一种防治黄瓜土传病害的微生物有机肥及其制备方法和应用

1.本发明属于微生物有机肥技术领域，具体涉及一种防治黄瓜土传病害的微生物有机肥及其制备方法和应用。


背景技术：

2.一直以来，在全球农业产业范围内农药和化肥在生产上占据了很大的比重，也是我国农业生产中不可或缺的重要保障，为我国粮食产量及安全提供了保障。但随着人民生活质量的提高，对农产品品质及食品安全的重视，化肥农药也暴露出了一系列的问题，长期施用化肥会导致土壤板结，土壤微生物种类减少，农作物品质下降等，农药的不合理使用也会带来抗性和高残留等问题。在人们对农产品质量和安全的要求下，微生物有机肥以其环境友好、高效安全、资源利用的特点，成为了当前肥料发展的一个重要方向。
3.微生物有机肥包含特定的功能性微生物（固氮、解磷、解钾、拮抗菌等）和动植物源废弃物制得的有机质，集合了微生物菌剂和有机肥的长处。微生物有机肥富含npk以及丰富的微量元素，可以明显促进作物生长，改善作物品质，增加作物根际有益菌群的丰度和多样性，降低有害病原菌的数量，防治作物病害。并且微生物有机肥将拮抗菌与粪肥堆肥相结合及增强了有机肥的促生作用又增强了菌剂的生防效果。微生物有机肥的应用符合我国现代化农业生态可持续发展的要求，研制微生物有机肥对农业发展具有重大的经济意义和生态意义。
4.微生物有机肥是由大量的活性功能菌包含其代谢产物以及有机培养基质组成的有机肥料，功能性微生物菌剂在施用后往往很难达到预期的效果，因为菌剂中缺乏养分，在没有合适的培养基质的情况下对土壤进行拮抗微生物的接种难以取得很好的效果，会导致拮抗菌活性降低，因此拮抗菌与有机基质的结合可在土传病害的生物防治中取得积极效果。自从首次提出可以通过堆肥来控制作物根际病原菌以来，土传病害生物防治研究越来越集中于开发有机肥和拮抗微生物结合的微生物有机肥。微生物有机肥可以提高有机肥与拮抗菌的效果，比单独使用拮抗微生物或单独使用有机肥有更好的抑制疾病的效果。
5.随着人们对微生物有机肥的深入，有更多的行业废弃有机物被利用制作微生物有机肥，功能菌种类的增多也使得微生物有机肥更多的功能被发掘。并且微生物有机肥料替代化肥可以减少土壤中氮氧化物排放。研究表明微生物有机肥施用后提高了反硝化速率，减少了n2o向n2的排放，减少气态氮损失从而提高作物产量。微生物有机肥凭借着减肥减药、绿色环保以及资源利用等特点，使得其在肥料领域得到了迅速发展。
6.随着人们对生态环境保护意识的增加以及对资源循环利用的倡导，近几年关于微生物有机肥的研究和微生物有机肥产品逐年增加，受到越来越多的重视，并且在最近几年微生物有机肥得到了较快发展，产品逐渐增多，种类逐渐丰富，功能更加全面，效果更加出众。
7.目前的微生物有机肥产品施用后可促进作物生长，增加产量，提高品质；防治植物病害；改善土壤环境。已经公开的有：木霉生物有机肥，施用后可使芒果产量增加13%，还原
糖含量增加25%，提高了芒果果实的产量和品质，对热区植物的生长具有显著的促生效应。纳米蚯蚓粪有机肥施入土壤后可显著提高土壤有益微生物含量，可在一定程度上提高苹果、番茄的产量、品质指标、抗氧化性质并降低果实中重金属含量。利用餐厨废弃物堆肥制备的生物有机肥在对于番茄土传青枯病的防治上，可在不同程度上推迟番茄感病的时间，降低番茄的病情指数。将草莓枯萎病拮抗菌接种到以猪粪为材料堆制有机肥中进行二次发酵研制成微生物有机肥，并且盆栽结果表明，研制出的微生物有机肥对草莓枯萎病的防治效果为75.39%。并且能够提高草莓叶片中 sod、ppo和pod等保护酶活性。在改良土壤微生物群落方面，微生物有机肥可以改变土壤微生物群落结构，施用微生物有机肥可以使土壤中的脲酶、磷酸酶以及纤维素酶等酶活性状况得到不同程度的提高。微生物有机肥也可以改变土壤理化性质，能明显改善盐碱土壤的环境，缓解盐碱土壤板结，增加了盐碱土壤的微生物数量，对盐碱土壤生态环境的改善有积极的作用。
