一种碳点纳米制剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于纳米医药及其制备技术领域，具体涉及一种碳点纳米制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

微波消融(mwa)在肝细胞癌消融中备受关注，但是微波消融治疗后的复发和转移仍是一个挑战。相关技术表明，3年复发率高达25.8％，5年复发率更高。常规通过调节免疫系统攻击肿瘤细胞的癌症免疫治疗有望减少mwa治疗后的复发和转移，因为mwa可以溶解肿瘤细胞，释放含有肿瘤相关抗原的肿瘤细胞片段，可以用于癌症疫苗接种。然而，相关技术表明mwa治疗诱导的免疫应答不足以有效抑制肿瘤的生长和转移，这是因为抗原呈递细胞(apcs)如树突状细胞(dcs)中抗原的内化和呈递不足。因此，mwa治疗后，迫切需要能够增强apcs抗原提呈的新策略，以获得强健的免疫应答，抑制hcc复发。

纳米碳点是碳纳米材料家族的新成员，近年来在国内外受到广泛关注。与传统的荧光染料和半导体量子点发光材料相比，碳点不仅具有优异的光学性能及尺寸效应，且具有制备成本低廉、生物相容性好、易于官能化、能带结构可调等优势。

最近，有相关技术表明，使用纳米颗粒为基础的光动力疗法/光热疗法/放射疗法结合免疫佐剂进行原位免疫接种可诱导有效的抗肿瘤免疫应答。

相关技术中公开了一种核-壳结构的金簇-碳点纳米颗粒及其制备方法和应用。该技术方案中通过利用贵金属纳米团簇具有的催化性能与碳点纳米颗粒结合，经过各种化学成分之间的化学键的结合，以及各种氧化还原反应等获得一种产物，该产物可以用于进行肿瘤的治疗。首先该产品是用于起治疗作用的，其次该技术方案中的各种化学制备方法较为繁杂，所选取的原料为贵金属，对于制备的成本高，工艺流程并不简单。

碳点表面有丰富的羟基、羧基等官能团，这些官能团提供了特定的区域，能够有效地与rna、蛋白质等生物分子结合。而且碳点可以特异性地与大型中性氨基酸转运体1结合，并在体内诱导有效的癌症抑制。碳点通常由多种前体合成，包括多种糖类。

碳点(cds)基于其易于合成、化学惰性、生物相容性和荧光性等特点，在生物医学应用中受到越来越多的关注。而近年来的许多研究表明，纳米颗粒表面的糖修饰可以特异性靶向抗原提呈细胞。

因此，对于将碳点纳米联合微波消融获得一种产品，该产品不仅无需大量成本的付出，而且制备的方案工艺简单，同时其能够有效的减少肝癌复发的概率。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种碳点纳米制剂及其制备方法和应用。

