苹果酸-精氨酸官能化碳量子点及其制备方法和应用与流程

发明涉及一种基于精氨酸的荧光碳量子点及其制备方法及应用，特别是一种用于检测尿酸的苹果酸-精氨酸官能化碳量子点及其制备方法和应用。

背景技术：

尿酸在人体中是嘌呤的最终代谢产物，在人体尿液以及血液中，尿酸含量是人体健康非常重要的指标。通常而言，在人体血液中尿酸的正常浓度应该为：成年男性237.9～356.9μmol/l，女性178.4～297.4μmol/l。当尿酸的生成量和排泄量不平衡时，其尿酸的氧化产物嘌呤碱就会发生代谢紊乱，从而导致高尿酸症、痛风，如肾脏损伤、白血病、高血压、糖尿病以及高尿酸症等。因此，在生命科学和临床医学中尿酸检测是十分重要的。

荧光碳量子点就是以荧光物质作为指示剂，并在一定波长光的激发下使指示剂产生荧光，通过检测所产生的荧光实现对被检测物质的定性或者定量分析。荧光探针具有灵敏度高，选择性好，使用方便，成本低，不需预处理，不受外界干扰等优点。特别是在分子生物学、生物化学、医学等领域中有较广泛的应用。

尽管在过去几年中已经报道了各种分析技术，例如电化学(伏安法，电化学发光，表面等离子共振法)，色谱法(液相和气相)，光散射法，酶分析法，流动柱化学发光法，同位素稀释质谱法，毛细管电泳法和比色法等。这些方法复杂，耗时且通常需要专门的仪器。因此，仍然迫切需要一种新颖且有效得检测尿酸的方法。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于是提供了一种苹果酸-精氨酸官能化碳量子点(arg-cqd)。

本发明的目的之二在于提供该量子点的制备方法。

本发明的目的之三在于提供该苹果酸-精氨酸官能化碳量子点在检测尿酸中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下反应机理：

在室温下，l-精氨酸中的氨基具有碱性，可以与羧酸反应生成胺，dl-苹果酸中的羰基与l-精氨酸中的氨基发生缩合酰化反应，脱去水，生成荧光碳量子点。

根据上述反应机理，本发明采用如下技术方案：

一种苹果酸-精氨酸官能化碳量子点，其特征在于该苹果酸-精氨酸官能化碳量子点为粒径为3～8nm的球形纳米粒子，其表面包裹着羰基与氨基助色发光官能团。

一种制备上述的苹果酸-精氨酸官能化碳量子点的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将dl-苹果酸、l-精氨酸按2:3的摩尔比溶于去离子水中进行加热反应，反应温度为180～200℃，时间为1～4h，反应完全后冷却，得到黄色透明碳点溶液；将该黄色透明碳点溶液进行离心分离，取离心液；将该离心液进行透析，收集透析袋内物质，冷冻干燥后得到碳点冻干粉末，即为苹果酸-精氨酸官能化碳量子点。

上述的离心分离时的温度为室温，转速为12000r/min，离心时间为5min。

上述的透析的微孔滤膜采用标准孔径为0.22μm的微孔滤膜。

上述的透析过程采用的透析袋，截留分子量为3500d。

一种上述的苹果酸-精氨酸官能化碳量子点在尿酸检测中的应用。

上述的苹果酸-精氨酸官能化碳量子点在尿酸检测中的应用，其特征在于所述的检测的具体方法为：

a.取2μl制备的碳点原液加入到离心管中，并用pbsph＝7.0缓冲溶液稀释至2ml，摇匀后置于比色皿中静置5min，用荧光分光光度计在200～700nm范围内进行测试，激发和发射狭缝宽度均为5.0nm，测定碳点/尿酸混合溶液在360nm激发下514nm波长处的荧光强度，记为f0；

b.取一系列浓度范围为0～0.8mm的相同体积的尿酸标准溶液，并分别加入2μl制备的苹果酸-精氨酸官能化碳量子点原液(1μl/1ml)，并用pbsph＝7.0缓冲溶液稀释至2ml作为碳点/尿酸混合溶液，摇匀后置于比色皿中静置5min，用荧光分光光度计在200～700nm范围内进行测试，激发和发射狭缝宽度均为5.0nm，测定含不同浓度碳点/尿酸混合溶液在360nm激发下514nm波长处的荧光强度，记为f514；

c.根据荧光强度的变化值，计算出加入尿酸前后碳点/尿酸混合溶液荧光强度的变化值与尿酸浓度的线性关系，其中变化值为δf＝(f514–f0)/f0，得到线性方程为：[(f514–f0)/f0]²＝34.33165c–23.64269，c为尿酸的浓度，即得到尿酸检测工作曲线；

d.另取2μl制备的碳点原液加入到离心管中，再加入待测样品，并用pbsph＝7.0缓冲溶液稀释至2ml作为碳点/尿酸混合溶液，加入待测夜，摇匀后置于比色皿中静置5min，测定待测液在360nm激发下514nm波长处荧光强度的变化值，根据步骤c的线性关系，计算出待测样品中尿酸的质量或浓度。