8.使用微生物有机肥可以改善过去因过量施用化肥造成的土壤污染，也可以通过多年施用的积累，增加土壤有机质含量，改善土壤生态环境，为有机食品产业化创造良好条件，并且微生物有机肥的生产利用了秸秆、藻类、酒糟、淤泥、畜禽粪便等各行业的有机废弃物，使之无害化，资源化，降低了有机废弃物的资源浪费和对环境等造成的污染，实现了农业资源的再利用与循环利用，具有很好的生态效益、社会效益和经济效益。随着人们研究的深入，微生物有机肥将会向功能全面、便捷高效的方向发展，改善农业生态环境，推动农业产业发展。
9.黄瓜土传病害是黄瓜生产中所需面临的主要问题之一，此类病害在土壤中传播，病菌原随病残体生活在土壤中，当条件适宜时从植株根部或茎部侵染发病。并且黄瓜土传病害在防治上有许多苦难，田间一旦出现，病原菌会在土壤中连年累积，导致发病越发严重。
10.黄瓜常见土传病害有黄瓜立枯病、黄瓜枯萎病、黄瓜猝倒病、黄瓜疫病等，黄瓜枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型，主要由厚壁孢子和菌丝体随病残体在土壤中越冬。该致病菌具有致病力强、分布广的特点，不仅可以在寄主植物中生存，而且在空气和土壤中也能生存。黄瓜疫病的病原体是德氏疫霉。病原菌以菌丝体、厚壁孢子和卵孢子的形式在土壤或粪便中越冬。它主要通过雨水和灌溉水传播，也可以通过施肥和农业活动传播。当环境条件合适时，从伤口或自然气孔侵入植物引起发病。发病后通过气流、雨水和灌溉水传播并反复侵染，保护地黄瓜种植的肥水管理不规范、以及连作重茬栽培是引起土传病害发生的重要因素，并且致病数量逐年增多，病害日益严重。


技术实现要素：

11.本发明为了解决目前防治黄瓜土传病害微生物有机肥存在的问题，提供了一种防治黄瓜土传病害的微生物有机肥及其制备方法和应用。
12.本发明由如下技术方案实现的：一种防治黄瓜土传病害的微生物有机肥，由新鲜鸡粪和牛粪为主料，稻壳或秸秆作为辅料堆肥发酵，堆肥发酵获得腐熟有机肥；铜绿假单胞菌（p aeruginosa）zm-1与解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens )ds-1分别发酵所得发酵液，然后将所得腐熟有机肥与发酵液混合，进行二次发酵，发酵结束后即为微生物有机肥；其中：所述铜绿假单胞菌（p aeruginosa）zm-1于2021年11月26日保藏于中国微生
物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23987；所述鸡粪、牛粪与秸秆或稻壳按照质量比为5-6:3-4:1的比例混合。
13.所述腐熟有机肥的具体制备方法为：原料混匀后在发酵棚内渥堆进行好氧发酵7d，每天翻堆两次，好氧发酵完成后，再进行28-32d厌氧堆肥发酵，杀灭病菌和虫卵；厌氧发酵完成即为腐熟有机肥。
14.所述铜绿假单胞菌（p aeruginosa）zm-1的发酵液为：菌株zm-1接种于发酵培养基中，发酵温度为25℃，ph值为7.5，发酵时间为48h，接种量2%；发酵培养基配方为：lb液体培养基为基础培养基，加入胰蛋白胨10g/l、蔗糖5 g/l、k2hpo410g/l；菌株zm-1的与ds-1发酵液浓度分别为：1.56
×
10
10
cfu/ml和9.20
×
109cfu/ml。
15.所述二次发酵为：菌株zm-1的发酵液和ds-1发酵液按照1:1的比例混合为混合发酵液，然后按比例将混合发酵液喷洒在腐熟有机肥上，再用蒸馏水调节发酵初始含水量为40%-60%，混合发酵液的接种量为1%-10%；混合完成后进入发酵箱进行二次发酵，发酵进程中每天翻堆两次，使发酵堆内部温度≤50℃，发酵1-7d后结束，并自然风干至含水量30%以下即可。
16.混合发酵液的接种量为5%；发酵初始含水量为45%；二次发酵时间为4-7天。