本发明所采用的技术方案为：一种碳点纳米制剂，所述制剂主要由以下质量份数的原料制备得到：

甘露糖50-200份，乙二胺8-30份，无机酸4-15份，萃取剂16-60份和水100-400份。

作为优选地，所述制剂主要由以下质量份数的原料制备得到：

甘露糖80-150份，乙二胺12-23份，无机酸6-12份，萃取剂24-46份和水160-300份；

优选地，所述制剂主要由以下质量份数的原料制备得到：

甘露糖100份，乙二胺15份，无机酸8份，萃取剂30份和水200份。

作为优选地，所述无机酸包括磷酸、盐酸和硫酸中的一种或多种。

作为优选地，所述萃取剂包括有机溶剂或有机溶剂水溶液，

所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮和乙腈中的一种或多种；

所述有机溶剂水溶液包括甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液和乙腈水溶液中的一种或多种。

一种碳点纳米制剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

制备上清液a：按照相应比例选取甘露糖溶于乙二胺中，加入无机酸，搅拌、冷却、加溶剂混匀后离心，收集上清液a；

制备上清液b：在上清液a中加萃取剂进行离心，收集上清液b；

制备中间产物ⅰ：去除上清液b中残留的乙二胺和萃取剂后获得中间产物ⅰ；

制备成品：利用高分子分离膜装载获得的中间产物ⅰ并放于水中进行透析，反应完成后，获得成品。

上述获得的成品是包覆在高分子分离膜内部的产物。

作为优选地，所述制备上清液a时，搅拌时长为1-5分钟，优选为2-4分钟，进一步优选为3分钟；

所述溶剂包括去离子水；

所述溶剂的用量与乙二胺的用量的质量比为4-6:3-5；

所述离心时长为10-30分钟，优选为12-25分钟，进一步优选为15-20分钟；

所述离心时温度为15-30摄氏度，优选为20-28摄氏度，进一步优选为25摄氏度。

作为优选地，所述制备上清液b时，萃取剂的用量与乙二胺的用量的质量比为2-5:1-3；

所述离心时长为10-30分钟，优选为12-25分钟，进一步优选为15-20分钟；

所述离心时温度为15-30摄氏度，优选为20-28摄氏度，进一步优选为25摄氏度。

作为优选地，所述制备备用物ⅰ时，所述高分子分离膜包括反渗透膜、超过滤膜、微孔过滤膜、离子交换膜、有机液体透过蒸发膜、动力形成膜、镶嵌带电膜、液体膜、透析膜和生物医学用膜中的一种或多种；

优选为，所述高分子分离膜包括微孔过滤膜。

作为优选地，所述制备成品时，反应完成时长为10-18小时，优选为11-15小时，进一步优选为12小时；

所述干燥温度为零下50摄氏度-零下100摄氏度，优选为零下60摄氏度-零下80摄氏度，进一步优选为零下70摄氏度；

所述干燥时长为1-3小时，优选为1.5-2.5小时，进一步优选为2小时。

一种碳点纳米制剂的应用，采用权利要求1-2任一所述的一种碳点纳米制剂的成品在抗肿瘤免疫反应药品中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种碳点纳米制剂，该碳点纳米制剂是通过利用甘露糖作为碳点基板，乙二胺作为热源，为葡萄糖反应提供能量，之后经过萃取剂富集目标产物后，利用高分子分离膜与超纯水之间浓度的不同完成透析后，进而得到粒径均一的成品。将该产品注射入肿瘤内后，甘露糖衍生的碳点成品(man-cds)可有效捕获损伤相关分子模式、钙网蛋白和多种组蛋白等和肿瘤相关抗原，并有针对性地将这些信号传递给树突状细胞(dcs)。损伤相关分子模式、钙网蛋白和多种组蛋白等增强了树突状细胞(dcs)的激活，增强了它们处理和呈递肿瘤抗原的能力，树突状细胞将抗原呈递给t细胞，t细胞完成肿瘤细胞的杀伤。该碳点纳米制剂的制备过程简捷，产率高，节能环保，在降低成本、减少繁杂工艺的基础上，促使各原料之间反应达到充分融合，继而促使该碳点纳米制剂具有较强的免疫反应，能够用于抗肿瘤免疫反应方面。

附图说明

图1是本发明实施例2制备得到的产品的透射电子显微镜的示意图；

图2是本发明实施例制2备得到的产品的动态光散射的测定示意图；

图3是本发明实施例2制备得到的产品的红外光谱检测的示意图；

图4是本发明实施例2制备得到的产品与根据实施例2制备方法制备的实验方案1中的碳点和肿瘤裂解液预孵育后与树突状细胞共培养的流式细胞术检测示意图；

图5是本发明实施例2制备得到的产品与根据实施例2制备方法制备的实验方案1中的碳点和肿瘤裂解液预孵育后与树突状细胞共培养的流式细胞术检测示意图；

图6是本发明实施例2制备得到的产品与根据实施例2制备方法制备的实验方案2中的碳点和肿瘤裂解液预孵育后与树突状细胞共培养，il-6的表达水平elisa检测示意图；

图7是本发明实施例2制备得到的产品与根据实施例2制备方法制备的实验方案2中的碳点和肿瘤裂解液预孵育后与树突状细胞共培养，tnf-α的表达水平elisa检测示意图；

