一种促进湛江等鞭金藻生长的高效肥水剂的生产方法

本发明属于微藻培养，具体涉及一种促进湛江等鞭金藻生长的高效肥水剂的生产方法。

背景技术：

1、近年来，微藻由于自养培育成本的高昂，阴雨天和冬天等弱光条件下缺乏碳源导致生长缓慢，从而贝类缺乏湛江等鞭金藻等天然活饵料，难以实现高密度培育。研究发现，湛江等鞭金藻以一些羧酸类做有机碳源、进行兼养培养时，能极大提高生物产量和比生长速率，减少细菌的滋生。就水产养殖而言会使用肥水产品，尤其是在出现“转水”或者水质变差的情况以后，藻类大量死亡，严重影响光合作用，池塘会发生缺氧现象，进而引起水产动物的死亡，此时就需要使用肥水产品使藻类大量繁殖，所以肥水产品在水产养殖领域扮演者至关重要的角色。

2、目前，常规使用的肥水产品分为有机肥或无机肥，其中无机肥主要有尿素、磷酸钙、碳酸铵等，肥水见效比较快，但缺点是维持时间不长；有机肥主要有绿肥、粪肥等，但其营养单一；并且，单一纯品的有机酸和矿物质的制备繁琐、成本高昂，不适用微藻的经济化培养，因此研发一种高效的肥水剂具有非常重要的生产实践意义。

技术实现思路

1、针对现有湛江等鞭金藻产量低下的问题，本发明根据湛江等鞭金藻的生长需求，提供了一种以羽毛粉和次粉为原料的高效肥水剂，在肥水剂的生产过程中，根据湛江等鞭金藻的生长需求，创造性的加入产乙酸高的发酵菌株及矿物质，同时克隆表达一种酸性条件下活性高的角蛋白酶高效工程菌并加入还原剂亚硫酸钠进行协同发酵，最终获得的肥水剂成品中乙酸、小肽、氨基酸、矿物质螯合率高，对湛江等鞭金藻的生长效果显著。

2、为了实现以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：

3、(1)将羽毛粉和次粉混合，搅拌均匀，得到固体培养基；

4、(2)选择乳酸菌、酵母菌、芽孢菌接种到相应的培养基进行活化培养并得到相应的乳酸菌、酵母菌、芽孢菌发酵种子液；

5、(3)将来源于bacillus tequilensis strain q7的角蛋白酶基因序列根据枯草芽孢杆菌密码子偏好性进行优化，得到编码角蛋白酶的基因，核苷酸序列如seq id no.1所示；以该基因为模板进行pcr扩增，于穿梭质粒载体pma连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，抽提获得重组穿梭质粒后，利用化学转化法导入到枯草芽孢杆菌db403感受态细胞中，得到重组角蛋白酶芽孢工程菌，即db403 pma0911-kerq7；培养所述的重组角蛋白酶芽孢工程菌收集菌液，所述菌液中包含重组酵母工程菌胞外分泌的角蛋白酶，得到的菌液；通过离心固液分离后收集上清液，备用；

6、(4)将步骤(2)的乳酸菌、酵母菌以及芽孢菌的发酵种子液和步骤(3)的db403pma0911-kerq7培养后的上清液接种到步骤(1)的固体培养基中，然后再加入矿物质、亚硫酸钠、水搅拌均匀，发酵结束后获得高效肥水剂。

7、优选的，步骤(1)所述的用量为羽毛粉10-30％、次粉70-90％。

8、优选的，步骤(2)所述的乳酸菌为布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌，酵母菌为产朊假丝酵母菌，芽孢菌为枯草芽孢杆菌。

9、优选的，步骤(3)所述培养重组角蛋白酶芽孢工程菌温度为30-37℃，转速为180-220rpm，时间为24～48h；所述离心的条件为5000-8000rpm，5-10min。

10、优选的，步骤(4)所述的db403 pma0911-kerq7以上清液与乳酸菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液、芽孢菌发酵种子液的总菌液接种量为10～20％(v/w，ml/g)；db403pma0911-kerq7的上清液、乳酸菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液和芽孢菌发酵种子液的体积比为1：3：2：1；所述乳酸菌为布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌中的一种或多种混合，当多种混合时其体积比为1。

11、优选的，步骤(4)中控制培养基的含水量为25％-45％(v/w)，发酵时间5-12天，发酵温度20-37℃。

12、优选的，以固体培养基的质量计，步骤(4)所述亚硫酸钠的添加量为0.1～2％(w/w)；矿物质为硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌和碳酸钙，其中硫酸亚铁的添加量为1.59-14.18g/kg、硫酸铜的添加量为14.7-85.2mg/kg、硫酸锰的添加量为270-1080mg/kg、硫酸锌的添加量为66-264mg/kg、碳酸钙的添加量为3-30g/kg。

13、更优选的，硫酸亚铁添加量为7.95g/kg，硫酸铜添加量为36.75mg/kg，硫酸锰添加量为540mg/kg，硫酸锌添加量为132mg/kg，碳酸钙添加量为60g/kg。

