罗非鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料及其制备方法与应用

1.本发明属于生物活性骨修复材料领域，涉及一种罗非鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料的制备方法及应用。


背景技术：

2.以磷酸钙特别是羟基磷灰石为基础的生物材料因其良好的骨诱导和骨传导特性而被广泛应用于骨折等缺损的修复。目前临床采用合成的羟基磷灰石作为骨修复材料，但合成羟基磷灰石的制备工艺不仅较为复杂，还需引入其他的化学试剂。同时，合成的羟基磷灰石与人体内天然的羟基磷灰石在物理化学性质上存在一定的差异，导致合成的羟基磷灰石生物活性较低。
3.近年来，从牛骨、鱼骨、鱼鳞、矿物材料等各种天然材料获得天然磷酸钙材料越来越备受关注。天然来源的磷酸钙材料相比于合成的羟基磷灰石具有更加优异的生物活性。
4.然而，目前天然来源磷酸钙材料中，常用的牛骨是一种很好的磷酸钙材料来源。但因牛骨存在疯牛病病毒的风险，会对人类生命健康造成威胁，寻找一种有效、安全、来源广泛的生物材料变得尤为迫切。
5.罗非鱼是我国主要养殖水产品，其鱼骨不仅取材广泛，并且富含微量元素，是一种具有良好前景的活性磷酸钙材料天然来源。但在罗非鱼在其食品加工过程中，大量鱼骨被作为废物扔弃，不仅经济效益低下，而且还对环境具有不利的影响。
6.本发明提供了一种低成本、高可行性的方法，通过梯度升温煅烧法可以得到含有多种微量元素的“海绵状”双相磷酸钙生物活性骨修复材料。本发明既实现了废弃的罗非鱼骨到高值化产品的转变，又符合绿色化工与可持续发展战略的要求。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一种通过梯度升温烧结法制备罗非鱼骨源双相磷酸钙活性材料。该材料的主要成分为羟基磷灰石和β-磷酸钙，且转化的双相磷酸钙材料，具有良好的骨组织工程应用前景。
8.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.一种罗非鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料的制备方法，所述方法具体包括如下步骤：
10.(1)去有机质：将废弃罗非鱼骨，转入容器中，加去离子水浸没鱼骨，煮沸，蒸煮结束后，倾倒蒸煮液，剔除油脂等有机质，去离子水冲洗，沥干并烘干，备用；
11.(2)梯度升温烧结：将干燥后的罗非鱼骨，置于马弗炉，第一步煅烧得到含单相羟基磷灰石成分的煅烧骨，待其自然冷却后，提升温度梯度煅烧，得到含双相磷酸钙成分的煅烧骨；
12.(3)研磨成粉：将步骤(2)得到的含双相磷酸钙成分的煅烧骨，研磨成粉，得到罗非
鱼骨源双相磷酸钙粉末；
13.(4)消毒灭菌：将步骤(3)得到的罗非鱼骨源双相磷酸钙粉末，消毒、灭菌，随后干燥，保存，即得到所述罗非鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料。
14.可选的，步骤(1)中，所述蒸煮采用电磁炉加热，加热功率为240-300w，蒸煮时间为15-30min，倾倒蒸煮液后，去离子水冲洗3-5次，在60℃恒温烘箱中烘干。
15.可选的，步骤(2)中，第一步煅烧温度梯度为600-800℃，煅烧1h，随后提升温度梯度至900-1200℃，煅烧1-4h；其中，马弗炉升温速率为5-10℃/min，降温速率为10℃/min。
16.可选的，步骤(4)中，采用的灭菌方式为伽马射线，伽马射线的辐照剂量控制在25～30kgy；待消毒灭菌后，在60℃恒温烘箱中烘干，保存。
17.需要说明的是，随着高温煅烧的温度升高，β-tcp的含量有一定的升高。但温度过高会导致材料结晶度的升高和晶粒尺寸的变化，从而影响相应材料的降解速率。
18.进一步的，在第一步600-800℃温度梯度下煅烧1h能获得单相羟基磷灰石生物活性材料，而第二步在900-1200℃温度梯度下煅烧1-4h能获得主要成分为hap和β-tcp的双相磷酸钙生物活性骨修复材料，如图4所示。