图8是本发明实施例2制备得到的产品与根据实施例2制备方法制备的实验方案2中的碳点和肿瘤裂解液预孵育后与树突状细胞共培养，il-1β的表达水平elisa检测示意图；

图9是对照组检测成熟树突状细胞表达水平的流式等高线示意图；

图10是葡萄糖衍生碳点联合微波消融治疗组检测成熟树突状细胞表达水平的流式等高线示意图；

图11是蔗糖衍生碳点联合微波消融治疗组检测成熟树突状细胞表达水平的流式等高线示意图；

图12是半乳糖衍生碳点联合微波消融治疗组检测成熟树突状细胞表达水平的流式等高线示意图；

图13是乳糖衍生碳点联合微波消融治疗组检测成熟树突状细胞表达水平的流式等高线示意图；

图14是甘露糖衍生碳点联合微波消融治疗组检测成熟树突状细胞表达水平的流式等高线示意图；

图15是实验例中实验对象小鼠原发肿瘤生长曲线示意图；

图16是实验例中实验对象小鼠远端肿瘤生长曲线示意图；

图17是实验例中实验对象小鼠体重变化示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：

一种碳点纳米制剂的制备方法，制备方法包括如下步骤：

制备上清液a：按照相应比例选取甘露糖(man)50mg溶于乙二胺8ml中，加入磷酸4ml，搅拌1分钟、冷却、加去离子水11ml混匀后在11000rpm、15摄氏度下离心10分钟，收集上清液a；

制备上清液b：在上清液a中加甲醇16ml，在11000rpm、15摄氏度下离心10分钟，收集上清液b；

制备中间产物ⅰ：利用旋转蒸发的方式去除上清液b中残留的乙二胺和甲醇后获得中间产物ⅰ；

制备成品：利用反渗透膜装载获得的中间产物ⅰ并放于超纯水100ml中进行透析，反应10小时后完成，获得成品。

上述实施例获得的成品为液体制剂，其在实际实施过程中会将成品在零下50摄氏度进行冷冻干燥1小时后，获得便于包装及运输的产品。

实施例2：

一种碳点纳米制剂的制备方法，制备方法包括如下步骤：

制备上清液a：按照相应比例选取甘露糖(man)200mg溶于乙二胺30ml中，加入盐酸15ml，搅拌5分钟、冷却、加去离子水28ml混匀后在11000rpm、30摄氏度下离心30分钟，收集上清液a；

制备上清液b：在上清液a中加乙醇60ml，在11000rpm、30摄氏度下离心30分钟，收集上清液b；

制备中间产物ⅰ：利用旋转蒸发的方式去除上清液b中残留的乙二胺和乙醇后获得中间产物ⅰ；

制备成品：利用超过滤膜装载获得的中间产物ⅰ并放于超纯水400ml中进行透析，反应18小时后完成，获得成品。

上述实施例获得的成品为液体制剂，其在实际实施过程中会将成品在零下100摄氏度进行冷冻干燥3小时后，获得便于包装及运输的产品。

实施例3：

一种碳点纳米制剂的制备方法，制备方法包括如下步骤：

制备上清液a：按照相应比例选取甘露糖(man)80mg溶于乙二胺12ml中，加入硫酸6ml，搅拌2分钟、冷却、加去离子水16ml混匀后在11000rpm、20摄氏度下离心12分钟，收集上清液a；