本发明采用水热合成法制备基于精氨酸的碳量子点呈绿色荧光，峰值为514nm。所得碳量子点表面含有大量氨基与水中尿酸的羰基之间的静电相互作用，导致尿酸和arg-cqd之间发生电荷转移，产生荧光增强效应，从而实现对尿酸的定量检测。本发明所提供的arg-cqd具有优异的荧光稳定性，在ph＝5～10的范围内荧光无明显变化，从而扩大了尿酸检测的ph范围。所述arg-cqd的荧光强度随尿酸的浓度升高而升高，在0～0.8mm范围内呈现线性响应，检测限约7.14μm。

本发明还提供一种尿酸检测方法，其采用如上所述的制备方法制得的碳点荧光探针进行尿酸检测，碳点荧光增强后的荧光强度与待检测的人体血液尿酸的浓度呈线性相关，通过测量碳点荧光增强后的荧光强度推算出待检测的人体血液中尿酸的浓度。

采用此方法对实际样品(人体血液)中尿酸的检测来进一步考察方法的实用性。ua检测极限计算为7.14μm(s/n＝3)。arg-cqd的反应性和选择性表明该点对ua具有灵敏的响应，并且对干扰物质具有出色的抗干扰性能，这意味着arg-cqd可用于实时检测ua。

本发明利用碳点表面的氨基有一对孤对电子，容易给电子共轭效应的特点，所述碳量子点表面含有大量氨基与水中尿酸的羰基之间的静电相互作用，导致尿酸和arg-cqd之间发生电荷转移，致使荧光增强效应，从而实现对尿酸的快速定量检测。通过本发明的方法，该探针可以对尿酸进行特异性检测并且应用在实际尿样中。与其它检测尿酸的荧光碳量子点相比，具有简单，快速，成本低等特点，对现存的尿酸检测问题具有重大的现实意义。

附图说明

图1是arg-cqd的合成和ua的检测方案流程图。

图2(a)arg-cqd的20nmtem；(b)5nmtem和hrtem(插图)图像。

图3(a)arg-cqd(1μl/1ml)的荧光激发和发射光谱(插图：arg-cqd的照片(上)和荧光照片(下))；(b)在360nm激发下arg-cqd的cie1931色度图。

图4是arg-cqd(1μl/1ml)在不同激发波长下的荧光发射光谱。

图5是arg-cqd的傅立叶红外光谱图(ftir)。

图6是(a)arg-cqd的全范围xps光谱；(b)高分辨率c1sxps光谱；(c)高分辨率的n1sxps光谱；(d)高分辨率o1sxps光谱。

图7是(a)与其他化合物(λex＝360nm)混合的arg-cqd(1.2μl/2ml)的荧光发射光谱变化和(b)荧光系数((f-f0)/f0)。

图8是荧光发射光谱图和荧光因子与尿酸浓度之间的线性关系图。(a)是ua-浓度为0至0.8mm(λex＝360nm)的arg-cqd(1μl/4ml)的荧光发射光谱；(b)荧光因子(f-f0)/f0与尿酸浓度之间的线性关系。

图9为表1：ua检测人血清白蛋白的结果。

具体实施方式

实施例1：

arg-cqd的制备方法，具体步骤如下：

(1)在室温(25℃)中，首先将dl-苹果酸(1g,7.46mmol)，精氨酸(1.95g,11.19mmol)，去离子水(10ml)充分混合搅拌放入250ml圆底烧瓶中，对混合溶液进行超声处理30分钟；

(2)在上述步骤(1)的溶液，在平行合成仪中连续搅拌并将混合物保持在195℃的恒定加热温度下，并在2小时后停止加热；

(3)在上述步骤(2)的溶液中，混合物反应完成后冷却至室温(25℃)，此时为粘稠性流体，加入5ml去离子水稀释，然后用1mmnaoh溶液将其ph值调节至7.0；

(4)在上述步骤(3)的溶液中，将其反应液离心(12000r/min)分离后收集上清液，用孔径为0.22μm的过滤膜过滤分离，过滤并除去杂质后，超声震荡20min；

(5)在上述步骤(4)的溶液中，用分子量为3500da的透析袋透析48h以除去过量的盐；

(6)在上述步骤(5)的溶液中得到黄色透明溶液，将样品置于波长为365nm的紫外光下呈绿色荧光，最终的溶液储存在4℃的冰箱中，以备以后液体检测使用。一部分样品在冷冻干燥机下冷冻干燥24h，得到最终产物为黄色轻质片状薄片。

