本申请要求2011年10月31日提交的美国临时申请号61/553,916的优先权益，所述文献因而通过引用的方式完整并入。
发明领域
本发明提供了包含抗IL-13抗体的制剂，包括药物制剂和使用这类制剂的方法。
序列表
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背景
白介素(IL)-13是多效性的T辅助细胞亚类2(Th2)细胞因子。已经推测IL13可能比其他Th2细胞因子在与哮喘症状相关的效应子功能方面发挥更明显作用(Corry,Curr.Opin.Immunol.,11:610(1999))。已经描述了人源化抗IL-13抗体。见，例如，Intn'lPub.No.2005/062967。已经临床上研究一种特殊抗-IL13抗体，来金珠单抗(lebrikizumab)用于治疗哮喘控制不良的患者。这些结果的某些已经在Corren等人,NEnglJMed365(12):1088-98(2011)中描述。
因为蛋白质(包括抗体)比传统有机和无机药物更大和更复杂(例如，除复杂的三维结构之外，拥有多个官能团)，所以这类蛋白质的制剂带来特殊问题。为了蛋白质保持生物活性，制剂必须保证蛋白质的至少核心氨基酸序列的构象完整性完好无损，而同时保护蛋白质的多个官能团免于降解。蛋白质的降解途径可能涉及化学不稳定性(例如，涉及通过产生新化学实体的键形成或切割而修饰蛋白质的任何过程)或物理不稳定性(例如，蛋白质高级结构的变化)。化学不稳定性可以因脱酰胺化、外消旋化、水解、氧化、β消除或二硫键交换产生。物理不稳定性可以例如因变性、聚集、沉淀或吸附产生。三个最常见的蛋白质降解途径是蛋白质聚集、脱酰胺化和氧化。Cleland等人CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems10(4):307-377(1993)。
例如，对于治疗性施用途径或对于治疗性应用，高浓度(例如，>100mg/mL)液态抗体制剂是合乎需要的，其中推荐小体积药物，例如，用于皮下注射。然而，高浓度抗体制剂，带来众多的难题和问题。一个问题是因颗粒形成所致的不稳定性。对于复水的液态制剂，已经通过使用表面活性剂(例如，聚山梨酯)解决这个问题，但是有时认为表面活性剂不适用于液态制剂，因为它们导致难以进一步加工。另外，表面活性剂也不降低增加的粘度，所述增加的粘度因抗体的大分子性质导致众多分子间相互作用而造成。
虽然表面活性剂已经显示明显减少蛋白质颗粒形成的程度，但是它们并未解决导致难以操作和施用浓缩抗体制剂的粘度增加问题。抗体倾向于在高浓度形成粘稠溶液，原因在于它们的大分子性质和分子间相互作用潜力。另外，经常使用可药用的糖作为稳定剂。这类糖可以增强分子间相互作用，因而增加制剂的粘度。高度粘稠的制剂难以制造、抽入注射器中并皮下注射。操作粘稠制剂时力的使用导致过度发泡，这可能导致活性生物制品变性和失活。
已经描述了高浓度抗体的某些制剂。见，例如，Intn'l公开号2006/065746和2002/30463。这些出版物没有具体描述高浓度的抗-IL13抗体。
将高度有利的是具有包含抗IL-13抗体的下述制剂，所述制剂具有延长的稳定性的和在高抗体浓度时具有低粘度。具有这类特性的高抗体浓度制剂将对某些施用途径(例如，皮下施用)而言是高度有利的。本文提供的制剂满足这些需要并且提供其他有用的益处。
本文中提到的全部参考文献，包括专利申请和出版物，通过引用的方式完整并入本文用于任何目的。
概述
本发明的组合物基于，至少部分地基于以下发现：可以在含有多元醇和表面活性剂的组氨酸缓冲液中以高浓度(>100mg/mL)配制本文所述的抗-IL13抗体(来金珠单抗)并且这类高抗体浓度制剂具有低粘度、具有延长的物理及化学稳定性并且维持效力。本发明的组合物或制剂可用于例如治疗哮喘和其他肺病症，如特发性肺纤维化和某些变应性疾病、自身免疫疾病和其他炎性疾病。此外，这类制剂可以包装至如本文所述的皮下施用装置中，同时维持例如产品稳定性和其他合乎需要的属性。
因此，在一个方面，提供一种包含抗-IL13抗体的制剂。在某些实施方案中，抗体在制剂中的浓度是至少100mg/mL并且制剂的粘度是在25℃小于15厘泊(cP)。在另一个实施方案中，抗IL13抗体包含三个重链CDR：具有SEQIDNO.:1的氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQIDNO.:2的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQIDNO.:3的氨基酸序列的CDR-H3，和三个轻链CDR：具有SEQIDNO.:4的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQIDNO.:5的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQIDNO.:6的氨基酸序列的CDR-L3。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:7的氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:9的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:10的氨基酸序列的重链。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:14的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:7的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO.:9的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:10的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO.:14的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，抗体的浓度是125mg/mL。在一个实施方案中，抗体的浓度是150mg/mL。
在另一个方面，该制剂包含pH5.4至6.0的乙酸组氨酸缓冲液，并且缓冲液中的乙酸组氨酸浓度在5mM和40mM之间。在某些实施方案中，该制剂包含多元醇和表面活性剂，并且多元醇在制剂中的浓度在100mM和200mM之间并且表面活性剂在制剂中的浓度在0.01％和0.1％之间。在某些实施方案中，多元醇是蔗糖并且表面活性剂是聚山梨酯20。在某些实施方案中，乙酸组氨酸缓冲液具有pH5.7并且缓冲液中的乙酸组氨酸浓度是20mM，并且蔗糖在制剂中的浓度是175mM以及聚山梨酯20的浓度是0.03％。在一个实施方案中，抗体的浓度是125mg/mL或150mg/mL。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含三个重链CDR：具有SEQIDNO.:1的氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQIDNO.:2的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQIDNO.:3的氨基酸序列的CDR-H3，和三个轻链CDR：具有SEQIDNO.:4的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQIDNO.:5的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQIDNO.:6的氨基酸序列的CDR-L3。
在又一个方面，该制剂包含在pH5.4至6.0的乙酸组氨酸缓冲液中抗IL13抗体，并且缓冲液中的乙酸组氨酸浓度在5mM和40mM之间并且抗体在制剂中的浓度是至少100mg/mL。在某些实施方案中，该制剂还包含多元醇和表面活性剂，并且多元醇在制剂中的浓度在100mM和200mM之间并且表面活性剂在制剂中的浓度在0.01％和0.1％之间。在一个实施方案中，多元醇是蔗糖并且表面活性剂是聚山梨酯20。在一个实施方案中，乙酸组氨酸缓冲液具有pH5.7并且缓冲液中的乙酸组氨酸浓度是20mM，并且其中蔗糖在制剂中的浓度是175mM以及聚山梨酯20的浓度是0.03％。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含三个重链CDR：具有SEQIDNO.:1的氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQIDNO.:2的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQIDNO.:3的氨基酸序列的CDR-H3，和三个轻链CDR：具有SEQIDNO.:4的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQIDNO.:5的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQIDNO.:6的氨基酸序列的CDR-L3。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:7的氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:9的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:10的氨基酸序列的重链。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:14的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:7的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO.:9的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:10的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO.:14的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，该制剂具有在25℃小于15厘泊(cP)的粘度。在一个实施方案中，抗体的浓度是125mg/mL。在一个实施方案中，抗体的浓度是150mg/mL。