17.本发明所述解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens )ds-1由丹参（salvia miltiorrhiza）叶中分离得到《丹参内生细菌ds-1分离鉴定及抗菌活性研究》（代跃厅，山西农业大学，2015）。
18.本发明通过对黄瓜主要土传病害拮抗菌的筛选以及拮抗菌与有机肥的结合发酵来进行微生物有机肥的研制，并通过多种方法对发酵液培养基成分和发酵条件进行优化，对微生物有机肥二次发酵的发酵参数进行优化，研制出符合国家标准，对两种黄瓜土传病害有较好防治作用的微生物有机肥产品，减少农业生产中农药化肥的使用，改善土壤环境，为黄瓜等蔬菜作物的有机生产以及种植过程中土传病害的生物防治提供有效的思路与方法，以期为微生物有机肥的生产应用以及土传病害的防治提供理论依据。
附图说明
19.图1为菌株zm-1与ds-1之间拮抗作用结果图；图2为微生物有机肥发酵参数选择实验；图中：a为初始含水量的选择试验结果；b为菌液添加量的选择试验结果；c为发酵天数的选择试验结果；图3为微生物有机肥对黄瓜的盆栽促生效果试验结果；图4为各处理组对黄瓜枯萎病的防治效果；图中：从左到右依次为ck，of，菌液，药剂+of，bio1，bio2；图5为各处理组对黄瓜疫病的防治效果；图中：从左到右依次为ck，of，菌液，药剂+of，bio1，bio2图6为移栽后黄瓜根际拮抗菌含量变化。
具体实施方式
20.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不
是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
22.本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本技术中。
23.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。
24.一、复合菌种筛选：微生物有机肥进行生物防治的研究许多使用的是单一生防菌，但单一生防菌的抑菌机制较为单一，易受到各种生物及非生物因素的影响，使其抑菌作用及潜在的生防功能难以充分发挥。因此通过增加微生物有机肥中拮抗菌种类，可增加微生物有机肥的防病效果，提高应用过程中肥料的稳定性。
25.1、供试菌株：铜绿假单胞菌（p aeruginosa）zm-1，于2021年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23987，从芝麻根际土壤中稀释分离出，对黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病和黄瓜疫病致病菌具有显著拮抗作用。
26.解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens )ds-1由丹参（salvia miltiorrhiza）叶中分离得到《丹参内生细菌ds-1分离鉴定及抗菌活性研究》（代跃厅，山西农业大学，2015）。
27.供试培养基：lb 液体培养基、lb固体培养基、pdb液体培养基、胡萝卜培养基。
28.2、供试病原菌：黄瓜枯萎病菌（fusarium oxysporum.sp.cucumebrium owen）、黄瓜疫病病菌（phytophthora drechsleri tucker）、西瓜枯萎病菌（fusarium oxysporum f. sp. niveum(e.f.smith) snyder et hansen），由天津农学院植物病理实验室提供。
29.3、菌株间拮抗作用测定：将拮抗菌zm-1与ds-1在lb平板培养基上划线相交，若划线交叉处两菌株正常生长，说明菌株zm-1与ds-1之间不存在拮抗作用。可以进行混合制作生物有机肥，若划线交叉处菌株生长受到抑制，则菌株间存在拮抗作用。
