单分散羧基胶体碳的制备方法及其在新型冠状病毒抗体检测试纸的应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，特别涉及单分散羧基胶体碳的制备方法，以及使用该胶体碳为载体的新型冠状病毒抗体检测试纸。


背景技术：

2.新型冠状病毒(2019-ncov，以下简称新冠病毒)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，sars-cov-2)，是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。人首次感染新型冠状病毒后，机体的免疫系统会对病毒进行免疫防御，产生特异性的抗体。一般1-2周出现igm抗体，约4周左右产生igg抗体。新冠病毒igm/igg抗体试剂的使用，为临床提供了血清学的证据，可与核酸检测方法联合使用，从而为新冠病毒的诊断提供更全面、准确的信息。抗体检测卡还可助力新型冠状病毒(sars-cov-2)疫苗的开发，用于检测接种疫苗后体内产生抗体的情况及疫苗的效果；还可用于流行病学调查，了解人群中接触过相应的新型病毒的个体数量，帮助国家对判断和控制整体疫情情势。
3.生碳黑是一种无定形碳，作为重要的石油化工原料，广泛用于色浆、涂料、印染等领域。炭黑由于表面含氧量较低，因此亲水性不够强，在水中分散性受限，不能直接作为载体材料应用于新冠病毒的检测试纸条，需要对其进行处理后。
4.现有技术中，技术文献《水热法制备单分散羧基化胶体碳纳米颗粒》(林祥华，顺德职业技术学院学报，2020(07)，16-18、31)中公开了胶体碳纳米颗粒表面的羟基、羧基能增加纳米颗粒吸附能力，但不经过后修饰的胶体碳的空隙结构和功能化有限，其表面富含的羟基和羰基有助于表面后修饰；提到在300℃空气中氧化的方法能提升胶体碳表面的羧基含量，但能搞成本较高，羧基含量不高，稳定性和生物相容性不够好。该技术文献提供的方法是用葡萄糖和葡萄糖酸钠溶于水中超声分散，再转移到聚四氟乙烯内衬中，再放入反应釜中160℃反应4h，取出棕色或黑色溶液离心去除上清，剩余产物70℃烘干后即得成品。这种方法制备的单分散羧基化胶体碳纳米颗粒单分散性良好，纳米颗粒表面的羧基含量达到7.2mmol/g，生物相容性好，但是还不能作为新冠病毒检测的试纸条的原料。


技术实现要素：

5.针对以上现有技术的不足，本发明提供了单分散羧基胶体碳的制备方法，具体通过以下技术实现。
6.单分散羧基胶体碳的制备方法，包括以下步骤：
7.s1、超声处理：取炭黑和超纯水按重量比1:30混合后，设定500-1500w的功率超声处理10-60min，得到炭黑悬浮液；
8.s2、氧化反应：将氧化剂溶液滴加至所述炭黑悬浮液中搅拌均匀，冷凝回流反应；
9.s3、离心：将步骤s2所得溶液进行若干次离心，初次离心的参数为3000rpm离心
5min；
10.除最后一次离心以外的每次离心后均去除上清液，取下层沉淀加入步骤s1等体积的超纯水，设定500-1500w的功率超声处理10-60min；直至最后一次离心后上清液的ph值在6-7之间为止；最后一次离心后去除上清液，取下层沉淀待用；
11.s4、烘干：取步骤s3所得下层沉淀于60℃烘干，即得到羧基胶体碳的粉末。
12.上述单分散羧基胶体碳的制备方法中，所用的炭黑为市售的粒径小于1μm，所用的浓硝酸、高锰酸钾均为市面上可以购买的材料。对炭黑粉末表面用氧化剂溶液氧化处理，反应条件配合氧化剂选择加热回流的反应方式，使表面的含氧极性基团显著增多，增大其在基质中的分散性和可标记性，从而得到粒径均一，具有良好的生物相容性，适合免疫层析使用的单分散羧基胶体碳；这种单分散羧基胶体碳富含负电荷，依靠电荷吸附，或羧基与氨基形成酰胺键来标记蛋白等生物分子；免疫标记方法简单，只需常温混合孵育，经封闭、离心纯化、复溶等步骤，即可得到具有生物活性的免疫复合物，非常适合用于制备新型冠状病毒抗体检测试纸等产品。