在又一个方面，提供了具有延长的稳定性的包含抗IL-13抗体的制剂。在某些实施方案中，抗体浓度是至少100mg/mL并且粘度是在25℃小于15厘泊(cP)。在一个实施方案中，抗IL-13抗体在5℃稳定至少一年。在一个实施方案中，抗IL-13抗体在5℃稳定至少两年。在一个实施方案中，抗-IL13抗体在5℃稳定三年。在一个实施方案中，抗IL13抗体在25℃稳定至少4周，或在25℃稳定至少8周，或在25℃稳定至少12周，或在4℃稳定26周。在一个实施方案中，该制剂包含pH5.4至6.0的乙酸组氨酸缓冲液，并且缓冲液中的乙酸组氨酸浓度在5mM和40mM之间。在一个实施方案中，该制剂还包含多元醇和表面活性剂，并且多元醇在制剂中的浓度在100mM和200mM之间并且表面活性剂在制剂中的浓度在0.01％和0.1％之间。在一个实施方案中，多元醇是蔗糖并且表面活性剂是聚山梨酯20。在一个实施方案中，乙酸组氨酸缓冲液具有pH5.7并且缓冲液中的乙酸组氨酸浓度是20mM，并且蔗糖在制剂中的浓度是175mM以及聚山梨酯20的浓度是0.03％。在一个实施方案中，抗体的浓度是125mg/mL或150mg/mL。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含三个重链CDR：具有SEQIDNO.:1的氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQIDNO.:2的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQIDNO.:3的氨基酸序列的CDR-H3，和三个轻链CDR：具有SEQIDNO.:4的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQIDNO.:5的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQIDNO.:6的氨基酸序列的CDR-L3。
在又一个方面，提供一种包含抗-IL13抗体的制剂，所述制剂在20mM乙酸组氨酸缓冲液pH5.7，175mM蔗糖，0.03％聚山梨酯20中具有延长的稳定性。在一个实施方案中，抗体在制剂中的浓度是125mg/mL并且制剂的粘度是在25℃小于15厘泊(cP)。在一个实施方案中，抗体在制剂中的浓度是150mg/mL并且制剂的粘度是在25℃小于15厘泊(cP)。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含三个重链CDR：具有SEQIDNO.:1的氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQIDNO.:2的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQIDNO.:3的氨基酸序列的CDR-H3，和三个轻链CDR：具有SEQIDNO.:4的氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQIDNO.:5的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQIDNO.:6的氨基酸序列的CDR-L3。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:7的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO.:9的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:10的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO.:14的氨基酸序列的轻链。
在又一个方面，提供一种包括皮下施用装置的制造品。在某些实施方案中，该皮下施用装置向患者递送近平剂量(flatdose)的抗-IL13抗体。在一个实施方案中，该近平剂量是37.5mg抗-IL13抗体。在一个实施方案中，该近平剂量是75mg抗-IL13抗体。在一个实施方案中，该近平剂量是125mg抗-IL13抗体。在一个实施方案中，该近平剂量是150mg抗-IL13抗体。在某些实施方案中，抗-IL13抗体是来金珠单抗。将皮下施用装置中的抗-IL13抗体配制在如上文所述的缓冲液和其他赋形剂中，从而将它以稳定的药物制剂形式提供。在某些实施方案中，该皮下施用装置是预充式注射器，其包括玻璃针管、包括活塞挡止器(plungerstopper)的活塞杆和针头。在某些实施方案中，该皮下施用装置还包括针护罩和任选地针护罩装置。在某些实施方案中，预充式注射器中含有制剂的体积是0.3mL、1mL、1.5mL或2.0mL。在某些实施方案中，针头是包含3斜面尖端或5斜面尖端的柱撑(staked-in)针头。在某些实施方案中，针头在25号(G)和30G之间并且长度在1/2英寸和5/8英寸之间。在一个实施方案中，皮下施用装置包含预充式1.0mL低硼硅酸钨玻璃(I型)注射器和不锈钢5斜面27G1/2英寸长的薄壁柱撑针头。在某些实施方案中，皮下施用装置包含刚性针护罩。在某些实施方案中，该刚性针护罩包含具有低锌含量的橡胶配方。在一个实施方案中，针护罩是刚性并且包含弹性体组分FM27/0和刚性聚丙烯护罩。在某些实施方案中，活塞杆包括橡胶活塞挡止器。在某些实施方案中，橡胶活塞挡止器包含4023/50橡胶和乙烯-四氟乙烯(ETFE)涂层。在某些实施方案中，皮下施用装置包括针头安全装置。示例性针头安全装置包括但不限于Ultrasafe针套X100L(SafetySyringes,Inc.)和RexamSafenSoundTM(Rexam)。
在又一个方面，提供一种治疗患者中哮喘的方法。在某些实施方案中，该方法包括向该患者施用有效量的前述任一种制剂。在某些实施方案中，有效量是0.3mL、0.5mL、1ml或2mL、或者约0.3mL、约0.5mL、约1ml或约2mL。在另一个方面，提供一种治疗患者中特发性肺纤维化的方法。在某些实施方案中，该方法包括向该患者施用有效量的前述任一种制剂。在某些实施方案中，有效量是0.5mL、1ml或2mL、或约0.5mL、约1ml或约2mL。
在又一个方面，提供皮下施用包含抗IL13抗体的制剂的方法。这类方法包括皮下施用上文描述的任何抗-IL13抗体制剂。在某些实施方案中，所述方法包括根据上文所述的任何装置的皮下施用装置。
附图简述
图1显示如实施例1中所述，随pH变化的每周抗-IL13抗体单体降解速率。
图2显示在30℃储存期间随pH变化的抗-IL13抗体溶液在350nm处的溶液浊度增加，如实施例1中所述。
图3显示如实施例1中所述，在30℃储存期间随pH变化的由非还原型CE-SDS度量的低分子量(LMW)可溶性片段和高分子量(HMW)聚集物的变化。
图4显示如实施例1中所述，在30℃随pH变化的酸性变种(AV)和碱性变种(峰1)(BV)形成率。电荷变种形成率表述为垂直轴上显示的％/周。
图5显示如实施例1中所述，在30℃随pH变化的碱性变种(峰2)(BV2)形成率和主要峰(MP)丧失率。电荷变种形成率表述为垂直轴上显示的％/周。
图6显示如实施例1中所述，随抗体浓度和溶液pH变化的抗-IL13抗体的流变学表征。溶液粘度以垂直轴上显示的25℃厘泊(cP)表述。
图7显示如实施例1中所述，不同单克隆抗体在宽浓度范围内的流变学表征。溶液粘度以垂直轴上显示的25℃厘泊(cP)表述。
图8显示如实施例1中所述，使用90度散射比浊法(nephelometry)对随浓度变化的抗-IL13溶液和抗-CD20抗体溶液的目视外观定量。
图9显示如实施例1中所述，随mAb浓度变化的抗-IL13溶液和抗-CD20抗体溶液的浊度量值(A350)。
图10显示如实施例1中所述，随浓度和pH变化的抗-IL13抗体溶液浊度。
图11显示如实施例1中所述，随mAb浓度变化的抗-IL13溶液和抗-CD20抗体溶液的亚可见(subvisible)颗粒物计数。
图12显示如实施例1中所述，125mg/mL抗-IL13抗体溶液的散射比浊(nephelometric)、透射比浊(turbidimetric)和静态光散射的测量。
图13总结了如实施例1中所述，在不同pH条件下125mg/mL和在204mg/mL的抗-IL13抗体的溶液乳光的温度依赖性。
图14总结了如实施例1中所述，对毛细管DSC中两个部分可分辨峰所观察到的随抗-IL13制剂组成和溶液pH变化的热熔跃迁峰。
图15总结了如实施例1中所述，在样品处于如所示的简单缓冲液中并且从0.1-1.0mg/mL测量时，抗-IL13抗体随溶液pH变化的所测量渗透第二维里系数(B2)。
图16显示如实施例1中所述，在1.0-10mg/mL范围，抗-IL13抗体随制剂组成和pH变化的所测量渗透第二维里系数。
图17显示如实施例1中所述，与硬球状体(HS)模型相比，抗-IL13抗体和抗-CD20抗体各自的测量的相对于浓度的静态光散射强度。
图18显示如实施例1中所述，抗-IL13抗体随制剂pH变化的静态光散射数据，所述静态光散射数据表述为在至多200mg/mL的浓度观察到的表观分子量。
图19显示如实施例1中所述，抗-IL13和抗-CD20抗体在溶液中在至多200mg/mL高浓度时的表观分子量。
图20显示如实施例1中所述，在相应配制条件下在25℃对抗-IL13和抗-CD20所测量的剪切粘度。
发明详述
除非另外定义，否则本文中所用的技术与科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。Singleton等人,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology第2版,J.Wiley&Sons(NewYork,N.Y.1994)和March,AdvancedOrganicChemistryReactions，MechanismsandStructure第4版,JohnWiley&Sons(NewYork,N.Y.1992)为本领域技术人员提供了本申请中所用多个术语的一般指南。
定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且在适宜的任何时候，以单数使用的术语还将包括复数形式并且反之亦然。在下文所述的任何定义与通过引用方式并入本文的任何文献抵触的情况下，以下文所述的定义为准。
除非上下文另外清楚地说明，否则如本说明书及所附权利要求书中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指称。因此，例如，对“一个蛋白质”或“一个抗体”的指称分别包括多个蛋白质或多个抗体；对“一个细胞”的指称包括包括细胞的混合物等。
术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许有效成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。这类制剂是无菌的。“可药用的”赋形剂(载体、添加物)是可以合理地施用至受试哺乳动物以提供有效剂量的所用有效成分的那些赋形剂。
“无菌”制剂是无菌或不含或基本上不含所有活微生物和它们的孢子。
“冷冻”制剂是处于0℃以下温度的一种制剂。通常，冷冻的制剂并未冻干，它也没有经历事先或后续冻干。在某些实施方案中，冷冻的制剂包括(在不锈钢罐中)用于储存的冷冻原料药或(在最终小瓶结构中的)冷冻药物。