30.实验结果如图1所示，由图1可以看出，两菌株生长交叉处菌落长势良好，说明两菌株之间无明显拮抗作用，通过复配混合后可以进行微生物有机肥的发酵。
31.4、菌株复配：为实现微生物有机肥更好的防病效果，提高微生物有机肥的稳定性与菌株多样性，将拮抗菌zm-1与ds-1进行复配，探究两菌株复配比例，以病害的防治效果为指标找到防治病害的最适比例，从而达到更好的防病效果。两菌株发酵液使用无菌水调整浓度为1
×
106cfu/ml，按照表1中各处理组的菌株配比将两菌株菌液混合备用。
32.表1：菌株复配比例设计
将西瓜枯萎病菌与黄瓜枯萎病菌分别接种至pdb液体培养基中，黄瓜疫病病原菌接种至胡萝卜培养基中，180 r/min，28℃培养 7d后，用无菌水将其孢子浓度调节至1
×
108cfu/ml 备用。将病原菌液按照1:100的比例进行拌土，使土壤中最终病原孢子浓度为1
×
106cfu/ml。将黄瓜与西瓜进行育苗，待长至一叶一心时将其移栽到拌好的病土中，移栽同时每盆中加入混合后菌液5ml，移栽7d后再补交一次菌液5ml，各处理组设3个重复，每重复10盆。14d后调查各组植株发病率与防治情况。各菌株比例处理组作物防病效果如表2所示。
33.表2：各菌株比例处理组作物防病效果由表2可以看出，混合菌液对3种病害的防病效果明显高于单一菌液处理组和对照组，单一菌液对3种病害的防治率均在57.00%左右，其中ds-1对西瓜枯萎病防治率最高为60.82%。在混合菌液组合中，3组混合菌液对西瓜枯萎病防效最高，对黄瓜疫病防效较低，在3组菌液配比中，1:1菌液配比处理对黄瓜枯萎病和西瓜枯萎病的防效明显高于1:2和2:1处理组，虽然1:1处理组对黄瓜疫病的防效较低于其他两组，但3组对黄瓜疫病防效相差很小，所以选择两菌株1:1配比作为后续微生物有机肥中菌液配比。
34.单一生防菌可能存在防效不稳定的问题，通过生防菌复配可实现多菌种之间的优势互补，增强其在自然条件下的竞争力和生存能力，提高菌株防病效果和稳定性。为增加微生物有机肥中拮抗菌的多样性与肥料的稳定性，本发明选择生防菌ds-1与zm-1混合共同接入微生物有机肥中进行发酵。通过两菌株的平板拮抗试验，测定两菌株间的拮抗作用，明确两菌株间没有拮抗作用可以共同发酵，然后根据不同菌株比例对3种病害的盆栽防病效果，
选出两菌株最佳复配比例为1:1。
35.二、微生物有机肥的制备1、供试菌株：铜绿假单胞菌（p aeruginosa）zm-1；解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens )ds-1由丹参（salvia miltiorrhiza）叶中分离得到《丹参内生细菌ds-1分离鉴定及抗菌活性研究》（代跃厅，山西农业大学，2015）。
36.供试病原菌：黄瓜枯萎病菌（fusarium oxysporum.sp.cucumebrium owen）、黄瓜疫病病菌（phytophthora drechsleri tucker）、西瓜枯萎病菌（fusarium oxysporum f. sp. niveum(e.f.smith) snyder et hansen），由天津农学院植物病理实验室提供。
37.2、供试培养基：lb培养基、pdb培养基、胡萝卜培养基。
38.菌株zm-1的发酵培养基：lb液体培养基作为菌株zm-1发酵的基础培养基，然后以蔗糖作为发酵培养的碳源、胰蛋白胨作为发酵培养的氮源、k2hpo4作为发酵培养的无机盐，培养基配方为：lb液体培养基为基础培养基，加入胰蛋白胨10g/l、蔗糖5 g/l、k2hpo410g/l。菌株zm-1的发酵条件：发酵温度为25℃，ph值为7.5，发酵时间为48h，接种量为以培养基体积为计算基准，接种入培养基体积2%的菌液。