13.优选地，步骤s2中所用的氧化剂溶液为浓硝酸、高锰酸钾或双氧水溶液。
14.更优选地，步骤s2的氧化反应具体为：以所述炭黑重量为基准按2.5ml/g的比例取浓硝酸滴加至所述炭黑悬浮液中，加入超纯水定容至步骤s1所述炭黑悬浮液体积的两倍，105℃油浴加热冷凝回流2-8h。
15.进一步优选地，步骤s2中，冷凝回流的时间为5h。
16.更优选地，步骤s2具体为：加热所述炭黑悬浮液至沸腾，以所述炭黑重量为基准按15ml/g的比例取0.05m高锰酸钾溶液滴加至所述炭黑悬浮液中，105℃油浴加热冷凝回流0.5-4h。
17.进一步优选地，步骤s2中，冷凝回流的时间为1h。
18.优选地，步骤s3的离心中，从第二次离心开始的每次离心的参数都比上一次增加3000rpm，离心时间增加5min。
19.本发明还提供了一种新型冠状病毒抗体检测试纸，包括pvc板，所述pvc板的表面依次粘贴样品垫、结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜、吸收垫，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述结合垫包被有胶体碳-新型冠状病毒重组抗原复合物和胶体碳-鸡igy抗体复合物，所述检测线包被有鼠抗人igg二抗和鼠抗人igm二抗，所述质控线包被有兔抗鸡igy二抗；
20.所述胶体碳-新型冠状病毒重组抗原复合物和胶体碳-鸡igy抗体复合物是以权利要求1所述单分散羧基胶体碳为载体，分别用新型冠状病毒重组抗原、鸡igy抗体标记组合而成；所述胶体碳-新型冠状病毒重组抗原复合物包括胶体碳-新型冠状病毒重组n抗原复合物和胶体碳-新型冠状病毒重组s抗原复合物。
21.上述新型冠状病毒抗体检测试纸在使用时，样本中的新冠病毒抗体与检测试纸的上的胶体碳-新型冠状病毒重组抗原复合物特异性地结合；检测线上包被的鼠抗人igg二抗和鼠抗人igm二抗与样本中的新冠病毒抗体特异性地结合；质控线上包被抗鸡igy二抗与所述胶体碳-鸡igy抗体复合物上的鸡igy抗体特异性结合；
22.本发明还提供了上述新型冠状病毒抗体检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
23.p1、新型冠状病毒重组抗原与胶体碳的标记：
24.p11、制备胶体碳-新型冠状病毒重组n抗原复合物：用5mm，ph＝8.8的硼酸缓冲液配制0.01％的所述单分散羧基胶体碳溶液1ml；加入60μg新冠病毒重组n蛋白，室温震摇60min；再加入100μl的10％bsa溶液，室温震摇10min，再加入10μl的5％peg20000溶液，室温震摇10min；将上述混合溶液4℃下离心30min，离心参数为10000rpm；取下层沉淀用0.3％ph＝8.0的tris缓冲液定容至100μl，即为胶体碳-新型冠状病毒重组n抗原复合物，置于4℃保存备用；
25.p12、制备胶体碳-新型冠状病毒重组s抗原复合物：用5mm，ph＝9.6的碳酸盐缓冲液配制0.01％的所述单分散羧基胶体碳溶液1ml，加入20μg新冠病毒重组s蛋白，室温震摇60min，再加入100μl的10％bsa溶液，室温震摇10min，再加入10μl的5％peg20000溶液，室温震摇10min；将上述混合溶液4℃下离心30min，离心参数为10000rpm；取下层沉淀用0.3％ph＝8.0的tris缓冲液定容至100μl，即为胶体碳-新型冠状病毒重组s抗原复合物，置于4℃保存备用；
26.p2、制备胶体碳-鸡igy抗体复合物：用5mm，ph＝8.8的硼酸缓冲液配制0.01％的所述单分散羧基胶体碳溶液1ml，加入10μg鸡igy单克隆抗体，室温震摇60min，再加入100μl10％bsa溶液，室温摇震10min，再加入10μl的5％peg20000溶液，室温震摇10min；将上述混合溶液4℃下离心30min，离心参数设定10000rpm；取下层沉淀用0.3％ph＝8.0的tris缓冲液定容至100μl，即为胶体碳-鸡igy抗体复合物，置于4℃保存备用；