“稳定”制剂是其中蛋白质在储存时基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的一种制剂。在某些实施方案中，当储存时，制剂基本上保留其物理和化学稳定性，以及其生物活性。通常基于预期的制剂货架期选择储存时间。
如本文所用，具有“延长的稳定性”的制剂意指一个制剂，其中在5℃储存一年或更长时，其内部的蛋白质基本上保持其物理稳定性、化学稳定性和生物活性。在某些实施方案中，储存是在5℃两年或更长时间。在某些实施方案中，储存是在5℃至多三年。
如果视验颜色和/或澄清度时或如通过UV光散射或通过大小排阻层析所测量，蛋白质不显示聚集、沉淀和/或变性迹象或非常少的聚集、沉淀和/或变性，则该蛋白质在药物制剂中“保持其物理稳定性”。
如果化学稳定性在给定的时间是这样，从而认为蛋白质仍保留其如下文定义的生物活性，则该蛋白质在药物制剂中“保持其化学稳定性”。可以通过检测化学改变形式的蛋白质并对其定量，评估化学稳定性。化学改变可以涉及尺寸调整(例如修剪)，这可以例如使用大小排阻层析、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸附电离/飞行时间质谱法(MALDI/TOFMS)评价。其他类型的化学改变包括电荷改变(例如因脱酰胺化而出现)，这可以例如通过离子交换层析或成像毛细管等电聚焦(icIEF)评价。
如果一种抗体的生物活在给出的时间处于制备某药物制剂的时间时所显示的生物活性的约10％范围内(处于测定法误差范围内)，例如，如抗原结合测定法或效力测定法中测定，则该抗体在该药物制剂中“保持其生物活性”。
本文中，单克隆抗体的“生物活性”指抗体与抗原结合的能力。它还可以包括抗体与抗原结合并产生可以在体外或在体内测量的可度量生物学反应。这种活性可以是拮抗性或激动性的。
“脱酰胺”的单克隆抗体是其中一个或多个天冬酰胺残基其已经衍生化成例如天冬氨酸或异天冬氨酸的一种单克隆抗体。
“易于脱酰胺化”的抗体是指这样的一种抗体，其包含一个或多个已经发现易于脱酰胺化的残基。
“易于聚集”的抗体是指这样的一种抗体，其中已经发现所述抗体与其他抗体分子聚集，特别当冷冻和/或搅拌时。
“易于片段化”的抗体是指这样的一种抗体，其中已经发现所述抗体被切割成两个或更多个片段，例如在其铰链区处。
通过“减少脱酰胺化、聚集或片段化”意在相对于在不同pH或在不同缓冲液中配制的单克隆抗体，防止或减少脱酰胺化、聚集或片段化的量。
配制的抗体是基本上纯的并且是合乎需要基本上同质的(例如，不含掺杂性蛋白质等)。“基本上纯的”抗体意指一种组合物，其基于该组合物的总重量包含以重量计至少约90％或以重量计至少约95％的抗体。“基本上同质的”抗体意指一种组合物，其基于该组合物的总重量包含以重量计至少约99％的抗体。
“等渗”意指目的制剂具有与人血液基本上相同的渗透压。等渗制剂将通常具有约250至350mOsm的渗透压。等渗性可以例如使用蒸气压或冰冻型渗透计测量。
如本文所用，术语“缓冲液”指通过其酸-碱共轭组分的作用抵抗pH变化的缓冲溶液。
“组氨酸缓冲液”是包含组氨酸离子的缓冲液。组氨酸缓冲液的例子包括氯化组氨酸、乙酸组氨酸、磷酸组氨酸、硫酸组氨酸、琥珀酸组氨酸等。在一个实施方案中，组氨酸缓冲液是乙酸组氨酸。在一个实施方案中，使用乙酸(液体)滴定L-组氨酸(游离碱，固体)制备乙酸组氨酸缓冲液。在某些实施方案中，组氨酸缓冲液或乙酸组氨酸缓冲液是在pH4.5至6.5之间。在某些实施方案中，组氨酸缓冲液或乙酸组氨酸缓冲液是在pH5.4至6.0之间。在一个实施方案中，缓冲液具有5.6的pH。在一个实施方案中，缓冲液具有5.7的pH。在一个实施方案中，缓冲液具有5.8的pH。
本文中，“表面活性剂”指表面活性剂，一般是非离子表面活性剂。本文中表面活性剂的例子包括聚山梨酯(例如，聚山梨酯20和聚山梨酯80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-(linoleyl-)、或十八烷基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或十八烷基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-、或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-、或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-、或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；和MONAQUATTM系列(MonaIndustries,Inc.,Paterson,N.J.)；聚乙二醇、聚丙二醇和乙烯和丙二醇的共聚物(例如Pluronics、PF68等)等。在一个实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯20。
“防腐剂”是可以在制剂中任选地包含以大幅度减少其中细菌性作用，因此例如促进多用途制剂产生的化合物。可能的防腐剂的例子包括十八烷基二甲基氯化铵、氯己双铵、苯扎氯铵(其中烷基是长链化合物的烷基苄基二甲基氯化铵的混合物)和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳族醇类如苯酚、丁醇和苄醇、烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或尼泊金丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。在一个实施方案中，本文中的防腐剂是苄醇。
“多元醇”是具有多个羟基的物质，并包括糖(还原型和非还原型糖)、糖醇和糖酸。可以在制剂中任选地包含多元醇。在某些实施方案中，本文中的多元醇具有小于约600kD(例如处于约120至约400kD范围内)的分子量。“还原型糖”是一种含有半缩醛基的糖，所述半缩醛基可以还原金属离子或与蛋白质中的赖氨酸和其他氨基共价反应，并且“非还原型糖”是不具有还原糖的这些特性的一种糖。还原型糖的例子是果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非还原型糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖和棉子糖。甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏糖醇、山梨醇和丙三醇是糖醇的例子。对于糖酸，这些包括L-葡糖酸及其金属盐。其中需要制剂是冻融稳定的情况下，多元醇一般是在冷冻温度(例如-200C)不结晶从而它使制剂中的抗体去稳定化的一种多元醇。在一个实施方案中，多元醇是非还原型糖。在一个这种实施方案中，非还原型糖是蔗糖。
如本文所用，“哮喘”指一种复杂病症，特征在于可变和复发性症状、可逆性气流阻塞(例如，借助支气管扩张剂)和可能与潜在的炎症相关或可能不与之相关的支气管高反应性。哮喘的例子包括阿司匹林敏感性/恶化的哮喘、异位性哮喘、严重哮喘、轻度哮喘、中度至重度哮喘、未用过皮质类固醇的哮喘、慢性哮喘、皮质类固醇耐药性哮喘、皮质类固醇难治性哮喘、新诊断和未治疗过的哮喘、因吸烟所致的哮喘、皮质类固醇无法控制的哮喘和如JAllergyClinImmunol(2010)126(5):926-938中所提到的其他哮喘。
如本文所用，“治疗”指意欲改变正在治疗的个体或细胞的天然过程的临床介入，并且可以在临床病理学过程之前或期间进行。想要的治疗效果包括防止疾病或其病状或症状的出现或复发、减轻该疾病的病状或症状、减弱该疾病的任何直接或间接病理学后果、减低病情进展速率、缓解或缓和疾病状态，和实现缓解或改进的预后。
“有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗或预防结果的量。治疗药的“治疗有效量”可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一种量，其中治疗药的任何有毒或有害作用被治疗有益作用超过。
“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，灵长动物(包括人类和非人灵长动物)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
“药物”是治疗疾病、病症和/或病状的活性药物。
“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)指具有相似结构特征的糖蛋白。尽管抗体显示出针对特定抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和通常缺少抗原特异性的其他抗体样分子。后者的多肽例如以低水平通过淋巴液系统产生并且以增加的水平由骨髓瘤产生。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广意义互换地使用并且包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)，多克隆抗体，单价的抗体，多价抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们显示出所需的生物活性)并且也可以包括某些抗体片段(如本文以更多细节中描述)。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
术语“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指处于其基本上完好形式的抗体，不指如下文定义的抗体片段。该术语特别指具有重链的抗体，所述重链含有Fc区。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地包括其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段，称作“Fab片段，各自具有单个抗原结合位点，和一个残余“Fc片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了具有两个抗原结合位点并且是仍能够交联抗原的F(ab')2片段。
“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由处于紧密非共价缔合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。总体上，Fv的6个CDR向抗体赋予抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含3个对抗原特异的CDR的半个Fv)具有识别并结合抗原的能力，虽然以比完整结合部位更低的亲和力进行。