制备上清液b：在上清液a中加丙酮24ml，在11000rpm、20摄氏度下离心12分钟，收集上清液b；

制备中间产物ⅰ：利用旋转蒸发的方式去除上清液b中残留的乙二胺和丙酮后获得中间产物ⅰ；

制备成品：利用微孔过滤膜装载获得的中间产物ⅰ并放于超纯水160ml中进行透析，反应18小时后完成，获得成品。

上述实施例获得的成品为液体制剂，其在实际实施过程中会将成品在零下60摄氏度进行冷冻干燥1.5小时后，获得便于包装及运输的产品。

实施例4：

一种碳点纳米制剂的制备方法，制备方法包括如下步骤：

制备上清液a：按照相应比例选取甘露糖(man)150mg溶于乙二胺23ml中，加入磷酸12ml，搅拌4分钟、冷却、加去离子水27ml混匀后在11000rpm、28摄氏度下离心25分钟，收集上清液a；

制备上清液b：在上清液a中加乙腈46ml，在11000rpm、28摄氏度下离心25分钟，收集上清液b；

制备中间产物ⅰ：利用旋转蒸发的方式去除上清液b中残留的乙二胺和乙腈后获得中间产物ⅰ；

制备成品：利用离子交换膜装载获得的中间产物ⅰ并放于超纯水300ml中进行透析，反应15小时后完成，获得成品。

上述实施例获得的成品为液体制剂，其在实际实施过程中会将成品在零下80摄氏度进行冷冻干燥2.5小时后，获得便于包装及运输的产品。

实施例5：

一种碳点纳米制剂的制备方法，制备方法包括如下步骤：

制备上清液a：按照相应比例选取甘露糖(man)100mg溶于乙二胺15ml中，加入磷酸8ml，搅拌4分钟、冷却、加去离子水27ml混匀后在11000rpm、28摄氏度下离心25分钟，收集上清液a；

制备上清液b：在上清液a中加甲醇水溶液30ml，在11000rpm、28摄氏度下离心25分钟，收集上清液b；

制备中间产物ⅰ：利用旋转蒸发的方式去除上清液b中残留的乙二胺和甲醇水溶液后获得中间产物ⅰ；

制备成品：利用离子交换膜装载获得的中间产物ⅰ并放于超纯水200ml中进行透析，反应15小时后完成，获得成品。

上述实施例获得的成品为液体制剂，其在实际实施过程中会将成品在零下80摄氏度进行冷冻干燥2.5小时后，获得便于包装及运输的产品。

实施例6：

一种碳点纳米制剂的制备方法，制备方法包括如下步骤：

制备上清液a：按照相应比例选取甘露糖(man)100mg溶于乙二胺15ml中，加入磷酸8ml，搅拌4分钟、冷却、加去离子水27ml混匀后在11000rpm、28摄氏度下离心25分钟，收集上清液a；

制备上清液b：在上清液a中加乙醇水溶液30ml，在11000rpm、28摄氏度下离心25分钟，收集上清液b；

制备中间产物ⅰ：利用旋转蒸发的方式去除上清液b中残留的乙二胺和乙醇水溶液后获得中间产物ⅰ；

制备成品：利用透析膜装载获得的中间产物ⅰ并放于超纯水200ml中进行透析，反应15小时后完成，获得成品。

上述实施例获得的成品为液体制剂，其在实际实施过程中会将成品在零下80摄氏度进行冷冻干燥2.5小时后，获得便于包装及运输的产品。

实施例7：

一种碳点纳米制剂的制备方法，制备方法包括如下步骤：

制备上清液a：按照相应比例选取甘露糖(man)100mg溶于乙二胺15ml中，加入磷酸8ml，搅拌4分钟、冷却、加去离子水27ml混匀后在11000rpm、28摄氏度下离心25分钟，收集上清液a；

制备上清液b：在上清液a中加丙酮水溶液30ml，在11000rpm、28摄氏度下离心25分钟，收集上清液b；

制备中间产物ⅰ：利用旋转蒸发的方式去除上清液b中残留的乙二胺和丙酮水溶液后获得中间产物ⅰ；

制备成品：利用透析膜装载获得的中间产物ⅰ并放于超纯水200ml中进行透析，反应15小时后完成，获得成品。

上述实施例获得的成品为液体制剂，其在实际实施过程中会将成品在零下80摄氏度进行冷冻干燥2.5小时后，获得便于包装及运输的产品。

实施例8：

一种碳点纳米制剂的制备方法，制备方法包括如下步骤：

制备上清液a：按照相应比例选取甘露糖(man)100mg溶于乙二胺15ml中，加入磷酸8ml，搅拌4分钟、冷却、加去离子水27ml混匀后在11000rpm、28摄氏度下离心25分钟，收集上清液a；