实施例2：

本发明的于苹果酸-精氨酸官能化碳量子点荧光光谱法检测尿酸含量的方法，包括以下步骤：

(1)取2μl制备的碳点原液(1μl/1ml)加入到离心管中，并用pbsph＝7.0缓冲溶液稀释至2ml作为碳点/尿酸混合溶液，摇匀后置于比色皿中静置5min，用荧光分光光度计在200～700nm范围内进行测试，激发和发射狭缝宽度均为5.0nm，测定碳点/尿酸混合溶液在360nm激发下514nm波长处的荧光强度，记为f0；

(2)取2μl制备的碳点原液加入到离心管中，再加入不同浓度尿酸溶液，并用pbsph＝7.0缓冲溶液稀释至2ml作为碳点/尿酸混合溶液，摇匀后置于比色皿中静置5min，用荧光分光光度计在200～700nm范围内进行测试，激发和发射狭缝宽度均为5.0nm，按照步骤(1)的方法测定含不同浓度碳点/尿酸混合溶液在360nm激发下514nm波长处的荧光强度，记为f514。根据荧光强度的变化值，计算出加入尿酸前后碳点/尿酸混合溶液荧光强度的变化值与尿酸浓度的线性关系，其中变化值为δf＝(f514–f0)/f0；

(3)根据步骤(2)的线性关系，线性方程为：[(f514–f0)/f0]²＝34.33165c–23.64269(r²＝0.99451)，ua检测极限计算为7.14μm(s/n＝3)。arg-cqd的反应性和选择性表明该点对ua具有灵敏的响应，并且对干扰物质具有出色的抗干扰性能，这意味着arg-cqd可用于实时检测ua。

结果显示，实施例1中以苹果酸与精氨酸用水热合成法制备的碳点，加入不同浓度尿酸后，碳点/尿酸混合溶液的荧光信号出现显著增强现象，详见图8。在0～800μm浓度范围内，碳点/尿酸混合溶液的荧光信号强度的增加值呈现良好的线性关系，其检出限为7.1μm(图8)。此碳点比许多先前方法制得的碳点具有更宽的光谱，且线性范围广，表明本方法具有良好的分析性能。

实施例3：对比例

(1)取相同浓度下的三磷酸腺苷(atp)，二磷酸腺苷(adp)，单磷酸腺苷(amp)、尿酸(ua)、l-半胱氨酸(cys)、还原型l-谷胱甘肽(gsh)、胆固醇(cholesterol)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)药品配置成1mm标准溶液待用；

(2)取2μl制备的碳点原液(1μl/1ml)加入到离心管中，再分别加入(1)步骤所配置的溶液，并用pbsph＝7.0缓冲溶液稀释至2ml作为碳点/其他分子混合溶液，摇匀后置于比色皿中静置5min，用荧光分光光度计在200～700nm范围内进行测试，激发和发射狭缝宽度均为5.0nm，测定碳点/其他分子混合溶液在360nm激发下514nm波长处的荧光强度，详情见图7；

(3)建立的各种小分子化合物与不同的荧光强度对比柱状关系图。

实施例4：

将实施例1的arg-cqd碳点样品进行透射电子显微镜表征，结果如图2所示，tem图像显示arg-cqd的直径分布在3～8nm范围内，分散性良好。

采用溴化钾固体压片的方法制作样品，由傅立叶变换红外光谱仪记录红外光谱图，范围是400～4000cm^-1，实验测得碳点的红外光谱图如图5所示。从图中可以看出，在1389.94和3170.77cm^-1处的峰为n-h拉伸振动，表明氮掺杂的arg-cqd中存在氨基。光谱中的宽吸收带集中在清晰可见的3369.76cm^-1处，这是o-h羧基拉伸振动。综合来看，红外谱图的吸收峰表明的arg-cqd表面富含氨基和羰基官能团。

实施例5：

为了评估arg-cqd的实用性，使用arg-cqd碳量子点检测从医院(中国上海)获得的人血清样品中的ua水平。通过0.22μm膜过滤血清，并以12000r/min离心5分钟以去除所有沉淀基质。用pbs缓冲液(ph＝7.0)以1:1000(v/v)的比例稀释样品，并将样品等分试样加入含有不同浓度ua的标准溶液中，通过自动生化分析仪分析每个样品中的ua浓度以参照对比。如表1所示，在9个人体血清样品中，本发明与生化仪测试得到的曲线相关度非常高，回收率为98.5％～101.5％，并且每个样品三个重复测量的相对标准偏差(rsd)均低于0.058％。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例子的限制，上述实施例子和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都列入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书等文件界定。