39.供试作物：黄瓜品种（津研4号）。
40.供试药剂：50%多菌灵可湿性粉剂（四川润尔科技有限公司）；50%烯酰吗啉可湿性粉剂（巴斯夫）。
41.供试肥料：有机肥由天津绿之本生物科技有限公司提供；根力多生物菌肥购于根力多生物科技有限公司（含枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，有效菌含量≥2亿/g）。
42.3、制备菌株发酵液：将活化后的菌株zm-1与ds-1分别接种于发酵培养基，于其最适发酵条件分别培养48h。
43.菌株zm-1与ds-1发酵液浓度分别为：1.56
×
10
10
cfu/ml和9.20
×
109cfu/ml，更高的菌液浓度有助于提高微生物有机肥发酵效率，降低发酵成本。
44.4、菌株抗利福平筛选：使用抗生素利福平对两种菌株进行筛选，将新鲜的菌株zm-1与ds-1接种到含有10
ꢀµ
g/ml利福平的优化培养基中，摇床培养 24 h 至培养液浑浊后，吸取 1 ml菌液转接至含有20
µ
g/ml利福平的培养基中，继续震荡培养 24 h 至培养液浑浊。以此类推，直至菌株在含有300
ꢀµ
g/ml利福平的优化培养基中仍能生长，且菌落形态与抑菌能力与原菌株相同，则此时证明菌株对利福平产生了一定的抗性。优化培养基即为zm-1发酵培养基。
45.ds-1发酵培养基为：lb液体培养基作为菌株zm-1发酵的基础培养基，然后以蔗糖作为发酵培养的碳源、胰蛋白胨作为发酵培养的氮源、k2hpo4作为发酵培养的无机盐，培养基配方为：lb液体培养基为基础培养基，胰蛋白胨10g/l、蔗糖5 g/l、k2hpo410g/l、蒸馏水1l。
46.5、微生物有机肥的制备：以新鲜鸡粪和牛粪为主要原料，稻壳或秸秆为辅料进行有机肥的堆肥发酵，首先将原料充分混合，混匀后在发酵棚内堆成70cm高的条垛，发酵7d，翻抛机每天翻堆两次。好氧发酵完成后，再进行30d左右的厌氧堆肥过程，使其内部温度升高，从而杀灭病菌和虫卵等有害物质。无害化处理后经过筛分形成前期有机肥产品。所述鸡粪、牛粪与秸秆或稻壳按照质量比为5-6:3-4:1的比例混合。
47.采用二次发酵法进行微生物有机肥的制备，将发酵好的已经腐熟的有机肥与菌株
发酵液按照比例混合，并使用蒸馏水调节发酵初始堆体的含水量，发酵过程在发酵箱（箱体：长75 cm，宽55 cm，高55cm，箱体容量：0.75
×
0.55
×
0.55=0.23m3）中进行，每天翻堆两次，使其内部发酵温度不超过50℃，发酵7d结束，自然风干至含水量30%以下，获得微生物有机肥。
48.a、微生物有机肥发酵参数选择实验：采用二次发酵法，将两种拮抗菌发酵液混合后，按照相应的比例喷洒在腐熟有机肥中，进行混匀后装入发酵箱（箱体：长75 cm，宽55 cm，高55cm，箱体容量：0.75
×
0.55
×
0.55=0.23m3）中进行二次发酵，发酵进程中每天翻堆两次，使发酵堆内部温度不超过50℃，发酵7d后结束，并自然风干至含水量30%以下（jia l ,wei r ,jiang h , et al. application of bio-organic fertilizer significantly affected fungal diversity of soils[j]. soil science society of america journal, 2010, 74(6):2039）。
[0049]
发酵参数条件如下所示：发酵天数：1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d；初始含水量：40%、45%、50%、55%、60%；以肥料质量为计算基准，菌液接种量（w/v）为肥料质量的：1%、2.5%、5%、7.5%、10%。
[0050]