Fab片段含有重链可变域和轻链可变域并且还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段因在重链CH1结构域的羧基端处附加额外几个残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。Fab'-SH在本文中是其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离巯基的Fab'的名称。F(ab')2抗体片段最初作为成对Fab片段产生，所述成对Fab片段在它们之间具有铰链区半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
如本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，构成这个群体的各个抗体是基本上相同的，例外是可能少量存在的可能突变，例如天然存在的突变。因此，修饰语“单克隆”表明该抗体的特征为不是无联系抗体的混合物。在某些实施方案中，这种单克隆抗体一般包括了包含结合某靶的多肽序列的抗体，其中通过以下方法获得靶结合的多肽序列，所述方法包括从多个多肽序列中选择单个靶结合的多肽序列。例如，该选择过程可以是从多个克隆(杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的汇集物)选择独特克隆。应当理解，可以进一步改变所选择的靶结合序列，例如以便改善对该靶的亲和力、以便人源化靶结合序列、以便改善其在细胞培养中的产生、以便降低其体内免疫原性、以便产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体制备物也是有利的，在于它们一般不混杂有其他免疫球蛋白。
修饰语“单克隆的”表明该抗体的特征为从基本上同质的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，根据本发明待使用的单克隆抗体可以通过多种技术产生，包括，例如，杂交瘤方法(例如，Kohler等人,Nature,256:495(1975)；Harlow等人,Antibodies:ALaboratoryManual,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版,1988)；Hammerling等人,引自：MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981)、重组DNA方法(见，例如，美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(见，例如，Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)、和在具有编码人免疫球蛋白序列的部分或全部人免疫球蛋白基因座或基因的动物中产生人抗体或人样抗体的技术(见，例如，WO98/24893；WO96/34096；WO96/33735；WO91/10741；Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature362:255-258(1993)；Bruggemann等人,YearinImmunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks等人,Bio.Technology10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature368:856-859(1994)；Morrison,Nature368:812-813(1994)；Fishwild等人,NatureBiotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
本文中的“单克隆抗体”特别包括这些“嵌合抗体”，其中重链和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时所述链的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们显示所需的生物活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6855-9855(1984))。
“天然抗体”指具有不定结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重结构域或重链可变域，随后是三个恒定域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链结构域或轻链可变域，随后一个恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(见，例如，Kindt等人,KubyImmunology，第6版，W.H.FreemanandCo.，第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域文库。见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature352:624-628(1991)。
“人源化抗体”指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变域的基本上全部以及与人抗体的那些FR对应的全部或基本上全部的FR区，其中可变域的全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”(例如，非人抗体)指已经历过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域的下述区域的每一个，所述区域在序列上高变和/或形成结构上确定的环(“高变环”)。通常，天然4链抗体包含六个HVR；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。示例性高变环存在于第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位氨基酸残基处。(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)存在于L1的第24-34位氨基酸残基、L2的第50-56位氨基酸残基、L3的第89-97位氨基酸残基、H1的第31-35B位氨基酸残基、H2的第50-65位氨基酸残基和H3的第95-102位氨基酸残基处。(Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(目的免疫蛋白质的序列),第5版.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))。例外是VH中的CDR1，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，它们是接触抗原的残基。SDR含于称作缩写-CDR或a-CDR的CDR区域内部。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于L1的第31-34位氨基酸残基、L2的第50-55位氨基酸残基、L3的第89-96位氨基酸残基、H1的第31-35B位氨基酸残基、H2的第50-58位氨基酸残基和H3的第95-102位氨基酸残基处。(见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另外说明，可变域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人编号。
“人抗体”是一种抗体，所述抗体包含与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或已经使用如本文中公开的用于产生人抗体的任何技术产生。这类技术包括筛选人衍生的组合文库，如噬菌体展示文库(见，例如，Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)andHoogenboom等人,Nucl.AcidsRes.,19:4133-4137(1991))；使用用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系(见，例如，KozborJ.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,第55-93页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))；和在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下能够产生完整人抗体库的转基因动物(例如，小鼠)中产生单克隆抗体(见，例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.SciUSA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255(1993)；Bruggermann等人,YearinImmunol.,7:33(1993))。这种人抗体定义特别排除包含来自非人动物的抗原结合残基的人源化抗体。
“亲和力成熟的”抗体是在一个或多个CDR中存在一个或多个改变的一种抗体，其中与没有这些改变的亲本抗体相比，所述改变导致抗体对抗原的亲和力改善。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。Marks等人,Bio/Technology10:779-783(1992)描述了借助VH和VL结构域改组的亲和力成熟。HVR和/或框架残基的随机诱变由Barbas等人ProcNat.Acad.Sci.USA91:3809-3813(1994)；Schier等人Gene169:147-155(1995)；Yelton等人J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)描述。
“阻断性抗体”或“拮抗性抗体”是抑制或减少与其结合的抗原的生物活性的一种抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体部分地或彻底地抑制抗原的生物活性。