制备上清液b：在上清液a中加乙腈水溶液30ml，在11000rpm、28摄氏度下离心25分钟，收集上清液b；

制备中间产物ⅰ：利用旋转蒸发的方式去除上清液b中残留的乙二胺和乙腈水溶液后获得中间产物ⅰ；

制备成品：利用微孔过滤膜装载获得的中间产物ⅰ并放于超纯水200ml中进行透析，反应15小时后完成，获得成品。

上述实施例获得的成品为液体制剂，其在实际实施过程中会将成品在零下80摄氏度进行冷冻干燥2.5小时后，获得便于包装及运输的产品。

上述各实施例中在具体实施过程中，制备上清液a时，将甘露糖溶于乙二胺并加入磷酸，经搅拌获得甘露糖碳化物(为黄色沉淀)时，方可进行冷却及后续的加入去离子水进行混匀的流程。

上述各实施例在具体实施过程中，制备备用物ⅰ中，去除上清液b中残留的乙二胺和萃取剂时，采用真空下旋蒸装置的方式进行去除。

上述实施例在实际操作过程中，选用的旋蒸设备包括真空浓缩旋蒸仪，规格型号：tqg，生产厂商：温州工大轻工机械有限公司。关于上述旋蒸设备的型号选用及生产厂商等的选用可根据具体实施过程中的实际环境及实际的要求进行相对应的设定。凡是能够实现旋蒸且对成品成分不影响的,均属于本发明的保护范围。

上述所有实施例在实际操作过程中，选用的搅拌装置包括三维运动混合机，不锈钢材质，规格型号为syh-30、syh-1000，生产厂家：江阴市和荣机械有限公司。对于搅拌装置的选用并不仅限于上述提供的，凡是能够完成相应的搅拌工作，同时对原材料无影响的装置均属于本发明的保护范围。

上述实施例在实际操作过程中，选用的冷冻干燥装置包括真空冷冻干燥机，为不锈钢材质，规格型号为fd-1a-50，生产厂家：江苏天翎仪器有限公司。对于冷冻干燥装置的选用并不仅限于上述提供的，凡是能够完成相应的冷冻干燥工作的装置均属于本发明的保护范围。

上述实施例在实际操作过程中，选用的离心装置包括高速离心机，为不锈钢材质，规格型号为h3-18k，最大容量100ml*4，最大转速18500rpm。生产厂家：苏州威尔实验用品有限公司。对于离心装置的选用并不仅限于上述提供的，凡是能够完成相应的离心工作的装置均属于本发明的保护范围。

实验例

树突状细胞(dcs)在先天免疫和适应性免疫的启动和调节中发挥着重要作用。而成熟的树突状细胞，其共同刺激受体表达上调和细胞因子分泌增强，在抗原加工和表达方面表现出优越的能力。

实验目的：使用模拟微波消融治疗条件来观察各种碳点是否能吸收肿瘤裂解液并诱导树突状细胞(dcs)成熟。

实验方法：透射电子显微镜的测定方法是通过将样品粉末与超纯水混合，浓度为1mg/ml，用超声波振动成悬浮液，将悬浮液滴于附有支持膜的铜网上，待液体挥发后即可观察。

动态光散射的测定方法是通过将样品粉末与超纯水混合，浓度为1mg/ml，用超声波振动成悬浮液，将悬浮液置于样品瓶中即可观察。

红外光谱检测的测定方法是通过将样品粉末与甲醇混合，浓度为1mg/ml，悬液滴于kbr片基上铺平，待溶剂挥发后生成均匀薄膜即可检测。

图1是本发明实施例2制备得到的产品的透射电子显微镜的示意图，通过透射电子显微镜测定，man-cds具有清晰的球形形貌。该示意图的标尺为20nm。

图2是本发明实施例制2备得到的产品的动态光散射的测定示意图，动态光散射(dynamiclightscattering,dls)测定，呈现均匀的粒径分布根据红外光谱检测，man-cds也有许多官能团。、

