一种未具有转移潜能的中国人肺腺癌细胞株的制作方法与工艺

本发明属微生物动物细胞系领域，涉及中国人肺腺癌细胞株，具体涉及一种未具有转移潜能的中国人肺腺癌细胞株(TheChineseHumanLungAdenocarcinomacell，Yang6尤其是亲代细胞致瘤但未见转移特性的中国人肺腺癌细胞株(Yang6)及其用途。

背景技术：
肺癌是严重威胁人类生存和发展的恶性疾病之一，已成为肿瘤疾病中的头号杀手。有统计显示，2006年美国确诊肺癌新病例约174470人，约占全部肿瘤的13％(男性)和12％(女性)，发病率仅次于皮肤癌；死于肺癌者约162460人，约占全部肿瘤的31％(男性)和26％(女性)，死亡率位居第一[1～2]；日本每年肺癌新发病例超过50000人，死亡率近90％。上海市近年的恶性肿瘤发病调查显示，肺癌(21.56％)高居上海男性恶性肿瘤发病率榜首，在女性则仅次于乳腺癌。目前，临床治疗中，肺癌死亡率长期居高不下的主要原因在于难以早期诊断和其高转移性，许多患者首诊时即发现有多器官转移；由于肺癌转移的生物学机制至今尚不明确，临床缺乏有效的治疗方法，因此，研究肺癌转移发病机制并探索有效的诊疗方法是国内外学者长期以来的努力方向。当前，随着分子生物学、信号传导途径、蛋白功能研究等基础学科的发展，人类对疾病发病机理的研究手段有了突飞猛进的发展，但由于种种客观限制，该领域的研究仍未有重要突破。虽然宿主微环境因素，包括破骨细胞以及一些具有生长因子功能的基质蛋白等对肿瘤的转移具有一定的作用，但有研究发现，肿瘤细胞自身生物学特性无疑是骨转移发生更为主要而直接的原因。由于大多数晚期肺癌均会发生转移，却很少有未发生转移的临床现象，因此，如能在建立有效的人肺腺癌转移细胞模型的同时建立不发生转移的人肺腺癌细胞模型，这不仅能比较、筛选、确定转移标志，且能做敲除、转染处置，为肺腺癌的发生、发展、肺腺癌机制的研究提供更好的模型好研发平台，这将有助于提升肺腺癌转移的基础研究水平和临床诊疗水平。与本发明有关的参考文献有：[1].AmericanCancerSociety.Cancerfactsandfigures2006.Atlanta，GA：AmericanCancerSociety；2006.pp.5～6[2].AlexG.Littlea，E.GreerGayb，LaurieE.Gasparc，AndrewK.Stewartd.Nationalsurveyofnon-smallcelllungcancerintheUnitedStates：Epidemiology，pathologyandpatternsofcare.LungCancer2007，57(2)：253-260[3].SaburoSone&SeijiYano.Molecularpathogenesisanditstherapeuticmodalitiesoflungcancermetastasistobone.CancerMetastasisRev.SpringerScience+BusinessMedia，LLC.2007[4].2003年上海市市区恶性肿瘤发病率.肿瘤，2006，26(7)：694.[5].J.S.Nam，A.M.Suchar，M.J.Kang，etal.BoneSialoproteinMediatestheTumorCell-TargetedPrometastaticActivityofTransformingGrowthFactorbetainaMouseModelofBreastCancer.CancerRes.2006；66(12)：6327-35.[6].HayashiC，RittlingS，HayataT，etal.Serumosteopontin，anenhanceroftumormetastasistobone，promotesBl6melanomacellmigration.JCellBiochem.2007；101(4)：979-86.[7].杨顺芳，苏建中，曹杰，张佩玲，陆建英，谢文晖。中国人肺腺癌细胞系CPA-Yang1的建立及其生物学特性。中国肺癌杂志2009，12(7)：753-759[8].杨顺芳，苏建中，时梅萍，赵兰香，张佩玲，曹杰，陆建英，谢文晖.中国人肺腺癌细胞系CPA-Yang2的建立及生物学特性.中国肺癌杂志，2009，12(10)：1055-1060。[9].杨顺芳，时梅萍，曹杰，苏建中，赵兰香，雷贝，常城，陆建英，叶剑定，谢文晖。中国人肺腺癌细胞系CPA-Yang3及其骨转移细胞的建立。中国肺癌杂志，2011，14(2)：79-85。