抗体的“类别”涉及其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用，“抗-IL13抗体”也称作来金珠单抗，意指结合人IL13的人源化IgG4抗体。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含三个重链CDR：CDR-H1(SEQIDNO.:1)、CDR-H2(SEQIDNO.:2)和CDR-H3(SEQIDNO.:3)。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含三个轻链CDR：CDR-L1(SEQIDNO.:4)、CDR-L2(SEQIDNO.:5)和CDR-L3(SEQIDNO.:6)。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR：CDR-H1(SEQIDNO.:1)、CDR-H2(SEQIDNO.:2)、CDR-H3(SEQIDNO.:3)、CDR-L1(SEQIDNO.:4)、CDR-L2(SEQIDNO.:5)和CDR-L3(SEQIDNO.:6)。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含可变重链区域VH，其具有选自SEQIDNOS.7和8的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含可变轻链区域VL，其具有SEQIDNO.:9的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含可变重链区域VH，其选自SEQIDNOS.7和8的氨基酸序列，和可变轻链区域VL，其具有SEQIDNO.:9的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:10或SEQIDNO.:11或SEQIDNO.:12或SEQIDNO.:13的氨基酸序列的重链。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:14的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含了具有选自SEQIDNO.:10、SEQIDNO.:11、SEQIDNO.:12和SEQIDNO.:13的氨基酸序列重链和具有SEQIDNO.:14的氨基酸序列的轻链。还在国际公开号2005/062967中描述抗-IL13抗体。
“分离”的生物分子，如核酸、多肽或抗体，是已经鉴定和从其天然环境的至少一种组分中分离和/或回收的一种分子。
本文中对“约”某个值或参数的谈及包括(并且描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，提到“约X”的描述包括对“X”的描述。
“皮下施用装置”指适应于或设计成通过皮下途径施用药物(例如治疗性抗体或药物制剂)的装置。示例性皮下施用装置包括但不限于注射器、包括预填充注射器、注射装置、输注泵、注射笔、无针头装置和贴剂递送系统。皮下施用装置施用某些体积的药物制剂，例如约1.0mL、约1.25mL、约1.5mL、约1.75mL或约2.0mL。
“包装物插页”或“标签”用来指治疗产品或药物的商业包装中习惯性包含的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、与包装产品组合的其他治疗性产品和/或涉及此类治疗产品或药物用途之警告等的信息。
“试剂盒”是任何制品(例如，包装物或容器)，其包含至少一种试剂，例如，用于治疗哮喘或其他肺病症的药物。在某些实施方案中，该制品作为一个用于执行本发明方法的单元推销、分销或出售。
“目标受众”是一组人或机构，其中向它们推销或意在推销特定药物，如通过销售或广告，特别用于特定用途、治疗或适应症，如个人患者、患者群体、报纸、医学文献和杂志读者、电视或互联网浏览者、广播或互联网听众、医师、药物公司等。
术语“血清样品”指从个体获得的任何血清样品。用于从哺乳动物获得血清的方法是本领域熟知的。
术语“全血”指从个体获得的任何全血样品。一般，全血含有全部血液组分，例如，细胞组分和血浆。用于从哺乳动物获得全血的方法是本领域熟知的。
与针对患有某种疾病或病症的患者的临床益处增加相关或预示针对特定治疗药或治疗方案有反应的生物标记的“量”或“水平”是生物样品中的可检测水平。这些可以通过本领域技术人员已知并且还在本文中公开的方法测量。评估的生物标记的表达水平或量可以用来确定针对治疗或治疗药的反应或预测反应。
术语“表达的水平”或“表达水平”通常互换使用并且通常指生物样品中氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”通常指编码基因的信息借以转换成在细胞中存在和运行的结构物的过程。此，如本文所用，基因的“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成蛋白质或甚至蛋白质的翻译后修饰。
哮喘和其他肺病和某些变应性疾病、自身免疫病和其他炎性疾病
将哮喘描述为涉及气道炎症、高反应性和阻塞的慢性肺病。在生理学上，将气道高反应性记录为用乙酰甲胆碱或组胺支气管激发后减少的支气管气流。激发气道阻塞的其他触发物包括冷空气、锻炼、病毒性上呼吸道感染、吸烟和呼吸道变应原。因变应原所致的支气管激发在许多患者中诱导免疫球蛋白E(IgE)介导的早期支气管气流迅速下降，接着是IgE介导的晚期反应，伴随支气管气流下降4-8小时。早期反应由炎性物质(如组胺、白三烯、类胰蛋白酶和血小板激活因子(PAF))的急性释放引起，而晚期反应由从头合成的促炎细胞因子(例如TNFα、IL4、IL13)和趋化因子(例如MCP-1和MIP-1α)引起(Busse等人,引自：Allergy:PrinciplesandPractice,Middleston编著,1173(1998))。在慢性哮喘患者中，持续性肺症状由提高的Th2细胞反应介导。据信Th2细胞因子在疾病中发挥重要作用(Larche等人,J.AllergyClin.Immunol.,111:450(2003))，尤其，气道中具有NK表型的Th2细胞(NKT)产生的IL13和IL4，如以啮齿类中的哮喘模型所示(Akbari等人,NatureMed.,9:582(2003))。哮喘性气道的大体病变显示肺过度充气、平滑肌肥大、网状基底层增厚、粘膜水肿、上皮细胞脱落、纤毛细胞破坏和粘液腺过度分泌。微观上，哮喘以存在支气管组织中嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞的数目、支气管分泌物和粘液增加为特征。最初，存在通过激活的CD4+T-淋巴细胞将白细胞从血流召集至气道。活化的T-淋巴细胞还指导炎性介质从嗜酸性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞释放。此外，Th2细胞产生IL4、IL5、IL9和IL13。IL4，连同IL13一起，发送从IgM抗体转换成IgE抗体的信号。
膜结合型IgE分子由变应原交联造成肥大细胞脱颗粒，释放持久化气道炎症的组胺、白三烯和其他介质。IL5激活嗜酸性粒细胞的召集和活化。活化的肥大细胞和嗜酸性粒细胞还产生其有助于持久化炎症的细胞因子。肺中这些重复的炎症循环伴随肺组织损伤，随后修复，可能产生气道的长期结构变化(“重建”)。
中度哮喘是目前用每日吸入型抗炎皮质类固醇或肥大细胞抑制剂如色甘酸钠或奈多罗米治疗，根据需要外加吸入型β2-激动剂(每日3-4次)以减轻突现症状(breakthroughsymptom)或变应原诱导或运动诱导的哮喘。色甘酸钠和奈多罗米阻断支气管痉挛和炎症，但是通常仅对与变应原或锻炼相关的哮喘有效并且一般仅对青少年哮喘有效。吸入型皮质类固醇改善炎症、气道高反应性和阻塞，并且减少急性恶化的次数。然而，它在效果明显之前耗时至少一个月并且对于出现明显改善耗时直至一年。最频繁的副作用是嘶哑及口部真菌性感染，即，念珠菌病。已经报道了更严重的副作用，例如，局部肾上腺抑制、生长抑制和减少的骨形成，但是仅在使用更高剂量下如此。倍氯米松，曲安西龙和氟尼缩松可能具有相似的效力；而布地奈德和氟替卡松更强力并且据报道称具有更少的全身性副作用。
甚至病情轻度的患者显示气道炎症，包括活化的T细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞浸润粘膜和上皮。T细胞和肥大细胞释放促进嗜酸性粒细胞生长和成熟和IgE抗体产生的细胞因子，并且这些细胞因子转而增加微血管通透性、破坏上皮并刺激神经反射和粘液分泌腺。结果是气道高反应性，支气管收缩和过度分泌，表现为哮鸣、咳嗽、和呼吸困难。
传统上，哮喘已经用口服和吸入型支气管扩张剂治疗。这些药剂帮助缓解哮喘症状，但是对作为基础的炎症无所作为。在过去十年期间认识到炎症在哮喘病因学中的重要性已经导致皮质类固醇的使用增加，但是许多患者继续患有无法控制的哮喘。
除哮喘之外还，可以由本发明制剂治疗的其他疾病包括过敏、自身免疫性疾病或其他炎性疾病。其他过敏性疾病包括过敏性鼻炎、异位性皮炎、食物超敏反应和荨麻疹；免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎；自身免疫性疾病包括银屑病、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎；炎性肠病(即，溃疡性结肠炎、Crohn病)；与IL13相关的其他疾病包括特发性间质性肺炎、杯状细胞化生、炎性和纤维化肺病如囊性纤维化、谷蛋白敏感性肠病、和Whipple病；肺的免疫疾病，如嗜酸粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎；慢性阻塞性肺病、RSV感染、葡萄膜炎(uvelitis)、硬皮病、骨质疏松症和霍奇金淋巴瘤。
特发性肺纤维化(IPF)是用本发明制剂治疗可对付的病症。IPF是以肺实质进行性间质纤维化为特征的限制性肺病，侵袭美国大约100,000名患者(Raghu等人,AmJRespirCritCareMed174:810-816(2006))。这种与IPF相关的间质纤维化导致肺功能进行性丧失，因大部分患者中呼吸衰竭而造成死亡。距诊断时间的中位数存活期是2-3年(Raghu等人,AmJRespirCritCareMed183:788-824(2011))。IPF的病因学和关键分子及病理生理驱动力是未知的。经证明在IPF患者中延长存活的唯一治疗是肺移植(Thabut等人,Annalsofinternalmedicine151:767-774(2009))。然而，肺移植与巨大的发病率相关，并非全部IPF患者均是该疗法的适宜候选人，并且相对缺乏合适的供体肺。尽管进行众多尝试，然而迄今已经显示没有药物疗法在随机分组、安慰剂对照的介入治疗试验中大幅度延长IPF患者中的存活期，不过一些介入治疗似乎已经减慢一些患者中肺功能下降的速率(Raghu等人,AmJRespirCritCareMed183:788-824(2011)；Richeldi等人,TheNewEnglandJ.ofMed.365:1079-1087(2011))。
虽然全部IPF患者的预后是不利的，但是在病程(diseasetrajectory)方面存在巨大的不一致性(Raghu等人,AmJRespirCritCareMed183:788-824(2011))。一些患者显示出相对惰性的过程，以相对恒定的速率在长达10年或更长时间范围内丧失肺功能，而其他患者遭遇肺功能更快速地下降，在诊断一年或两年内趋近死亡。此外，一些患者遭受病情急性恶化，一般以肺功能骤然急剧下降为特征。总体上，这些患者在急性事件后并未充分恢复并且经常在恶化期间或其后不久死亡。病程的这种不一致性表明不同IPF患者可能具有作为其病情基础的不同病理生理因素，所述因素可能差异性地敏感于分子靶向疗法，如本发明的制剂。