27.p3、制备新型冠状病毒抗体检测试纸
28.p31、准备结合垫：将胶体碳-新型冠状病毒重组n抗原复合物、胶体碳-新型冠状病毒重组s抗原复合物和胶体碳-鸡igy单克隆抗体复合物按5:1:5的比例混合，喷涂于处理好的结合垫上，喷量为2μl/cm；然后37℃烘箱干燥16-24h，加干燥剂密封保存备用；
29.p32、划线：将硝酸纤维素膜贴于pvc底板上，将1.0mg/ml的兔抗鸡igy单克隆抗体划于硝酸纤维素膜上的质控线处，将0.8mg/ml鼠抗人igg抗体、1.0mg/ml鼠抗人igm抗体划于硝酸纤维素膜上的检测线处，37℃烘箱干燥16-24h，加干燥剂铝箔袋密封保存备用；
30.p33、组装：将步骤p31所得结合垫、滤血膜、样品垫、吸收垫依次粘贴在已贴好硝酸纤维素膜的pvc底板上，切条、组装、密封，即得新型冠状病毒抗体检测试纸，室温保存备用。
31.上述检测试纸的使用方法是：
32.(1)从塑封包装中取出检测试纸，置于干燥的桌面上，检测试纸上显示有质控区(c)和测试区(g、m)；
33.(2)用采血器具取指尖血，采血完毕后止血，将取好的血样加在加样孔内；
34.(3)将稀释液(磷酸盐缓冲液，ph值为6.5-8.0)瓶盖拧开，往滴入血样的加样孔内滴入稀释液2-3滴；在10min内读取结果，请勿于15min之后读取结果；
35.(4)结果判读：
36.igg阳性，位于测试区(g)内出现一条黑色条带，位于质控区(c)出现一条黑色条带；
37.igm阳性，位于测试区(m)内出现一条黑色条带，位于质控区(c)出现一条黑色条带；
38.igg阳性和igm阳性，位于测试区(g、m)内分别出现一条黑色条带，位于质控区(c)出现一条黑色条带；
39.阴性：仅在质控区(c)出现一条黑色条带，在测试区(g、m)内无条带出现；
40.无效结果：只要在质控区(c)无黑色条带出现均无效。
41.优选地，步骤(2)的采血的过程具体如下：所用的采血器具包括采血针、采血吸管、酒精棉；先用酒精棉消毒采血部位，再用采血针刺破采血部位，然后用采血吸管吸取一滴血样，加样检测；血滴直接滴入加样孔，然后加稀释液2-3滴；采血完毕后要用酒精棉压迫采血部位进行止血。
42.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
43.与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明提供的单分散羧基胶体碳的制备方法简单，原材料易得，产物粒径均以稳定，单分散性好，带有大量负电荷，可直接标记蛋白，用于免疫层析时，比胶体金有更强的对比度，成本更低。
附图说明
44.图1为实施例1采用浓硝酸反应制备的单分散羧基胶体碳的透射电镜图；
45.图2为实施例2采用浓硝酸反应制备的单分散羧基胶体碳的透射电镜图；
46.图3为新型冠状病毒抗体检测试纸的结构示意图。
47.图中：1、pvc底板；2、样品垫；3、结合垫；4、滤血膜；5、检测线m线；6、检测线g线；7、质控线c线；8、硝酸纤维素膜；9、吸收垫。
具体实施方式
48.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
49.实施例1
50.本实施例的单分散羧基胶体碳由以下制备方法制备而成：
51.s1、超声处理：取1g炭黑和30ml超纯水混合后，设定800w的功率超声处理30min，得到30ml的炭黑悬浮液；
52.s2、氧化反应：将步骤s1所得炭黑悬浮液稀释1倍，然后将2.5ml 69.8％浓硝酸缓慢滴加至稀释后的炭黑悬浮液中搅拌均匀；加入超纯水定容至60ml，再将反应体系转移至100ml单口烧瓶中，接入冷凝回流管，于105℃油浴加热和冷凝回流5h；
53.s3、离心：将步骤s2所得溶液进行五次离心；