19.本发明还请求保护经上述方法制备的罗非鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料，所述罗非鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料含有“海绵状”结构，且所述罗非鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料的主要成分包括羟基磷灰石(hap)和β-磷酸三钙(β-tcp)。
20.其中，所述的罗非鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料颗粒的粒径为100nm-2mm，及其包含多种有利于骨组织生长的微量元素，且所述微量元素的质量百分比为0.04-1％。
21.以及，本发明还请求保护由上述方法制备的罗非鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料在制备骨缺损骨修复材料及骨组织工程中的应用。
22.还包括：所述罗非鱼骨源双相磷酸钙活性材料在制备骨植入物涂层材料中的应用，及所述罗非鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料在制备药物载体的材料中的应用。
23.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供的一种罗非鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料及其制备方法与应用，具有如下优异效果：
24.1)罗非鱼骨是天然的骨修复材料的来源，取材广泛，含有多种可促进骨修复的微量元素。同时利用废弃的罗非鱼骨作为来源以获取天然生物活性磷酸钙材料，不仅可以提高经济效益，还可以达到保护环境的作用。
25.2)罗非鱼骨在梯度升温烧结过程中，其可以保留材料本身含有的多种微量元素，并且烧结后的材料含有“海绵状”的多孔结构，更加有效地促进骨组织再生，同时操作方法简便可行。
26.其中，β-tcp具备优越的生物性能，较好的生物相容性与生物降解性。通过梯度煅烧法所得到的为双相磷酸钙材料，主要成分为hap和β-tcp，可以综合利用两者的优点与多种微量元素在促进骨修复材料中的作用，显著提高骨修复材料的各种生物学性能。
27.综上所述，本发明获得了一种成本低廉、可行性高的罗非鱼骨源高值化生物活性磷酸钙材料。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
29.图1为罗非鱼骨双相icp数据分析图。
30.图2为“海绵状”罗非鱼骨源双相磷酸钙生物活性骨修复材料的sem图。
31.图3为梯度升温烧结第一步所得物相的xrd图。
32.图4为通过梯度升温烧结得到的双相磷酸钙生物活性骨修复材料的xrd图。
具体实施方式
33.下面将结合本发明实施例及说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.本发明实施例公开了一种罗非鱼骨源双相磷酸钙活性骨修复材料的制备方法。
35.为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
36.下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的说明。
37.实施例1
38.(1)取废弃的罗非鱼骨，转入容器，采用电磁炉蒸煮，倾倒蒸煮液，去离子水冲洗，沥干，烘箱60℃中烘干，备用；
39.(2)取适量鱼骨，置于马弗炉中800℃煅烧1h，待其自然冷却，得到单相羟基磷灰石煅烧骨；
40.(3)单相羟基磷灰石煅烧骨置于马弗炉中1200℃煅烧4h，待其自然冷却，得到双相磷酸钙煅烧骨；
41.(4)双相磷酸钙煅烧骨在玛瑙研钵中研磨成粉；
42.(5)得到的粉用伽马射线灭菌，辐照剂量控制在25～30kgy，随后于60℃
43.烘箱中烘干，保存。
44.实施例2
45.(1)取废弃的罗非鱼骨，转入容器，采用电磁炉蒸煮，倾倒蒸煮液，去离子水冲洗，沥干，烘箱60℃中烘干，备用；
46.(2)取适量鱼骨，置于马弗炉中800℃煅烧1h，待其自然冷却，得到单相羟基磷灰石煅烧骨；
47.(3)单相羟基磷灰石煅烧骨置于马弗炉中1100℃煅烧4h，待其自然冷却，得到双相磷酸钙煅烧骨；
48.(4)双相磷酸钙煅烧骨在玛瑙研钵中研磨成粉；
49.(5)得到的粉用伽马射线灭菌，辐照剂量控制在25～30kgy，随后于60℃烘箱中烘