嗜酸粒细胞性炎症与多种变应性和非变应性疾病相关(Gonlugur(2006)Immunol.Invest.35(1):29-45)。炎症是活组织对损伤的恢复性反应。炎症反应的一个特征是白细胞因组织自身中产生的某些化学物而积累于受损组织中。嗜酸性白细胞在广泛类型的病症如过敏性疾病、蠕虫感染和肿瘤疾病中积累(Kudlacz等人,(2002)Inflammation26:111-119)。嗜酸性粒白细胞(免疫系统的一种组分)是粘膜表面的防御性元素。它们不仅对抗原反应，还对寄生虫、化学品和创伤反应。
组织嗜酸性粒细胞出现在在皮肤疾病如湿疹、天疱疮、急性荨麻疹和中毒性表皮坏死松解症中以及在异位性皮炎中([Rzany等人,1996]])。嗜酸性粒细胞积累在组织中并且在IgE介导的变应性皮肤反应中倒空颗粒状蛋白质([Nielsen等人,2001])。与肥大细胞结合的嗜酸性粒细胞是关节炎症的可能病因(Miossec等人,1997)。嗜酸粒细胞性炎症有时伴随关节创伤。滑液嗜酸粒细胞增多症可能与多种疾病相关，如类风湿性关节炎、寄生虫病、高嗜酸性粒细胞综合征、莱姆病和变应性过程以及关节积血和关节造影术(arthrography)([Atanes等人,1996])。嗜酸粒细胞性炎症也可以影响骨([Yetiser等人,2002])。嗜酸粒细胞性肌肉疾病的例子包括嗜酸粒细胞性肌周炎、嗜酸粒细胞性多发性肌炎和局灶性嗜酸粒细胞性肌炎([Lakhanpal等人,1988])。侵袭骨骼肌的嗜酸性粒细胞炎性症可能与寄生虫感染或药物或嗜酸粒细胞增多症(例如，特发性高嗜酸性粒细胞综合征和嗜酸性粒细胞-肌痛综合征)的一些全身性病症的特征相关。嗜酸性粒细胞参与针对自身免疫抗体识别的表位的炎症反应([Engineer等人,2001])。结缔组织病可以导致嗜中粒细胞性、嗜酸粒细胞性或淋巴细胞性血管炎症([Chen等人,1996])。组织和外周血嗜酸粒细胞增多症可以在活动性风湿性疾病中出现。强直性脊柱炎(一个种类的结缔组织病)中的血清ECP水平升高表明嗜酸性粒细胞还参与作为基础的过程(Feltelius等人,1987)。韦格纳肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)可能罕见地随肺结节、胸腔积液和外周血嗜酸粒细胞增多一起出现([Krupsky等人,1993])。
至少400/mm3的外周血嗜酸粒细胞增多可以在7％的全身性硬化症病例、31％的局限化硬皮病病例和61％的嗜酸粒细胞性筋膜炎病例中出现([Falanga和Medsger,1987])。硬皮病产生与麦氏神经丛和奥氏神经丛极其相似的炎症过程并且由胃肠系统中的肥大细胞和嗜酸性白细胞组成。嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素可以促进胃肠道运动功能障碍，如在硬皮病中出现那样([deSchryverKecskemeti和Clouse,1989])。
嗜酸性粒细胞可以伴随局限化([Varga和Kahari,1997])或全身性([Bouros等人,2002])结缔组织增殖。它们可以通过抑制成纤维细胞中的蛋白聚糖降解激起纤维化([Hernnas等人,1992])，并且成纤维细胞通过分泌GM-CSF介导嗜酸性粒细胞存活([Vancheri等人,1989])。嗜酸性粒细胞可以存在于鼻组织([Bacherct等人,2001])、支气管组织([Arguelles和Blanco,1983])，和胃肠道息肉组织中([Assarian和Sundareson,1985])。同样地，嗜酸性粒细胞可以局限于炎性假肿瘤(肌成纤维细胞性肿瘤)。嗜酸性粒细胞经常伴随眼眶区域内的炎性假肿瘤，在所述病例中该病状可以模拟血管性水肿或变应性鼻结膜炎([Li等人,1992])。
嗜酸粒细胞性炎症可以存在于组织创伤中(例如，因手术或损伤所致)。嗜酸粒细胞性炎症也可以与心血管疾病(例如，嗜酸粒细胞性心肌炎、嗜酸粒细胞性冠状动脉炎、局部缺血性心脏病、急性心肌梗死、心脏破裂)相关。坏死性炎症过程也可以涉及嗜酸粒细胞性炎症(多发性肌炎、冠状动脉剥离(coronaryarterydissection)，神经-Behcet病的坏死性病灶、痴呆、脑梗死)。
某些治疗药
本文提供用于治疗哮喘和其他肺病的治疗药。在一个实施方案中，治疗药是一种抗-IL13抗体，也称作来金珠单抗。来金珠单抗是IgG4抗体。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含三个重链CDR：CDR-H1(SEQIDNO.:1)、CDR-H2(SEQIDNO.:2)和CDR-H3(SEQIDNO.:3)。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含三个轻链CDR：CDR-L1(SEQIDNO.:4)、CDR-L2(SEQIDNO.:5)和CDR-L3(SEQIDNO.:6)。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR：CDR-H1(SEQIDNO.:1)、CDR-H2(SEQIDNO.:2)、CDR-H3(SEQIDNO.:3)、CDR-L1(SEQIDNO.:4)、CDR-L2(SEQIDNO.:5)和CDR-L3(SEQIDNO.:6)。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含可变重链区域VH，其具有选自SEQIDNOS.7和8的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含可变轻链区域VL，其具有SEQIDNO.:9的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含可变重链区域VH，其选自SEQIDNOS.7和8的氨基酸序列，和可变轻链区域VL，其具有SEQIDNO.:9的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:10或SEQIDNO.:11或SEQIDNO.:12或SEQIDNO.:13的氨基酸序列的重链。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含具有SEQIDNO.:14的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，抗IL13抗体包含了具有选自SEQIDNO.:10、SEQIDNO.:11、SEQIDNO.:12和SEQIDNO.:13的氨基酸序列重链和具有SEQIDNO.:14的氨基酸序列的轻链。还在国际公开号2005/062967中描述抗-IL13抗体。
在另一个方面，抗IL-13抗体包含与SEQIDNO.:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗IL-13抗体保留与人IL-13结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQIDNO.:8中置换、改变、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在CDR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗IL13抗体包含在SEQIDNO.:8中的VH序列，包含该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供抗IL-13抗体，其中该抗体包含与SEQIDNO.:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗IL-13抗体保留与IL-13结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQIDNO.:9中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在CDR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗IL-13抗体包含在SEQIDNO.:9中的VL序列，包含该序列的翻译后修饰。
在又一个实施方案中，抗IL-13抗体包含与SEQIDNO.:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL区和与SEQIDNO.:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH区。
某些分子生物标记
在某些情况下，在从患者获得的生物样品中定量生物标记，例如，血清生物标记，作为选择患者以便采用给定治疗药治疗的手段。美国申请号61/459760，61/465425，61/484650，和61/574485(“DiagnosisandTreatmentsRelatedtoTH2Inhibition(与TH2抑制相关的诊断和治疗)”)描述一种骨膜蛋白测定法和选择患者以便用文中所述的抗-IL13抗体制剂治疗的方法。
制剂的一般技术
可以使用本领域已知和如本文进一步描述的某些赋形剂和技术制备并分析包含抗-IL13抗体的制剂。在某些实施方案中，待配制的抗体未曾经受事先冻干并且本文的目的制剂是含水制剂。在某些实施方案中，抗体是全长抗体。在一个实施方案中，制剂中的抗体是抗体片段，如F(ab')2，在这种情况下可能需要解决对全长抗体而而言可能不存在的问题(如将抗体修剪成Fab)。通过例如考虑所需的剂量体积和施用模式确定制剂中存在的抗体的治疗有效量。约0.1mg/mL至约250mg/mL，或约10mg/mL至约200mg/mL或约50mg/mL至约175mg/mL是制剂中的示例性抗体浓度。在一个实施方案中，抗-IL13抗体以125mg/mL的浓度配制。在一个实施方案中，抗-IL13抗体以150mg/mL的浓度配制。
制备一种含水制剂，其包含在pH缓冲的溶液中的抗体。在某些实施方案中，该缓冲液具有约4.5至约6.5范围内的pH。在某些实施方案中，该pH处于pH5.0至6.0范围内，或处于pH5.25至5.75范围内，或处于pH5.3至5.6范围内。在本发明的某些实施方案中，该制剂具有5.6或约5.6的pH。在本发明的某些实施方案中，该制剂具有5.7或约5.7的pH。在本发明的某些实施方案中，该制剂具有5.8或约5.8的pH。将pH控制在这个范围内部的缓冲液的例子包括乙酸盐(例如乙酸组氨酸、乙酸精氨酸、乙酸钠)、琥珀酸盐(如琥珀酸组氨酸、琥珀酸精氨酸、琥珀酸钠)、葡糖酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲液及它们的组合。缓冲液浓度可以是约1mM至约600mM，例如取决于缓冲液和所需的制剂等渗性。在某些实施方案中，缓冲液含有浓度约5mM至40mM的组氨酸。在一个实施方案中，缓冲液是20mM乙酸组氨酸，pH5.7。在某些实施方案中，缓冲液是20mM琥珀酸组氨酸，pH5.7。