技术实现要素：
本发明的目的是提供一种未具有转移潜能的中国人肺腺癌细胞株；本发明的进一步目的是提供所述肺腺癌细胞株的医用用途。本发明采用取自首诊65岁女性肺腺癌患者的胸腔积液作细胞原代培养材料，通过细胞培养，获得未具有转移潜能的中国人肺腺癌细胞株(Yang6)，已于2011年10月28日保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo.5404，分类命名：中国人肺腺癌细胞株Yang6(TheChineseHumanLungAdenocarcinomacell，Yang6)。本发明经实验裸鼠动物实验，结果证实，所述的未具有转移潜能的中国人肺腺癌细胞株(Yang6)，贴壁生长，具有不转移性，细胞形态优美呈圆形或部分多边形，生长速度缓慢。本发明中，采集晚期肺腺癌首诊患者的新鲜胸水50毫升，每个细胞培养瓶吸8毫升胸水和双抗后稍摇匀，放入培养温度为37℃、CO2浓度为5％的德国贺利氏BB16型二氧化碳孵养箱内培养；一周后光镜下观察，发现细胞培养瓶底稀疏长出细胞；10天后，光镜下观察时发现细胞培养瓶底长出细胞较前几天略多；所述细胞生长增速不快，细胞很小呈贴壁生长；细胞形态规则，多边形、均匀；培养初期细胞生长缓慢；细胞形态不稳定，传至第9代，细胞形态基本定型，生长速度变化不大；裸小鼠皮下种植细胞2×106/只，每代均致瘤，但是皮下瘤生长缓慢，3个月仅生长出0.2-0.3cm2大小瘤子；冻存复苏后性状不变；在相差倒置显微镜下观察上述细胞生长情况：贴壁细胞中多边形和圆形约各占70％和30％；细胞生长缓慢，可见分裂相，多核，获得本发明的未具有转移潜能的中国人肺腺癌细胞株(Yang6)。本发明中，上述细胞各代能使裸鼠皮下致瘤，亲代细胞和瘤细胞经左心室种植5只小鼠2个月后行99mTc-MDPmicropinhole骨显像均未检出骨转移灶；各小鼠生存期均大于6个月。本发明所述的细胞株具有以下生物学特性：1、致瘤率低，各代细胞均能皮下种植致瘤但瘤体生长缓慢；2、无任何骨转移和其他脏器转移。本发明中所述的未具有转移潜能的中国人肺腺癌细胞株Yang6为特殊的国人肺腺癌细胞系，其生长速度缓慢，细胞形态异常，各代均致瘤但左心室造模却未见任何骨转移和其他脏器转移；所述的细胞株Yang6可作为人肺腺癌的比较研究细胞模型，其具有独特的分子生物学特性、异质性、多态性，在揭示人肺腺癌的转移机制和抗转移药物筛选的应用中有着广阔的前景。附图说明图1为p2细胞生长图。图2显示了p2细胞生长情况。图3显示了P3细胞100倍的形态。图4显示了P6细胞在40倍倒置显微镜下形态，其中，P6后细胞形态呈稳定、缓慢生长。图5显示了本发明所述细胞的第四代送检染色体分析情况。图6显示了本发明所述细胞为亚三倍体。图7显示了本发明所述细胞的培养情况，其中，自采集新鲜胸腔积液细胞培养出各代细胞均能皮下种植致瘤，皮下种植100万细胞但瘤体生长缓慢，将3只实验鼠饲养5个月后处死后取材细胞培养。图8显示了Yang6p6细胞H&E染色形态。图9显示99mTc-MDPmicropinhole骨显像左心室注射百万Yang6细胞未见任何骨转移。图10为荧光定量PCR结果。具体实施方式实施例1取初诊肺腺癌患者的淡黄色胸水培养物，首代细胞培养在其本人胸水中体外培养后，3天后5瓶细胞培养瓶收集该患者的肺腺癌细胞达30万；以2×106细胞量/0.1mL/只，种植免疫缺陷小鼠BALB/cnu-nu裸鼠腋下皮下，SPF级饲养1.5个月小鼠皮下长出0.5cm3，2个月仅长出0.5-0.8CM3，，结果显示，裸鼠SPF环境下饲养，所述癌细胞从亲代-p9代细胞都能皮下致瘤，但瘤子生长缓慢；将皮下瘤取出做细胞培养，扩增后实验裸鼠左心室注射，3个月后仍未见小鼠异常。在相差倒置显微镜下观察Yang6细胞生长情况：贴壁细胞中多边形和圆形约各占70％和30％，细胞生长缓慢，可见分裂相，多核；在相差显微镜下，p2细胞生长如图1，2所示，P3细胞100倍如图3所示；40倍倒置显微镜P6细胞如图4所示；P6后细胞形态呈稳定、缓慢生长；相差显微镜下活细胞呈不典型上皮类细胞生长，边界清晰、形态小而均匀、贴壁生长；细胞形态同乳腺癌MDA-MB-231，获得本发明的未具有转移潜能的中国人肺腺癌细胞株(Yang6)。所述培养物的培养条件、检测存活条件为：培养基为含10％胎牛血清RPMI1640或DMEM培养基，pH＝7，培养温度为37℃，5％CO2孵养箱培养；5-7天换培养液；所述的人肺腺癌细胞(Yang6)1×106，注入免疫缺陷小鼠血液系统，两周后隔天称重，第三周起每周进行核素骨显像检测，核素骨显像证实该细胞无骨转移能力。该人肺腺癌细胞(Yang6)可作为一个少见的、不活跃的中国人肺腺癌细胞进行比较研究。实施例2基因表达水平比较试验采用RT-PCR法对获得的未具有转移潜能的中国人肺腺癌细胞株Yang6与A549进行SERPINA1，IGFBP2，CDH1，KRT19，ARG2和TMEM100基因等表达水平的比较；结果表明，本发明的细胞株Yang6为一特殊的国人肺腺癌细胞系，其生长速度缓慢，细胞形态异常，各代均致瘤但左心室造模却未见任何骨转移和其他脏器转移；进一步经利用该细胞做8种化疗药物的敏感性试验后，临床根据试验结果使用诺维本+顺铂方案临床治疗实施例1的肺腺癌患者，显示有一定疗效。所述的细胞株Yang6其具有独特的分子生物学特性、异质性、多态性，可作为人肺腺癌的比较研究细胞模型，在揭示人肺腺癌的转移机制和抗转移药物筛选的应用中将有着广阔的前景。