发酵指标为有效菌含量，菌含量测定采用稀释涂布平板法，取1g肥料用无菌水梯度稀释后，涂布在含50
µ
g/ml利福平的lb平板培养基上，培养36h后统计菌落数，计算肥料中有效菌含量。微生物有机肥发酵参数选择试验结果如表3、图2所示。
[0051]
表3：生物有机肥发酵参数选择试验结果
发酵进程中，随着发酵天数的增加，有效菌含量如图2中c所示，随着发酵天数的增加，有效菌数量逐渐增加，最后趋于稳定，前4天为拮抗菌主要增长时期，尤其是在第3天到第4天，拮抗菌增加了一倍以上，在第4天以后，发酵过程逐渐趋于稳定，有效菌含量保持在一定水平。
[0052]
不同的菌液接种量对生物有机肥发酵后的有效菌含量影响如图2中b所示，随着接菌量的增加，拮抗菌含量逐渐增加，但当接种量大于5%时，肥料中有效菌含量增幅不明显，接种量对于最终生物有机肥中有效菌含量无显著性影响，从生产成本考虑，后续发酵拮抗菌接种量为5%。
[0053]
不同的初始含水量对微生物有机肥发酵效果影响如图2中a所示，含水量对发酵的影响符合正态分布，45%的初始含水量肥料中有效菌含量最高，发醇效果显著高于其他处理，是最适于生物有机肥发酵的含水量，其中含水量高于45%后，随着含水量的升高肥料中
拮抗菌含量显著下降。因此，后续发酵初始含水量均设为45%。
[0054]
b、生物有机肥盆栽防效实验设计：将黄瓜疫病与黄瓜枯萎病病原菌分别接种至胡萝卜培养基与 pdb 液体培养基中，180 r/min，28℃培养 7d后，用无菌水将其孢子浓度调节至 1
×
108cfu/ml 后备用。将病原菌液按照1:100的比例进行拌土，使土壤中最终病原孢子浓度为1
×
106cfu/ml。对消毒后的黄瓜种子进行催芽，然后栽种于育苗盆中，待黄瓜苗长出两片真叶时，将黄瓜苗移栽于各处理组土壤中，每处理组黄瓜设三个重复，每个重复15盆。菌液处理组混合菌液浓度为1
×
108cfu/ml。药剂+有机肥of处理组在移栽后使用药剂灌根，药剂用量为5ml，黄瓜疫病防治药剂为50%烯酰吗啉可湿性粉剂750倍液，枯萎病防治药剂为50%多菌灵可湿性粉剂500倍液。黄瓜枯萎病在移栽7d和14d后，调查各处理组发病情况，黄瓜疫病在移栽5d和10d后，调查各组发病率。移栽后，采用稀释涂布平板法对根际土壤拮抗菌含量进行监测。微生物有机肥防病试验各处理组与施肥量如表4所示。
[0055]
表4：微生物有机肥防病试验各处理组与施肥量b、微生物有机肥盆栽促生实验设计：首先使用2%的次氯酸钠溶液和10%的h2o2溶液对种子进行消毒，将消毒后的黄瓜种子放入培养皿中并加入少量无菌水进行催芽，催芽后挑选长势一致的种子栽种于各处理组土壤中，如表5所示，每处理组设3个重复，每组重复黄瓜15盆，移栽后10d进行一次追肥，种植30d后调查各处理组植株株高、根长、鲜重等农艺性状。
[0056]
表5：微生物有机肥促生试验各处理组与施肥量微生物有机肥对黄瓜的促生指标测定结果如表6、图3所示，所示，根据室内盆栽促生试验效果来看，微生物有机肥处理组（bio1与 bio2）黄瓜长势均明显高于有机肥处理组（of）、菌液处理组和对照组（ck），并且本试验研制的微生物有机肥bio2与市面上购买的菌
肥bio1相比，对黄瓜的促生效果相近，bio1处理组黄瓜株高和鲜重较高，bio2处理组黄瓜根长较长，两者差别不大。
[0057]
表6：微生物有机肥对黄瓜的促生指标测定结果微生物有机肥对黄瓜土传病害的防治效果如表7所示，各处理组对黄瓜枯萎病的防治效果如图4所示；据盆栽试验表明，在各处理组对黄瓜枯萎病的防治中，黄瓜枯萎病发病较慢，7d调查结果发现，黄瓜叶片边缘黄化迹象，各处理组均有轻微发病情况，但发病较轻面积较小。14d后对照组以及有机肥处理组黄瓜苗均出现大面积发病现象，植株叶片干枯整株萎蔫。14d调查结果显示本试验研制的微生物有机肥（bio2）防效显著高于有机肥处理组（of）、菌液处理组、对照组（ck）与多菌灵+of处理组，略低于与根力多生物菌肥（bio1）处理组，微生物有机肥与根力多两处理组组对黄瓜枯萎病的防效为70.76%和73.66%，两组防效相差不大，均对黄瓜枯萎病起到了较好的防治效果。
