一种多孔细胞基板载玻片及其制备工艺的制作方法

本发明涉及医学检测，具体为一种多孔细胞基板载玻片及其制备工艺。

背景技术：

1、载玻片是进行生物实验时放置材料的载体，巴氏染色、he实验、免疫组织化学染色、原位杂交等均可利用其进行检测。其中，免疫荧光分析试验和液基细胞试验被广泛用于临床检测。

2、免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。在免疫荧光分析中，影响其性能的一个主要因素的是抗原抗体的固定。抗原抗体的固定方式、固定的数量、活性的大小等直接影响免疫荧光分析准确性、灵敏度等性能。目前常见的固定方式有吸附法，交联法等。吸附法是一种通过物理吸附作用将细胞与组织固定于玻片表面的方法。玻片表面经过处理或修饰后，抗原抗体由于分子间作用力直接固定于玻片表面。但是此种吸附法不适用于容易掉落的细胞或组织样本。交联法是采用双功能团试剂，在生物活性单元之间或生物活性单元与凝胶/聚合物之间交联形成网状结构而使生物活性单元固定化的方法。

3、液基细胞学技术是将脱落细胞保存在保存液中，在载玻片上涂抹薄薄一层细胞制成细胞涂片，经过染色后供医生进行阅片。在液基细胞制片过程中，载玻片通常作为脱落细胞黏附的基底。然而研究与临床试验结果表明，未经任何试剂处理的玻片黏附效果差，细胞易团聚。这使得镜检时细胞数量少，形态难以观察清晰而导致出现假阳性诊断结果。目前市场上的防脱载玻片有醛基基片、氨基基片、巯基片、异硫氰酸片、琼脂糖片等，但防脱效果不稳定且均只能实现单样本检测。单样品检测顾名思义一张载玻片上只能执行一个样本的检测，但目前临床医学中检测样本繁多，单通量载玻片效率低下。此外，在临床医学中，由于检测严谨性的需要，会对组织的不同结构水平进行同种检测，要求检测时间检测条件完全一致，传统意义上的载玻片已远远不能满足实际需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种多孔细胞基板载玻片及其制备工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种多孔细胞基板载玻片及其制备工艺，包括以下步骤：

3、步骤1：

4、将多孔载玻片浸泡在乙醇溶液中，超声10～15min，然后用氮气吹干后放在0.5～1mol/l的naoh溶液中浸泡1～2h，用去离子水冲洗去除残留溶液，用氮气吹干后放在0.5～1mol/l的hcl溶液中浸泡1～2h，用去离子水冲洗去除残留溶液，用氮气吹干得到预处理多孔载玻片；

5、步骤2：

6、s21：将壳聚糖加入至过氧化氢溶液中，室温搅拌20～24h，用丙酮洗涤，离心、冷冻，得到氧化壳聚糖；

7、s22：将氧化壳聚糖加入至水性聚氨酯中，搅拌10～12h得到改性聚氨酯；

8、步骤3：

9、s31：取壳聚糖，溶于加入稀盐酸，在400～450w微波功率、40～50℃反应5～10min；加入双氰胺，调节体系ph至1～2，继续在90～100℃、400～450w微波功率、磁力搅拌下，通冷凝水，微波反应10～15min，乙醇析出白色絮状产物，过滤、烘干、研磨，得到壳聚糖双胍盐酸盐；

10、s32：取1～2份纳米二氧化硅加入到100份壳聚糖醋酸溶液中，搅拌加入戊二醛反应2～3h得到改性二氧化硅；

11、s33：将壳聚糖双胍盐酸盐、改性二氧化硅和改性聚氨酯混合，加入混合物总质量分数5％的戊二醛交联，在60～65℃下反应5～8h得到亲水涂料；

12、步骤4：

13、将丙烯酸树脂、水性聚氨酯、有机溶剂、着色剂、分散剂、固化剂、消泡剂、疏水试剂和增粘剂混合，得到疏水涂料；

14、步骤5：

15、将疏水涂料丝网印刷在预处理多孔载玻片孔外部区域，干燥形成厚度为30～50μm疏水涂层；将亲水聚氨酯涂覆在多孔载玻片孔内区域，干燥形成厚度为10～15μm的亲水涂层或对孔内区域进行等离子处理，等离子处理功率为200～250w，处理时间为20～30s；或进行孔内防脱处理，孔内防脱处理的方法为多孔细胞基板载玻片放置于无水乙醇中，浸泡1～5min，取出用蒸馏水漂洗、烘干后；将洗净的载玻片放入5％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷丙酮溶液中，浸泡、取出，晾干。