图3是本发明实施例2制备得到的产品的红外光谱检测的示意图，根据红外光谱检测，man-cds有许多官能团

实验方案1：

将不同的纳米碳点颗粒100ug/ml(glu-cds：葡萄糖衍生碳点,sug-cds：蔗糖衍生碳点,gla-cds：半乳糖衍生碳点,lac-cds：乳糖衍生碳点,man-cds：甘露糖衍生碳点)与肿瘤细胞裂解液孵育10分钟，然后用pbs(磷酸缓冲溶液)洗涤碳点不少于5次。然后将吸收了抗原的碳点与树突状细胞孵育24小时，用流式细胞术检测树突状细胞成熟标记物(cd80、cd86)。

图4、5为流式检测图，从图中可以看出吸收了肿瘤抗原的甘露糖碳点能够刺激树突状细胞(dcs)的成熟。

图4是流式细胞术检测树突状细胞成熟标记物cd80，示意图中显示吸收了肿瘤抗原的甘露糖碳点能够刺激树突状细胞(dcs)的成熟。

图5是流式细胞术检测树突状细胞成熟标记物cd86，示意图中显示吸收了肿瘤抗原的甘露糖碳点能够刺激树突状细胞(dcs)的成熟。

实验方案2：

图6、图7和图8，采用elisa法进一步研究了纳米颗粒处理的树突状细胞(dcs)细胞因子的产生水平。与其他碳点相比，man-cds(肿瘤裂解液预孵育)处理的dcs分泌了更高水平的tnf-α,il-6,il-1β。这些结果证实了肿瘤裂解液预培养的man-cds能够刺激树突状细胞(dcs)成熟，并增强抗原加工和在dcs中的呈递能力。

通过使用模拟微波消融治疗条件来观察各种碳点是否能吸收肿瘤裂解液并诱导dcs成熟。我们将不同的纳米碳点颗粒100ug/ml(glu-cds,sug-cds,gla-cds,lac-cds,man-cds)与肿瘤细胞裂解液孵育10分钟，然后用pbs洗涤碳点5次以上。然后将吸收了抗原的碳点与树突状细胞孵育24小时，elisa法检测dcs的tnf-α,il-6,il-1β分泌水平。

tnf-α是肿瘤坏死因子的一种类型。作用是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子。

il-6，是一种功能广泛的多效性细胞因子。il-6可调节多种细胞的生长与分化，具有调节免疫应答、急性期反应及造血功能，并在机体的抗感染免疫反应中起重要作用。

il-1β对多种免疫活性细胞有重要调节作用。

图6，图7和图8的示意图结果证实了肿瘤裂解液预培养的man-cds能够刺激dc成熟，并增强抗原加工和在dcs中的呈递能力。

图9、10、11、12、13、14检测方法是通过将hepa-6肿瘤细胞(1×106)注射到小鼠右侧，肿瘤大小约10x10mm时小鼠分为6组(control、mwa+man-cds、mwa+glu-cds、mwa+sug-cds、mwa+glal-cds、mwa+lac-cds)，对照组和微波消融分别联合瘤内注射碳点组，治疗三天后取肿瘤附近的腹股沟处的淋巴结，进行流式细胞术检测成熟的树突状细胞(cd80、cd86)表达水平。

图9、10、11、12、13、14为微波消融治疗和瘤内注射碳点后dcs突变标记物表达显著改善示意图。示意图显示，mwa+man-cds处理小鼠后，成熟的dcs(cd80+cd86+)比例从9.87％％显著提高至43.06％，对照组(control)和其他碳点(glu-cds、sug-cds、gla-cds、lac-cds)对dcs成熟的促进作用有限。