54.第一次离心的参数为3000rpm离心5min；第二次离心的参数为6000rpm离心10min；第三次离心的参数为9000rpm离心15min；第四次离心的参数为12000rpm离心20min；第五次离心的参数为15000rpm离心25min；
55.上述前四次离心，前一次离心结束后去除上清液，将下层沉淀加入30ml的超纯水进行超声分散，然后再进行下一次离心。
56.第五次离心结束后上清液的ph值在6-7之间，此时去除上清液，取下层沉淀待用；
57.s4、烘干：取步骤s3所得下层沉淀于60℃烘干，即得到羧基胶体碳的粉末。
58.实施例2
59.本实施例与实施例1基本相同，唯一不同是：步骤s2的氧化反应为：将步骤s1所得炭黑悬浮液加热至沸腾，然后将15ml的0.05m的高锰酸钾溶液缓慢滴加至稀释后的炭黑悬浮液中搅拌均匀，再将反应体系转移至100ml单口烧瓶中，接入冷凝回流管，于105℃油浴加热和冷凝回流1h；，
60.实施例3：制备新型冠状病毒抗体检测试纸
61.新型冠状病毒抗体检测试纸包括pvc板1，所述pvc板1的表面依次粘贴样品垫2、结合垫3、滤血膜4、硝酸纤维素膜8、吸收垫9，所述硝酸纤维素膜8上设有检测线g线6、检测线m线5和质控线c线7，所述结合垫3包被有胶体碳-新型冠状病毒重组抗原复合物和胶体碳-鸡igy抗体复合物，所述检测线g线6包被有鼠抗人igg二抗，所述检测线m线5包被有鼠抗人igm二抗，所述质控线包被有兔抗鸡igy二抗；
62.所述胶体碳-新型冠状病毒重组抗原复合物和胶体碳-鸡igy抗体复合物是分别以实施例1和实施例2制备的单分散羧基胶体碳为载体，分别用新型冠状病毒重组抗原、鸡igy抗体标记组合而成；所述胶体碳-新型冠状病毒重组抗原复合物包括胶体碳-新型冠状病毒重组n抗原复合物和胶体碳-新型冠状病毒重组s抗原复合物。
63.具体的制备方发如下：
64.p1、新型冠状病毒重组抗原与胶体碳的标记：
65.p11、制备胶体碳-新型冠状病毒重组n抗原复合物：用5mm，ph＝8.8的硼酸缓冲液配制0.01％的所述单分散羧基胶体碳溶液1ml；加入60μg新冠病毒重组n蛋白，室温震摇60min；再加入100μl的10％bsa溶液，室温震摇10min，再加入10μl的5％peg20000溶液，室温震摇10min；将上述混合溶液4℃下离心30min，离心参数为10000rpm；取下层沉淀用0.3％ph＝8.0的tris缓冲液定容至100μl，即为胶体碳-新型冠状病毒重组n抗原复合物，置于4℃保存备用；
66.p12、制备胶体碳-新型冠状病毒重组s抗原复合物：用5mm，ph＝9.6的碳酸盐缓冲液配制0.01％的所述单分散羧基胶体碳溶液1ml，加入20μg新冠病毒重组s蛋白，室温震摇60min，再加入100μl的10％bsa溶液，室温震摇10min，再加入10μl的5％peg20000溶液，室温震摇10min；将上述混合溶液4℃下离心30min，离心参数为10000rpm；取下层沉淀用0.3％ph＝8.0的tris缓冲液定容至100μl，即为胶体碳-新型冠状病毒重组s抗原复合物，置于4℃保存备用；
67.p2、制备胶体碳-鸡igy抗体复合物：用5mm，ph＝8.8的硼酸缓冲液配制0.01％的所述单分散羧基胶体碳溶液1ml，加入10μg鸡igy单克隆抗体，室温震摇60min，再加入100μl10％bsa溶液，室温摇震10min，再加入10μl的5％peg20000溶液，室温震摇10min；将上述混合溶液4℃下离心30min，离心参数设定10000rpm；取下层沉淀用0.3％ph＝8.0的tris缓冲液定容至100μl，即为胶体碳-鸡igy抗体复合物，置于4℃保存备用；
68.p3、制备新型冠状病毒抗体检测试纸
69.p31、准备结合垫3：将胶体碳-新型冠状病毒重组n抗原复合物、胶体碳-新型冠状病毒重组s抗原复合物和胶体碳-鸡igy单克隆抗体复合物按5:1:5的比例混合，喷涂于处理好的结合垫3上，喷量为2μl/cm；然后37℃烘箱干燥16-24h，加干燥剂密封保存备用；
