本发明属于生物工程的技术领域，具体的说，是棘白菌素B产生菌株及其应用。
背景技术：
在过去的二十多年时间里严重危害人类生命健康的真菌感染，无论是在死亡率以及感染的种类方面都在不断的增加，特别是在免疫抑制病人中。目前用于治疗临床深部真菌感染的主要药物是唑类抗真菌药物和两性霉素B。虽然这两类药物对控制临床深部真菌感染起到了重要的作用，但由于这些药物具有以下三方面的不足，使深部真菌感染疾病的死亡率居高不下：一是由于这两类药物的作用靶点都是真菌细胞膜，其选择性差而导致产生较大的毒副作用；二是由于临床耐药真菌的广泛出现而使这些药物疗效降低；三是这些药物对诸如曲霉和白念珠菌等真菌的敏感性不强，致使临床上难以控制这类真菌感染的疾病。芬净类(棘白菌素类)抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物，具有相同的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链的结构特征，能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1，3-葡聚糖合成酶的活性。其独特的作用机制，不仅毒副作用低，且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性，尤其是对诸如曲霉和白念珠菌等呈现上升趋势的真菌具有独特的疗效，是目前临床治疗深部真菌感染的“王牌抗生素”。因此，国外大制药公司经过30多年的研究开发，已经成功地上市了三个芬净类抗真菌药物，即卡帕芬净、米卡芬净和阿尼芬净。阿尼芬净(Anidulafungin)是第三代棘白菌素类的半合成抗真菌药物，由美国的Vicuron制药公司研发，后被辉瑞公司收购。与传统的作用于真菌浆膜中麦角固醇的抗真菌药不同，阿尼芬净是一种1，3-β-D-葡聚糖合成抑制剂。1，3-β-D-葡聚糖是真菌细胞壁的重要组成部分，阿尼芬净通过抑制真菌1，3-β-D-葡聚糖合成酶，使真菌细胞壁中1，3-β-D-葡聚糖含量减少，造成细胞壁的完整性被破坏，细胞内渗透压不稳定，最终导致真菌细胞溶解死亡。由于哺乳动物细胞没有细胞壁，缺乏1，3-β-D-葡聚糖合成酶，故阿尼芬净对真菌具有较高的特异性，一般不会产生类似两性霉素B那样的细胞毒性，并与现有的抗真菌剂之间不存在交叉耐药性。阿尼芬净通过对棘白菌素B(EchinocandinB)进行侧链改造获得。对棘白菌素B的侧链进行酶解，然后连接新的侧链。棘白菌素B可由Aspergillusrugulovalvus(异称Aspergillusrugulosus)发酵产生。由于棘白菌素B的发酵产量很低，进而影响了阿尼芬净的产量。因此，本领域迫切需要一种棘白菌素B产量高、遗传性状稳定的高产菌株。
技术实现要素：
本申请的发明人以AspergillusrugulovalvusATCC58398为出发菌株，经随机诱变后筛选到一株棘白菌素B产生菌株，并将其进行了保藏，保藏号为CGMCCNo.5413。因此，本发明的第一个目的在于，提供一种Aspergillusrugulovalvus，其保藏号为CGMCCNo.5413。本发明的第二个目的在于，提供所述AspergillusrugulovalvusCGMCCNo.5413用于生产棘白菌素B的应用。本发明的第三个目的在于，提供一种棘白菌素B的生产方法。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：作为本发明的第一方面，一种棘白菌素B产生菌株为AspergillusrugulovalvusATCC58398菌株的突变菌株，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.5413，保藏日期2011年10月28日。作为本发明的第二方面，所述的菌株用于生产棘白菌素B的应用。作为本发明的第三方面，一种棘白菌素B的生产方法，其特征在于，通过发酵权利要求1所述的AspergillusrugulovalvusCGMCCNo.5413获得棘白菌素B。所述发酵的条件如下：发酵培养基(wt)：麦芽糖6.0％，糊精2.0％，棉籽粉3.0％，酵母粉1.5％，油0.2％，谷氨酸0.3％，KH2PO40.1％；发酵液培养温度25℃，培养7天；摇瓶转速220rpm/min。经过发酵获得的发酵液中棘白菌素B的含量达到800mg/l左右。本发明的有益效果：本发明提供的棘白菌素B产生菌株，遗传性状稳定，具有良好的工业化应用价值。利用本发明提供的发酵条件，可以稳定的产生棘白菌素B。本发明的出发菌株经紫外长波诱变、紫外短波诱变、γ-射线(60Co)诱变和NTG诱变，通过反复筛选，获得棘白菌素B产生菌株，棘白菌素B的产量可达800mg/l左右。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。发明人以AspergillusrugulovalvusATCC58398为出发菌株，经(菌种选育、物理化学诱变)随机诱变后筛选到一株棘白菌素B产生菌株，并将其进行了保藏，具体的保藏信息如下：中国普通微生物菌种保藏管理中心北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所邮编：100101保藏日期：2011年10月28日保藏编号CGMCCNo.5413Aspergillusrugulovalvus实施例1突变菌株稳定性考察培养基：斜面/平板培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基。种子培养基(wt)：葡萄糖1.0％，甘油1.0％，棉籽饼粉2.5％。发酵培养基(wt)：麦芽糖6.0％，糊精2.0％，棉籽粉3.0％，酵母粉1.5％，油0.2％，谷氨酸0.3％，KH2PO40.1％。培养条件：斜面培养温度28℃，培养时间5天；种子液培养温度25℃，培养3天；发酵液培养温度25℃，培养7天。摇瓶转速220rpm/min。每一代菌株摇瓶培养5瓶，进行平行实验。HPLC检测发酵产物，取所测含量的平均值。发酵液处理过程：发酵液2ml加入8ml甲醇，振荡混匀后浸泡2小时。取上清1ml于EP管12000rpm离心10分钟，上清进行HPLC检测。HPLC检测条件如下：色谱柱：HypersilODS2，C-18，4.6×250mm，5μm检测器：Aligent1100，DAD(210，223，260，280，276)检测波长：210nm柱温：40℃流速：1ml/min流动相：A：水，B：甲醇分析时间：15min梯度条件如下：posttime＝5min，见表1。表1HPLC的梯度条件Time(min)A％B％FLOW025751.0ml/min1510901.0ml/min2001001.0ml/min检测结果见表2。表2不同传代数的突变菌株中棘白菌素B的含量(mg/l)。传代数1234棘白菌素B含量mg/l783834810798由表2可见，该突变菌株经过传代考察证明遗传稳定性，合理的传代后棘白菌素B的产量为此在同等水平。本发明由出发菌株经诱变获得的棘白菌素B产生菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.5413。本发明的微生物采用的发酵培养基为：麦芽糖6.0％，糊精2.0％，棉籽粉3.0％，酵母粉1.5％，油0.2％，谷氨酸0.3％，KH2PO40.1％，经过发酵获得的发酵液中棘白菌素B的含量达到800mg/l左右。实施例2突变菌株与出发菌株的比较培养基、培养条件和检测方法，如实施例2。突变菌株与出发菌株的比较，以棘白菌素B含量为例，其比较结果如表3：表3突变菌株与出发菌株的比较菌种出发菌株突变变株棘白菌素B含量(mg/l)60823相对量100％1372％相对提高倍数-12.7倍由表3可见，本发明制备的突变菌株的棘白菌素B的含量与出发菌株的棘白菌素B的含量相比，相对提高倍数12.7倍。对本发明提供的产生菌株进行发酵，可以高产量获得棘白菌素B，从而可以保证阿尼芬净的产量、降低阿尼芬净成本。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。