14、本发明所制备的高效肥水剂用于促进湛江等鞭金藻生长的用途，应用方式为：直接将制备的高效肥水剂抛洒养殖池，每隔1～10天抛洒一次，每次的施用量为0.3g/l-1.2g/l。

15、注：当投放时间为12月-2月或阴雨天，需要按照原施用量10-30％加量；当投放时间为3～5月份、9～11月份，需要按照原施用量10-30％减量。

16、技术方案的具体筛选过程如下：

17、(a)发酵菌种的筛选

18、初始有机酸选择为：乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸；

19、将有机酸：乳酸以0、0.05、0.1、0.15、0.2g/l、乙酸以0、0.1、0.3、0.5、0.7g/l、甲酸以0、0.5、0.1、0.2、0.3g/l、丙酸以0、0.05、0.075、0.1、0.2g/l、柠檬酸以0、0.05、0.075、0.1、0.15g/l、琥珀酸以0、0.05、0.1、0.2、0.3g/l、酒石酸以0、0.1、0.3、0.5、0.7g/l、苹果酸以0、0.05、0.075、0.1、0.15g/l分别加入到微藻培养基(f/2人工海水培养基)中，得到含不同有机酸及浓度的f/2人工海水培养基；将其ph调节为8.0，再将湛江等鞭金藻以10％的接种量转接至含有机酸的f/2人工海水培养基中，初始藻密度均为5×105个/ml，培养10天统计结果；以藻密度为指标，能够看出不同有机酸对微藻是生长是有影响的，其中乙酸和柠檬酸的促进效果尤为明显，进一步对比来看，发现乙酸对湛江等鞭金藻的生长影响最为显著，而且其浓度的影响也至关重要，进而筛选到促进湛江等鞭金藻生长最佳的乙酸浓度为0.5g/l，此时湛江等鞭金藻的藻密度超过107个/ml藻密度，具体结果见图1。

20、f/2人工海水培养基配方为：75mg/l nano3、5mg/l nah2po4·h2o、9.8μg/l cuso4·5h2o、22μg/l znso4·7h2o、10μg/l cocl·6h2o、180μg/l mncl2·4h2o、6.3μg/l na2moo4·2h2o、4.36mg/l na2edta、3.15mg/l fecl3·6h2o、100μg/l vb1、0.5μg/l vh、0.5μg/l vb12、26g/l海盐。

21、而后，对乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌的发酵菌液采用hplc进行有机酸的测定，具体实验菌株选择15种，依次为发酵乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌和弯曲乳杆菌，测定结果见表1；

22、通过表1的实验结果可以看出，不同菌株所产生的有机酸含量差异明显，筛选到布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、产朊假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌产乙酸高于其他有机酸，有机酸含量如下表1。布氏乳杆菌和有机酸标准品的峰图依次对应图2的(a)、(b)。

23、表1不同菌种的有机酸含量

24、

25、

26、注：s1-s15依次为：发酵乳杆菌、鼠李唐乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌、弯曲乳杆菌。

27、(b)矿物质形态和浓度的筛选

28、将不同形态的铁源(硫酸铁、硫酸亚铁、甘氨酸亚铁、乳酸亚铁)，锌源(硫酸锌、乳酸锌、甘氨酸锌)，铜源(硫酸铜、柠檬酸铜、甘氨酸铜)，锰源(氯化锰、乙酸锰、甘氨酸锰)，钙源(氯化钙、乳酸钙、天冬氨酸钙)分别按照fe＝19umol/l、zn＝0.08unol/l、cu＝0.04umol/l、mn＝0.91umol/l、ca＝0.04umol/l，依次加入无铁源、无锌源、无铜源、无铜源、无钙源的f/2人工海水培养基中，然后以10％的接种量接种湛江等鞭金藻，初始藻密度均控制为5×105个/ml，培养8天后进行结果统计；藻密度见图3，结果显示，湛江等鞭金藻分别在螯合态的铁源、锌源、铜源、钙源下生长最佳；进一步以藻密度为指标，优化矿物质浓度，可以看出在不同浓度条件下其对微藻的生长影响极为显著，只有在特定浓度下才能取得良好的结果；通过实验得到0.53-4.725mg/l甘氨酸亚铁为铁源、4.9-28.4ug/l甘氨酸铜为铜源、90-360ug/l甘氨酸锰为锰源时、22-88ug/l甘氨酸锌为锌源和1-10mg/l天冬氨酸钙为钙源，结果见图4；

29、基于铁源、铜源、锰源、锌源和钙源，对应矿物质选择为硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌和碳酸钙，其中根据相应的用量转换，确定硫酸亚铁的添加量为1.59-14.18g/kg(w/w)、硫酸铜的添加量为14.7-85.2mg/kg(w/w)、硫酸锰的添加量为270-1080mg/kg(w/w)、硫酸锌的添加量为66-264mg/kg(w/w)、碳酸钙的添加量为3-30g/kg(w/w)。