70.p32、划线：将硝酸纤维素膜贴于pvc底板上，将1.0mg/ml的兔抗鸡igy单克隆抗体划于硝酸纤维素膜8上的质控线c线7处，将0.8mg/ml鼠抗人igg抗体、1.0mg/ml鼠抗人igm抗
体分别划于硝酸纤维素膜上的检测线g线6、检测线g线5处，37℃烘箱干燥16-24h，加干燥剂铝箔袋密封保存备用；
71.p33、组装：如图3所示，将步骤p31所得结合垫3、滤血膜4、样品垫2、吸收垫9依次粘贴在已贴好硝酸纤维素膜8的pvc底板1上，切条、组装、密封，即得新型冠状病毒抗体检测试纸，室温保存备用。组装完成的新型冠状病毒抗体检测试纸如图3所示。
72.应用例1：对新型冠状病毒抗体检测试纸的质量的测定
73.1、新型冠状病毒抗体检测试纸的准确度
74.(1)新型冠状病毒igm抗体检测准确度
75.按照用检测试纸的测定新型冠状病毒igm抗体的准确度。采用的新型冠状病毒igm抗体为国家参考样品，分别为编号n1-n25的阴性参考品和编号p1-p10的阳性参考品。阴性参考品的符合率应不低于24/25,阳性参考品的符合率应为10/10。具体检测使用方法如下：
76.①
从塑封包装中取出检测试纸，置于干燥的桌面上，检测试纸上显示有质控区(c)和测试区(g、m)；
77.②
用采血器具取指尖血，采血完毕后止血，将取好的血样加在加样孔内；
78.③
将稀释液(磷酸盐缓冲液，ph值为6.5-8.0)瓶盖拧开，往滴入血样的加样孔内滴入稀释液2-3滴；在10min内读取结果，请勿于15min之后读取结果。；
79.④
结果判读：
80.igg阳性，位于测试区(g)内出现一条黑色条带，位于质控区(c)出现一条黑色条带；
81.igm阳性，位于测试区(m)内出现一条黑色条带，位于质控区(c)出现一条黑色条带；
82.igg阳性和igm阳性，位于测试区(g、m)内分别出现一条黑色条带，位于质控区(c)出现一条黑色条带；
83.阴性：仅在质控区(c)出现一条黑色条带，在测试区(g、m)内无条带出现；
84.无效结果：只要在质控区(c)无黑色条带出现均无效。
85.采用实施例1的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸的检测结果如下表1所示：
86.表1实施例1对应的检测试纸准确度检测结果
87.[0088][0089]
从上表1可以看出，采用实施例1的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸对新型冠状病毒igm抗体参考样品的检测结果，符合阴性参考样品、阳性参考样品的符合率要求。
[0090]
采用实施例2的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸的检测结果如下表2所示：
[0091]
表2实施例2对应的检测试纸准确度检测结果
[0092]
[0093][0094]
从上表2可以看出，采用实施例2的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸对新型冠状病毒igm抗体参考样品的检测结果，同样符合阴性参考样品、阳性参考样品的符合率要求。
[0095]
(2)新型冠状病毒igg抗体检测准确度
[0096]
按照与上述新型冠状病毒igm抗体检测相同的方法，测定新型冠状病毒igg抗体的准确度。采用的新型冠状病毒igg抗体为国家参考样品，分别为编号n1-n25的阴性参考品和编号p1-p10的阳性参考品。阴性参考品的符合率应不低于24/25,阳性参考品的符合率应为9/10。具体检测使用方法与上述新型冠状病毒igm抗体的检测方法相同。
[0097]
采用实施例1的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸的检测结果如下表3所示：
[0098]
表3实施例1对应的检测试纸准确度检测结果
[0099]
[0100][0101]