16、进一步的，s21中，壳聚糖与过氧化氢溶液的质量比为(1～3)：50，过氧化氢溶液的质量分数为10％。

17、进一步的，s22中，改性聚氨酯中各组分含量，按重量百分数计，3～5％氧化壳聚糖、95～97％水性聚氨酯。

18、进一步的，s31中，n(壳聚糖氨基)：n(双氰胺)为1：(3～5)。

19、进一步的，s33中，按重量百分数计，2～3％壳聚糖双胍盐酸盐、1～2％改性二氧化硅，余料为改性聚氨酯。

20、进一步的，步骤4中，疏水涂料中，各组分含量，按重量份数计，50～80份丙烯酸树脂、15～30份水性聚氨酯、50～80份有机溶剂、10～15份着色剂、20～25份分散剂、1～10份固化剂、1～2份消泡剂、5～15份疏水试剂和4～10份增粘剂。

21、进一步的，步骤4中，有机溶剂为异佛尔酮、环己酮中的至少一种；着色剂为彩色颜料；分散剂为三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、焦磷酸钠中的任一种；固化剂为二乙二醇二丙烯酸醋、丁二醇二丙烯酸醋、三氢甲基丙烷三丙烯酸醋中的任一种；消泡剂为聚二甲基硅氧烷；疏水试剂为六甲基二硅氮烷；增粘剂为阿拉伯胶、明胶、羟甲基纤维素中的任一种。

22、进一步的，步骤5中，疏水涂层厚度为30～50μm；亲水涂层厚度为10～15μm。

23、与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：本发明提供了一种孔外疏水、孔内亲水的多孔细胞基板载玻片，通过在孔外、孔内涂覆不同的疏水和亲水材料，改变载玻片的亲/疏水性能。

24、在制备疏水涂层时，将丙烯酸树脂、水性聚氨酯、有机溶剂、着色剂、分散剂、固化剂、消泡剂、疏水试剂和增粘剂进行混合后，丝网印刷在载玻片表面孔外部分形成疏水区域；疏水区域可以使得载玻片在同时进行多个样本的高通量检测工作时，抑制检测试剂的外溢。

25、在制备亲水涂层时，经过过氧化氢氧化的壳聚糖1,4-β-d-糖苷键和氢键断裂，变成小分子的氧化壳聚糖，与水性聚氨酯共混后，二者之间产生氢键作用，氧化壳聚糖被水性聚氨酯链段“限制”；在戊二醛的作用下，壳聚糖双胍盐酸盐和壳聚糖改性二氧化硅与氧化壳聚糖上的氨基交联反应。交联反应刚开始发生时，氧化壳聚糖和水性聚氨酯链段之间的氢键作用较强，因此壳聚糖双胍盐酸盐和二氧化硅被氧化壳聚糖“吸引”，从而实现二氧化硅在聚氨酯中的良好分散。二氧化硅的引入提高了涂料亲水，壳聚糖双胍盐酸盐对细胞具有良好的粘附作用，在实际应用中起到防止脱片的效果。

26、需要补充说明的是，必须将对氧化壳聚糖用量进行控制。氧化壳聚糖用量过低时，会被聚氨酯网络所“包裹”，从而无法与壳聚糖双胍盐酸盐、改性二氧化硅发生交联反应；而氧化壳聚糖用量过高，则会造成大量游离氧化壳聚糖发生团聚；当氧化壳聚糖的用量控制在改性聚氨酯总质量的3～5％时，聚氨酯乳液中出现少量团聚，其乳液粒径变大，从而提高更大的表面积，有利于二氧化硅在涂料中悬浮、分散，避免出现团聚、沉积的现象。