了分析不同菌种浓度对n2o生产的作用，设置不同的菌种浓度，如50％菌量、100％菌量、200％菌量、400％菌量、800％菌量(100％菌量为20ml浓缩菌液加入20ml无硫源培养基中，依次类推)，其对n2o生产性能的影响，如图1所示。随着菌种的浓度的提高，n2o的产量也随之升高，但是从400％菌量提高到800％菌量时，n2o产率提高不大。考虑到成本问题，则菌量为400％时，杂化体系的高纯度n2o生产性能最优。

为了分析杂化体系蒽醌类有机物蒽醌-2,6-磺酸钠在高纯度n2o生产的作用，研究了不同蒽醌-2,6-磺酸钠浓度对脱氮硫杆菌-蒽醌-2,6-磺酸钠杂化体系的高纯度n2o生产性能的影响，如图2所示，随着aqds浓度的提高，n2o的产量也随之升高，当aqds浓度为2000μmol时，在30min后n2o-n的生成量为0.13119mg，产率高达93.76％。说明本发明脱氮硫杆菌-aqds杂化体系在光照的条件下有优越的高纯度n2o生产性能。

实施例2

为了研究黑暗对n2o生产的影响，设置未经黑暗与未通氮气组、黑暗与未通入氮气组，其他操作同实施例1，如图3所示。当进行黑暗放置与通入高纯度氮气操作后，n2o的纯度为92.14％，而未经黑暗放置与通入高纯度氮气操作时，n2o的纯度为72.13％，未经黑暗放置时，n2o的纯度为70.72％。由此可知，进行黑暗放置与通入高纯度氮气操作有助于脱氮硫杆菌-aqds杂化体系进行高纯度n2o生产。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。