[0058]
表7：微生物有机肥对黄瓜土传病害的防治效果黄瓜疫病处理组防病结果如表7、图5所示，结果显示，黄瓜疫病发病较快，在移栽后第7天就有大部分黄瓜出现叶部水浸状病斑，随后茎部出现缢缩，最后整株萎蔫。14d调查结果显示，微生物有机肥处理组（bio1）和根力多菌肥处理组（bio2）对黄瓜疫病防效较好，防治效果均在66%以上，显著高于菌液处理组、对照组（ck）与有机肥处理组(of)，并且略高于药剂+of处理组，本试验研制的微生物有机肥对黄瓜疫病的防效为66.50%，略高于根力多菌肥的防效66.33%。
[0059]
总体来看，本发明研制的微生物有机肥对两种黄瓜土传病害有较好的防治作用，防治效果均在60%以上，并且生物有机肥对黄瓜枯萎病的防效为70.76%高于对黄瓜疫病的防效66.50%。但是在黄瓜枯萎病的防治方面与市面上购买的菌肥相比，防病效果略低于市
面上购买的菌肥产品。
[0060]
c、根际拮抗菌定殖情况：采用稀释涂布平板法测定移栽后根际拮抗菌的数量变化，移栽后拮抗菌在黄瓜根际的含量变化如表8、图6所示，通过对移栽后黄瓜根际拮抗菌数量监测我们发现，将生物有机肥施用土壤中后，拮抗菌数量随着天数增加逐渐减少，第11天之后菌量逐渐趋于稳定。拮抗菌量的逐渐减少可能与土壤环境，营养竞争有关，也可能因为菌株ds-1为植物内生菌，会随着植物的生长进入植物体内。
[0061]
表8：移栽后拮抗菌在黄瓜根际的含量变化本发明研制出的微生物有机肥有效菌含量达到3亿/g以上，拮抗菌的生长繁殖状况较好，多项指标测定均符合国家标准，实现了高效快速、低成本生产微生物有机肥的目的。试验通过单因素法对二次发酵过程中的发酵天数，初始含水量，菌液添加量三个参数进行测定，有效提高了二次发酵的效率，增加了发酵后的有效菌含量。微生物有机肥二次发酵参数为初始含水量45%、菌液添加量5%、发酵5天。
[0062]
关于微生物有机肥二次发酵方法，有人认为该方法存在着生产工艺复杂、成本高等问题，提出了通过一步贯通法制备微生物有机肥，即在有机肥堆肥开始就接种发酵菌剂和生防菌剂，这种方法研制出的微生物有机肥也有不错的效果（张楠. 抗小白菜炭疽病多功效生物有机肥的研制及其生防效果评价[d].大连理工大学,2017），但对拮抗菌的种类有所要求，首先堆肥过程是一个复杂的是生物环境，堆肥中土著微生物很多，与拮抗菌进行营养竞争可能会导致拮抗菌的数量下降（李红丽,郭夏丽,李清飞,王岩.抑制烟草青枯病生物有机肥的研制及其生防效果研究[j].土壤学报,2010,47(04):798-801.），并且堆肥的过程需要通过高温来杀灭肥料中的致病菌和虫卵等有害物质，在高温过程中可能会导致某些生防菌死亡。所以两种方法可根据拮抗菌性质以及发酵需求来进行选择。
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本发明测定了微生物有机肥对黄瓜的促生作用，以及对两种黄瓜主要土传病害的防治效果，盆栽试验表明，微生物有机肥对黄瓜有明显促生作用，使黄瓜植株长势增加了33.26%，对黄瓜枯萎病和黄瓜疫病的盆栽防效分别为70.76%和66.50%。
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本发明所述微生物有机肥可以为微生物有机肥的研制以及生产应用提供理论基础。
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最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。