tcp和hap，β-tcp相比于hap具备更加优异的生物降解性能，可以较好地改善单一的hap降解速度过慢问题，使材料具备优异的生物学性能。由此可见，罗非鱼骨转化的磷酸钙材料在骨组织工程方面具有良好的应用前景。
71.以及，为进一步描述所制备的罗非鱼骨源双相磷酸钙生物活性材料的具体应用，发明人还进行了如下应用实验，具体内容如下：
72.实验例1：仿生骨修复支架材料的制备
73.(1)取废弃的罗非鱼骨，转入容器，采用电磁炉蒸煮，倾倒蒸煮液，去离子水冲洗，沥干，烘箱60℃中烘干，备用；
74.(2)取适量鱼骨，置于马弗炉中800℃煅烧1h，待其自然冷却，得到单相羟基磷灰石煅烧骨；
75.(3)单相羟基磷灰石煅烧骨置于马弗炉中1100℃煅烧4h，待其自然冷却，得到双相磷酸钙煅烧骨；
76.(4)双相磷酸钙煅烧骨在玛瑙研钵中研磨成粉；
77.(5)得到的粉用伽马射线灭菌，辐照剂量控制在25～30kgy，随后于60℃烘箱中烘干，保存；
78.(6)首先将聚乳酸和罗非鱼骨来源双相磷酸钙材料预先干燥12h，按照聚乳酸/双相磷酸钙生物活性材料质量比为85:15,聚乳酸和双相磷酸钙生物活性材料质量共1g作为溶质，称量、震荡混合均匀后，溶于8ml的1,4-二氧六环的有机溶剂中，加热搅拌直至聚乳酸完全溶解，混合溶液呈半透明粘稠溶液，放置于-20℃冰箱内预冷冻5h；从冰箱取出后放到初始温度为-60℃的真空冷冻干燥机内冷冻干燥24h得到n-ha/pla复合的三维多孔支架材料；最后将干燥后的试件放到无水乙醇内浸泡24h，去离子水反复洗涤，恒温鼓风干燥箱干燥12h，保存。
79.实验2：罗非鱼骨用作骨填充材料的制备方法
80.(1)取废弃的罗非鱼骨，转入容器，采用电磁炉蒸煮，倾倒蒸煮液，去离子水冲洗，沥干，烘箱60℃中烘干，备用；
81.(2)取适量鱼骨，置于马弗炉中800℃煅烧1h，待其自然冷却，得到单相羟基磷灰石煅烧骨；
82.(3)单相羟基磷灰石煅烧骨置于马弗炉中1100℃煅烧4h，待其自然冷却，得到双相磷酸钙煅烧骨；
83.(4)双相磷酸钙煅烧骨在玛瑙研钵中研磨成粉；
84.(5)得到的粉用伽马射线灭菌，辐照剂量控制在25～30kgy，随后于60℃烘箱中烘干，保存；
85.(6)将步骤(5)所得到的粉末与pla、plla、plga、pva、peek或pcl复合，制备得到复合骨粉填充剂。
86.实验3：hap/β-tcp涂层的制备方法
87.(1)取废弃的罗非鱼骨，转入容器，采用电磁炉蒸煮，倾倒蒸煮液，去离子水冲洗，沥干，烘箱60℃中烘干，备用；
88.(2)取适量鱼骨，置于马弗炉中800℃煅烧1h，待其自然冷却，得到单相羟基磷灰石煅烧骨；
89.(3)单相羟基磷灰石煅烧骨置于马弗炉中1000℃煅烧4h，待其自然冷却，得到双相磷酸钙煅烧骨；
90.(4)双相磷酸钙煅烧骨在玛瑙研钵中研磨成粉；
91.(5)得到的粉用伽马射线灭菌，辐照剂量控制在25～30kgy，随后于60℃烘箱中烘干，保存；
92.(6)采用sg-100型喷枪的7700型等离子喷涂设备，设置喷涂参数如下：主气(n2)流动速率为90l.min-1
，辅气(h2)流动速率为1l.min-1
，功率81kw，电流530a，进料速度为32g.min-1
，喷涂距离为90mm，喷涂遍数为2，获得hap/β-tcp涂层材料。
93.实验4：hap/β-tcp海藻酸钠载药支架的制备方法
94.(1)取废弃的罗非鱼骨，转入容器，采用电磁炉蒸煮，倾倒蒸煮液，去离子水冲洗，沥干，烘箱60℃中烘干，备用；
95.(2)取适量鱼骨，置于马弗炉中800℃煅烧1h，待其自然冷却，得到单相羟基磷灰石煅烧骨；
96.(3)单相羟基磷灰石煅烧骨置于马弗炉中1200℃煅烧4h，待其自然冷却，得到双相磷酸钙煅烧骨；
97.(4)双相磷酸钙煅烧骨在玛瑙研钵中研磨成粉；
98.(5)得到的粉用伽马射线灭菌，辐照剂量控制在25～30kgy，随后于60℃烘箱中烘干，保存；