表面活性剂可以任选地添加至抗体制剂。示例性表面活性剂包括非离子表面活性剂如聚山梨酯(例如聚山梨酯20，80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。添加的表面活性剂的量是这样的从而它减少所配制的抗体聚集和/或使制剂中颗粒物的形成最小化和/或减少吸附。例如，表面活性剂可以在制剂中以约0.001％至约0.5％或约0.005％至约0.2％或约0.01％至约0.1％的量存在。在一个实施方案中，表面活性剂是在制剂中以0.03％的量存在的聚山梨酯20。
在一个实施方案中，该制剂含有以上确定的药剂(例如，抗体、缓冲液和表面活性剂)并且基本上不含一种或多种防腐剂，如苄醇、苯酚、间甲酚、三氯叔丁醇和苄索氯铵。在一个实施方案中，该制剂不包含防腐剂。在另一个实施方案中，防腐剂可以包含于制剂中，特别在制剂是多剂量制剂的情况下。防腐剂的浓度可以处于约0.1％至约2％或约0.5％至约1％的范围内。可以在制剂中包含一种或多种其他可药用载体、赋形剂或稳定剂，如Remington'sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编著(1980)中描述的那些，只要它们并未不利地影响所需的制剂特征。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度对接受者无毒并且包含额外的缓冲液；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂如EDTA；金属络合物(例如Zn-蛋白质复合物)；生物可降解聚合物如聚酯；和/或成盐平衡离子。
尽管对本文中螯合剂的多种描述经常集中于EDTA，但是将可以理解本发明范围内也涵盖其他金属离子螯合剂。金属离子螯合剂是本领域技术人员熟知的并且包括、但不必然地限于氨基多元羧酸盐类、EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸)、NTA(氨三乙酸)、EDDS(乙二胺二琥珀酸盐)、PDTA(1,3-丙二胺四乙酸)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、ADA(β-丙氨酸二乙酸)、MGCA(甲基甘氨酸二乙酸)等。额外地，本文中的一些实施方案包含膦酸盐类/膦酸螯合剂。在某些实施方案中，该制剂含有甲硫氨酸。
存在张度剂(有时称作“稳定剂”)以调节或维持液体组合物的张度。当随大的、带电荷的生物分子如蛋白质和抗体使用时，经常将它们称作“稳定剂”，因为它们可以与氨基酸侧链的带电荷基团相互作用，因而减轻分子间或分子内相互作用的可能。考虑其他成分的相对量，张度剂可以按重量计以0.1％至25％或1％至5％之间的任何量存在。张度剂包括多元糖醇、thrihydric或高级糖醇，如丙三醇、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。
额外的稳定剂包括类型广泛的赋形剂，所述赋形剂在功能上范围包括填充剂至溶解度增进剂，至防止变性或贴附于容器壁的物质。稳定剂可以按0.1至10,000份/重量活性蛋白质或抗体的范围存在。常见的稳定剂包括：多元糖醇(上文列举)；氨基酸类如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖类或糖醇类如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、丙三醇、环多醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖类(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖类(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖类如棉子糖；和多糖如糊精或葡聚糖。
存在非离子型表面活性剂或去垢剂(也称作“湿润剂”)以帮助溶解治疗药，以及保护治疗性蛋白质免受搅拌诱导的聚集，它们还在不造成活性的治疗性蛋白或抗体变性的情况下允许制剂暴露于剪切表面应力。非离子型表面活性剂以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选地约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、多元醇、、聚氧乙烯山梨糖醇酐单醚(-20、-80等)、聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧40酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可以使用的阴离子去垢剂包括十二烷基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子去垢剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术是本领域可获得并且例如在PeptideandProteinDrugDelivery,247-301,VincentLee编著,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.DrugDeliveryRev.10:29-90(1993)中综述。可以在选择的温度所选择的持续时间段测量稳定性。在某些实施方案中，制剂在约40℃稳定至少约2-4周，和/或在约5℃稳定至少3个月，和/或在约5℃稳定至少6个月，和/或在约5℃稳定至少12个月和/或在约-20℃稳定至少3个月或至少1年。在某些实施方案中，制剂在约25℃稳定至少6个月和/或在约25℃稳定12个月，和/或在约5℃稳定6个月，和/或在约5℃稳定12个月，和/或在约-20℃稳定至少6个月，和/或在约-20℃稳定至少12个月，和/或在5℃或-20℃稳定至少2年。在某些实施方案中，制剂在制剂冷冻(冷冻至例如-70℃)和解冻后，例如在1、2或3个冷冻和解冻循环后是稳定的。稳定性可以定性和/或定量地以多种不同方式评价，所述方式包含评价聚集物形成(例如使用大小排阻层析、通过测量浊度和/或通过视检)；通过使用阳离子交换层析、成像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评估电荷不均一性；氨基端或羧基端序列分析；质谱分析；比较还原型和完整抗体的SDS-PAGE分析；肽图法(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评价抗体的生物活性或抗原结合功能等。不稳定性可以涉及以下任一种或多种情况：聚集、脱酰胺化(例如Asn脱酰胺化)、氧化(例如Met氧化)、异构化(例如Asp异构化)、修剪/水解/片段化(例如，铰链区片段化)、琥珀酰亚胺形成、非配对的半胱氨酸、N端延长、C端加工、糖基化差异等。
待用于体内施用的制剂应当是无菌的。这通过在制备制剂之前或之后经无菌滤膜过滤轻易地完成。
治疗药可以根据已知的方法施用，如作为推注剂的静脉内施用或通过在一段时间范围内连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。任选地，施用可以使用各种市售装置通过微型泵输注进行。
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种活性化合物，优选地是具有互补活性，且并未不利相互影响的那些活性化合物。可选地或额外地，组合物可以包含细胞毒药物、细胞因子或生长抑制剂。此类分子适当地以有效用于预期目的的量存在。
有效成分也可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合法制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)(poly-(methylmethacylate)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或乳浊液中。这类技术在上文Remington'sPharmaceuticalSciences第18版中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗体的固态疏水性聚合物半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如薄膜或微胶囊)形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇)、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-谷氨酸酯的共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。已经成功地用人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白介素-2和MNrpg120进行重组蛋白的微包囊化用于持续释放。Johnson等人,Nat.Med.2:795-799(1996)；Yasuda等人,Biomed.Ther.27:1221-1223(1993)；Hora等人,Bio/Technology8:755-758(1990)，“DesignandProductionofSingleImmunizationVaccinesUsingPolylactidePolyglycolideMicrosphereSystems”，引自VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach,Powell和Newman编著(PlenumPress:NewYork,1995)，第439-462页；WO97/03692；WO96/40072；WO96/07399；和美国专利号5,654,010。
这些蛋白质的持续释放制剂可以使用聚乳酸-共乙醇酸(PLGA)聚合物开发，原因在于其生物相容性和广泛类型的生物可降解特性。可以在人体内部迅速清除PLGA降解产物，乳酸和乙醇酸。另外，取决于其分子量和组成，这种聚合物的可降解性可以从数月调整至数年。Lewis,“Controlledreleaseofbioactiveagentsfromlactide/glycolidepolymer”,引自BiodegradablePolymersasDrugDeliverySystems(MarcelDekker；NewYork,1990),M.Chasin和R.Langer(编著)第1-41页。
尽管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白质持续较短的时间。当包囊化的抗体长时间留在体内时，它们可能因在暴露于37℃潮湿环境而变性或聚集，导致生物活性丧失和可能的免疫原性改变。可以根据所涉及的机制构思用于稳定的合理策略。例如，如果发现聚集机制是因巯基-二硫化物互换所致的分子间S-S键形成，可以通过修饰硫氢基残基、从酸性溶液冻干、控制含湿量、使用适宜的添加物和开发特定聚合物母体组合物实现稳定作用。