30、(c)获得产耐酸性角蛋白酶的枯草芽孢杆菌(db403 pma0911-kerq7)

31、s1、将ncbi中的bacillus tequilensis strain的角蛋白酶基因序列(genbank:idkp694221)，根据枯草芽孢杆菌中密码子偏爱性，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行密码子优化；得到密码子优化后的重组角蛋白酶(记为kerq7)基因，其核苷酸序列如seq idno.1所示，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示；

32、s2、利用引物p1(p1-f：ggaattccatatgtgtgttaagaagaagaacgtg，p1-r：cgcggatccttaattgctcgccg)进行pcr扩增kerq7基因序列，反应条件为94℃3min；98℃10s，58℃10s，72℃1min：30循环；72℃10min；4℃保持，反应体系为premix ex taq(2×)12.5ul，template 1ul、p1-f(10um)1ul、p1-r(10um)1ul、ddh2o 9.5ul。

33、s3、而后，将pcr产物(目的基因kerq7)和载体pma0911进行双酶切，其中，目的基因kerq7酶切体系为：nde i 1.0μl，bamh i 1.0μl，kerq7 15μl，10×quickcuttm buffer 5.0μl，dd h2o 28.0μl，载体pma0911酶切体系为nde i 1.0μl，bamh i 1.0μl，pma0911质粒20μl，10×quickcuttm buffer 5.0μl，dd h2o 23.0μl，而后分别将加入了内切酶的kerq7和载体pma于37℃酶切反应15min，加入10×dna loading buffer，而后经琼脂糖凝胶电泳后通过胶回收来回收目的片段，并用onedrop测定回收片段的浓度。

34、s4、将胶回收产物(目的片段)使用t4 dna连接酶进行连接，得到酶连产物；其中酶连体系为t4 dna连接酶1ul，t4 dna连接酶buffer 2ul，双酶切载体4ul，kerq7目的片段13ul，反应条件为16℃，3h；然后，将酶连产物直接转化到e.coli dh5α感受态菌株，涂于100ug/ml氨苄青霉素抗性平板，挑取阳性转化子扩培抽提质粒并进行测序验证，验证正确的质粒命名为pma0911-kerq7，见图5a；将pma0911-kerq7转接到lb液体培养基中，培养至对数期后，于超净工作台，每700ul菌液加入300ul50％甘油于-80℃保存。

35、s5、将步骤4得到的pma0911-kerq7转化枯草芽孢杆菌db403感受态中；转化方法为：将pma0911-kerq7于45℃水浴融化形成感受态，而后在500ul感受态中再次加入5ulpma0911--kerq7，随后于恒温摇床里活化培养1h，培养条件为120rpm、37℃；随后5000rpm离心5min，去除400ul上清，剩余溶液重悬后，涂于100ug/ml氨苄青霉素的lb平板筛选转化子，培养过夜，挑取单菌落验证转化子。

36、而后以枯草芽孢杆菌常见的载体pma0911引物p2(p2f：gcgaaaatgcctcacatttgtgcc，p2r：cgggatctcagatctggtacgtacc)扩增基因，pcr程序为，94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30循环，72℃10min，反应体系为taq master mix(2×)10ul，template1ul，p2-f(10μm)0.8ul，p2-r(10μm)0.8ul，ddh2o 7.4ul。而后对产物进行琼脂糖凝胶电泳，在1300bp左右可见一条明亮的条带，见图5b，证明转化成功，命名该重组工程菌为db403 pma0911-kerq7。

37、s6、将db403 pma0911-kerq7接种于100ug/ml氨苄青霉素lb培养基中，于摇床过夜培养，培养条件180rpm，37℃，收集发酵液于8000rpm离心10min，收集得到发酵液上清液；进行western-blot验证，于28kda处出现目标条带，证明表达成功，见图5c。测定发酵上清液的活力为84u/ml。

38、本发明的优点和技术效果是：

39、(1)本发明根据湛江等鞭金藻的生长需求，创造性的加入产乙酸高的发酵菌株及矿物质，满足湛江等鞭金藻对乙酸的需求；同时克隆表达一种酸性条件下活性高的角蛋白酶高效工程菌并加入还原剂亚硫酸钠进行协同发酵，最终获得的肥水剂成品中乙酸、小肽、氨基酸、矿物质螯合率高；此外，肥水剂中的大量益生菌能协同微藻进一步转化利用有机物，提高微藻的生物产量；肥水剂的氨基酸，矿物质可也作为湛江等鞭金藻的营养补剂，对湛江等鞭金藻的生长效果显著。

40、(2)本发明提供了一种菌酶协同发酵羽毛粉的方式，并结合亚硫酸钠降解二硫键的肥水剂工艺，在实现促进微藻的产量提高的同时，也实现了羽毛粉等农业废弃物的转化利用。

41、(3)本发明构建枯草芽孢杆菌工程菌表达角蛋白酶，并用于羽毛粉发酵饲料，极大降低了角蛋白酶的投入成本；且适用于市场化生产，应用前景广阔。