综上所述，mwa+man-cds在体内外均能显著诱导dcs成熟。

实验方案3：构建了双侧小鼠肿瘤模型。

首先将hepa-6肿瘤细胞(1×106)注射到小鼠右侧，形成原发肿瘤。4天后，将1×106个肿瘤细胞注射到小鼠左侧，作为远处的肿瘤。当原发肿瘤大小达到10×10mm时，在第0天和第3天给予2次mwa(微波功率5w，加热至60℃，保存1min)。每次mwa治疗后均在瘤内注射100μlman-cds(100μg/ml)。每两天测量一次原发性和远处肿瘤的生长情况。

每两天进行荷瘤小鼠体重监测。

如图15所示，小鼠原发肿瘤生长曲线图：对照(control)组，不做任何治疗，肿瘤生长很快；微波消融组(mwa)，不完全微波消融杀死肿瘤，肿瘤在逐渐减小后又有生长趋势；碳点治疗组(man-cds)肿瘤生长仅次于对照组；联合治疗组(mwa-man-cds)肿瘤逐渐缩小。联合治疗组(mwa-man-cds)治疗肿瘤效果最好。

微波消融组(mwa)的原发肿瘤大小明显小于对照组，但远端肿瘤生长与对照组相比无影响。微波消融组是一种局部治疗，虽然也会引起肿瘤相关抗原和“危险信号”的释放，但这些蛋白可能不能被抗原提呈细胞有效摄取，导致有限的抗肿瘤免疫反应。

“危险信号”是指包括损伤相关分子模式、钙网蛋白和多种组蛋白等。

如图15所示，单独使用碳点治疗组(man-cds)可显著抑制肿瘤生长，由于瘤内注射也可诱导肿瘤细胞的机械损伤和抗原的释放，因此单独使用碳点治疗组(man-cds)的抗肿瘤作用可能是由于注射部位肿瘤抗原的处理增强所致。

如图16所示，远端肿瘤生长曲线图：每组的远端肿瘤(模拟的转移瘤)不做任何治疗，观察到联合治疗组(mwa-man-cds)肿瘤生长受到抑制，其他组肿瘤生长较快。

单独使用碳点治疗组(man-cds)并不能有效抑制远处肿瘤的生长，这可能是由于注射器针头的机械损伤仅诱导有限的抗原和“危险信号”释放，免疫反应不足以抑制远处肿瘤的生长。

微波消融组(mwa)治疗和碳点治疗组(man-cds)注射的结合在原发肿瘤和远端肿瘤上都能显著抑制肿瘤生长。mwa+人-cds治疗几乎完全抑制了原发肿瘤的生长，一些小鼠甚至在远处的肿瘤中也没有肿瘤。

如图17中，未观察到每组小鼠体重明显减轻。

本发明提供了一种碳点纳米制剂，该碳点纳米制剂是通过利用甘露糖作为碳点基板，乙二胺作为热源，为葡萄糖反应提供能量，之后经过萃取剂富集目标产物后，利用高分子分离膜与超纯水之间浓度的不同完成透析后，进而得到粒径均一的成品。将该产品注射入肿瘤内后，甘露糖衍生的碳点成品(man-cds)可有效捕获损伤相关分子模式、钙网蛋白和多种组蛋白等和肿瘤相关抗原，并有针对性地将这些信号传递给树突状细胞(dcs)。损伤相关分子模式、钙网蛋白和多种组蛋白等增强了树突状细胞(dcs)的激活，增强了它们处理和呈递肿瘤抗原的能力，树突状细胞将抗原呈递给t细胞，t细胞完成肿瘤细胞的杀伤。该碳点纳米制剂的制备过程简捷，产率高，节能环保，在降低成本、减少繁杂工艺的基础上，促使各原料之间反应达到充分融合，继而促使该碳点纳米制剂具有较强的免疫反应，能够用于抗肿瘤免疫反应方面。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。