从上表3可以看出，采用实施例1的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸对新型冠状病毒igg抗体参考样品的检测结果，符合阴性参考样品、阳性参考样品的符合率要求。
[0102]
采用实施例2的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸的检测结果如下表4所示：
[0103]
表4实施例2对应的检测试纸准确度检测结果
[0104][0105]
[0106]
从上表4可以看出，采用实施例2的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸对新型冠状病毒igg抗体参考样品的检测结果，符合阴性参考样品、阳性参考样品的符合率要求。
[0107]
2、新型冠状病毒抗体检测试纸的的检测限
[0108]
(1)新型冠状病毒igm抗体检测的检测限
[0109]
按照上述检测准确度时所用的检测方法，用检测试纸的测定新型冠状病毒igm抗体的最低检测限。采用的新型冠状病毒igm抗体为最低检测限国家参考样品，检测结果应符合l1-l2为阳性，l3-l10可为阳性或者阴性的要求。
[0110]
采用实施例1的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸的最低检测限的检测结果如下表5所示：
[0111]
表5实施例1对应的检测试纸的最低检测限检测结果
[0112]
样本编号结果：阴(-)阳(+)l1+l2+l3+l4+l5-l6-l7-l8-l9-l10-[0113]
由上表5可知，采用实施例1的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸检测出编号为l1-l4的样品为阳性，l5-l10为阴性，满足上述要求。
[0114]
采用实施例2的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸的最低检测限的检测结果如下表6所示：
[0115]
表6实施例2对应的检测试纸的最低检测限检测结果
[0116]
[0117][0118]
由上表6可知，采用实施例2的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸检测出编号为l1-l4的样品为阳性，l5-l10为阴性，满足上述要求。
[0119]
(2)新型冠状病毒igg抗体检测的检测限
[0120]
按照上述检测准确度时所用的检测方法，用检测试纸的测定新型冠状病毒igg抗体的最低检测限。采用的新型冠状病毒igg抗体为最低检测限国家参考样品，检测结果应符合l1为阳性，l2-l10可为阴性或阳性。
[0121]
采用实施例1的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸的最低检测限的检测结果如下表7所示：
[0122]
表7实施例1对应的检测试纸的最低检测限检测结果
[0123]
样本编号结果：阴(-)阳(+)l1+l2+l3+l4-l5-l6-l7-l8-l9-l10-[0124]
由上表7可知，采用实施例1的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸检测出编号为l1-l3的样品为阳性，l4-l10为阴性，满足上述要求。
[0125]
采用实施例2的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸的最低检测限的检测结果如下表8所示：
[0126]
表8实施例2对应的检测试纸的最低检测限检测结果
[0127]
[0128][0129]
由上表6可知，采用实施例2的单分散羧基胶体碳制备的检测试纸检测出编号为l1-l3的样品为阳性，l4-l10为阴性，满足上述要求。
[0130]
以上实施例详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。