99.(6)在规格为30ml玻璃烧杯中加入10ml的去离子水，水浴条件下缓慢加热至37℃，将机械搅拌器的转速设定为1000r/min进行搅拌，依次加入3.5g双罗非鱼骨源双相羟基磷灰石活性材料、0.0058gng(柚皮苷)(维持10min)、1gsa(海藻酸钠)，搅拌均匀；在使用超声震荡仪之后，把生物墨水放入50ml离心管中，设定低温离心机转速为3000r/min进行离心，再将生物墨水小心放置于打印机专用料筒内，以去除材料里多余的气泡；使用规格为0.2mm的针头，将气压值设定为0.52mpa，喷头的移动的速度设定为28mm/s，设定支架孔隙间距为1.2mm，使用软件里预先3d建模支架程序：圆形8mm*8mm*2mm；刚打印出来的支架立即浸泡并整个没入到4℃的浓度为10％cacl2进行交联(约10分钟)，蒸馏水清洗3次；最后把支架放到超低温冰箱进行除霜，后放入真空冷冻干燥机中冻干后备用。
100.实验5：hap/β-tcp接枝叶酸的制备方法
101.(1)取废弃的罗非鱼骨，转入容器，采用电磁炉蒸煮，倾倒蒸煮液，去离子水冲洗，沥干，烘箱60℃中烘干，备用；
102.(2)取适量鱼骨，置于马弗炉中800℃煅烧1h，待其自然冷却，得到单相羟基磷灰石煅烧骨；
103.(3)单相羟基磷灰石煅烧骨置于马弗炉中900℃煅烧4h，待其自然冷却，得到双相磷酸钙煅烧骨；
104.(4)双相磷酸钙煅烧骨在玛瑙研钵中研磨成粉；
105.(5)得到的粉用伽马射线灭菌，辐照剂量控制在25～30kgy，随后于60℃烘箱中烘干，保存；
106.(6)将0.3g罗非鱼骨源双相磷酸钙粉溶于100ml乙醇：水(体积比1：1)的溶液中，在氮气保护下，500r/min搅拌下，加入一定量的3－氨丙基三乙氧基使罗非鱼骨源双相磷酸钙
与硅烷摩尔比为1:4，硅烷反应2h，分离，处理，干燥；
107.(7)取叶酸(fa)0.6g，溶于28mln，n-二甲基酰亚胺：二甲亚砜(dmf：dmso)体积比为3:1溶剂中，再加入0.186g二环己基碳二亚胺(dcc)和0.154g羟基琥珀酰亚胺(nhs)，在遮光、氮气保护条件下以中等转速搅拌12h使fa充分活化，抽滤除去副产物，得到叶酸活化酯溶液；
108.(8)取0.3g反应的罗非鱼骨源双相磷酸钙粉，加入到叶酸活化酯(摩尔比为1:3)溶液中，避光、氮气保护下，磁力搅拌24h；将所得产物离心分离处理，沉积物置于60℃烘箱干燥12h，最终得到接枝叶酸的hap/β-tcp。
109.实验6：仿生骨修复支架材料、骨填充材料、hap/β-tcp涂层材料、hap/β-tcp用作药物载体的体外细胞毒性实验：
110.制备材料浸提液：首先将制备好的仿生骨修复材料、骨填充材料、hap/β-tcp涂层材料、hap-β-tcp用作药物载体按20mg/ml的标准浸没于无菌dmem培养基中，120rpm离心后，放于振荡箱内37℃孵育24h，离心后取上清液作为浸提液。使用新鲜的dmem培养基培养mc3t3-e1细胞24小时候后吸弃掉培养基，加入浸提液原液和梯度稀释液(1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64)继续培养22小时。稀释浸提液，加入含有10％cck-8(v/v)的培养液，在37℃下孵育2h，通过多功能酶标仪检测od450nm处的吸光度。每组有三个平行样，探究材料对于细胞增殖的影响。
111.活死细胞染色：将仿生骨修复支架材料、骨填充材料、hap/β-tcp涂层材料、hap/β-tcp用作药物载体的涂膜玻片准备好，每组准备6个平行样，将玻片放于24孔板内，每孔种2
×
104细胞。将接种细胞及生长因子后的孔板放入恒温细胞培养箱中在37℃，5％co2的环境中分别培养1天、3天。吸弃培养基，用pbs洗一遍后吸弃。每孔加入1ml多聚甲醛溶液固定，室温放置30分钟。吸弃多聚甲醛，pbs洗一遍后吸弃。每孔加入200μl配置好的钙黄绿素，染色5分钟后吸弃，pbs洗一遍后吸弃。加入200μlpi，37℃孵育十分钟后拿出，吸弃pi，加入pbs洗一遍吸弃，使用倒置荧光显微镜观察细胞形态。
112.增殖实验:将仿生骨修复支架材料、骨填充材料、hap/β-tcp涂层材料、hap/β-tcp用作药物载体的涂膜玻片准备好，每组准备6个平行样，将玻片放于24孔板内，每孔种2
×
104细胞。将接种细胞后的孔板放入恒温细胞培养箱中在37℃，5％co2的环境中培养，平均48小时换液一次，分别准备在1天、3天和7天时用cck-8检测细胞增殖情况。
113.实验结果表明，仿生骨修复支架材料、骨填充材料、hap/β-tcp涂层材料、hap/β-tcp用作药物载体时均无细胞毒性。
114.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。