脂质体组合物或类蛋白组合物也可以用来配制本文中公开的蛋白质或抗体。见美国专利号4,925,673和5,013,556。
可以通过使用无毒“水溶性多价金属盐”增强本文所述的蛋白质和抗体的稳定性。例子包括Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Sn2+、Sn4+、Al2+和Al3+。可以与以上多价金属阳离子形成水溶性盐的阴离子例子包括从无机酸和/或有机酸形成的那些。这类水溶性盐具有在水中(在20℃)至少约20mg/mL、可选地至少约100mg/mL、另外至少约200mg/mL的溶解度。
可以用来形成“水溶性多价金属盐”的合适无机酸包括氢氯酸、乙酸、硫酸、硝酸、硫氰酸和磷酸。可以使用的合适有机酸包括脂族羧酸和芳香酸类。这个定义范围内的脂族酸可以定义为饱和或不饱和C2-9羧酸(例如，脂族一元、二元和三元羧酸)。例如、这个定义范围内的示例性一元羧酸包括饱和C2-9一元羧酸：乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和capryonic酸，和不饱和C2-9一元羧酸：丙烯酸、丙炔酸(propriolicacid)、甲基丙烯酸、巴豆酸和异巴豆酸。示例性二羧酸包括饱和C2-9二羧酸：丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸和庚二酸，而不饱和C2-9二羧酸包括马来酸、延胡索酸、柠康酸和甲基富马酸。示例性三羧酸包括饱和C2-9三羧酸：丙三酸和1,2,3-丁烷三羧酸。另外，这个定义的羧酸也可以含有一个或两个羟基以形成羟基羧酸。示例性羟基羧酸包括乙醇酸、乳酸、甘油酸、丙醇二酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸。这个定义范围内的芳香酸类包括苯甲酸和水杨酸。
可以用来帮助稳定本发明包囊化多肽的常使用的水溶性多价金属盐例如包括：(1)无机酸金属盐：卤化物(例如，氯化锌、氯化钙)、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和硫氰酸盐；(2)脂族羧酸金属盐(例如，乙酸钙、乙酸锌、丙酸钙、羟乙酸锌、乳酸钙、乳酸锌和酒石酸锌)；和(3)芳族羧酸金属盐：苯甲酸盐(例如，苯甲酸锌)和水杨酸盐。
在某些实施方案中，例如使用自注入装置、自动注射器装置或设计用于自我施用的其他装置施用抗-IL13抗体。在某些实施方案中，使用皮下施用装置施用抗-IL13抗体。各种自注入装置和皮下施用装置，包括自动注射器装置，是本领域已知和可商业获得的。示例性装置包括但不限于预充式注射器(如来自BectonDickinson的BDHYPAK、READYFILLTM和STERIFILLSCFTM；来自Baxter的CLEARSHOTTM共聚物预充式注射器；和从WestPharmaceuticalServices可获得的DaikyoSeikoCRYSTAL预充式注射器)；一次性笔式注射装置如来自BectonDickinson的BDPen；超锐利和微针装置(如来自BectonDickinson的INJECT-EASETM和微量输注装置(microinfuser)；和从Valeritas可获得的H-PATCHTM)以及无针注射装置(如从Bioject可获得的和；和从Medtronic可获得的及贴剂装置)。本文中进一步描述皮下施用装置的某些实施方案。构思了用这类自注入装置或皮下施用装置共配制或共施用抗-IL13抗体连同至少第二治疗性化合物。
重组方法
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗-IL13抗体的分离核酸。这种核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供一种或多种包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用其转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VL的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种产生抗-IL13抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体条件下培养如上文提供的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码抗体的核酸，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组产生抗-IL13抗体，将编码抗体的核酸(例如，如上文所述)分离并插入一种或多种载体中用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离这种核酸并测序。
克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，见，例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还见Charlton,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编著,HumanaPress,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，抗体肽可以从可溶性级分中的细菌细胞糊膏分离并且可以进一步纯化。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体。见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的众多杆状病毒毒株。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如Graham等人,J.GenVirol.36:59(1977)中所述的293或293T细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝脏细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝脏细胞(HepG2)；小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562)；TRI细胞，如在例如Mather等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见，例如，Yazaki和Wu，MethodsinMolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo编著，HumanaPress，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
测定法
可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选本文提供的抗-IL13抗体或表征其物理/化学特性和/或生物活性。
结合测定法和其他测定法
在一个方面，例如，通过已知的方法如ELISA、蛋白质印迹法等，对抗-IL13抗体测试其抗原结合活性。
在另一个方面，竞争测定法可以用来鉴定与抗-IL13抗体竞争结合于IL13的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体与来金珠单抗或本文中所说明的另一种抗-IL13抗体结合相同表位(例如线性表位或构象表位)结合。用于定位与抗体结合的表位的详细示例性方法在Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols(表位定位法)”,引自MethodsinMolecularBiology第66卷(HumanaPress,Totowa,NJ)中提供。
在示例性竞争测定法中，将固定的IL13在溶液中温育，所述溶液包含与IL13结合的第一标记抗体(例如，来金珠单抗)和正在测试与第一抗体竞争结合至IL13的能力的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的IL13在包含第一标记抗体但是不包含第二未标记抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与IL13结合的条件下温育后，移除过多的未结合的抗体，并且测量与固定的IL13结合的标记物的量。如果与固定的IL13结合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质降低，则这表示第二抗体正在与第一抗体竞争结合至IL13。见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual第14章(ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)。
活性测定法
在一个方面，提供了用于鉴定具有生物活性的抗IL-13抗体的测定法。生物活性可以例如包括在哮喘中的活性。还提供在体内和/或在体外具有这类生物活性的抗体。在某些实施方案中，对本发明的抗体测试这种生物活性。
制造品和试剂盒
提供一种制造品，其含有制剂并提供其用法说明书。该制造品包含容器。合适的容器例如包括瓶、小瓶(例如双室小瓶)、注射器(如单室或双室注射器)和试管。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。容器容纳制剂并且在该容器上或与之结合的标签可以指示复水和/或使用的说明。标签还可以表明该制剂可用于或意图用于皮下施用。容纳制剂的容器可以是多用小瓶，其允许重复施用(例如2-6次施用)复水的制剂。制造品还可以包含第二容器，所述第二容器包含合适的稀释剂(例如BWFI)。当混合稀释剂和冻干制剂，复水制剂中最终蛋白质浓度将通常是至少50mg/mL。制造品还可以包括从商业和用户观点看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和含有使用说明的包装物插页。
在某些实施方案中，提供了包含皮下施用装置的制造品，所述皮下施用装置向患者递送近平剂量抗-IL13抗体，其中所述近平剂量例如是，但不限于37.5mg、75mg或125mg或150mg。在某些实施方案中，抗-IL13抗体是来金珠单抗。将皮下施用装置中的抗-IL13抗体配制在缓冲液(例如，组氨酸pH5.7)和其他赋形剂(例如，蔗糖和聚山梨酯)中，从而将它在稳定的药物制剂中提供。在某些实施方案中，皮下施用装置是预充式注射器，所述预充式注射器包含带针头和任选地针护罩以及还任选地带针护罩装置的玻璃针管。在某些实施方案中，注射器中所含的体积是0.5mL、1mL、1.5mL或2.0mL或者约0.5mL、约1mL、约1.5mL或约2.0mL。在某些实施方案中，针头是包含3斜面尖端或5斜面尖端的柱撑(staked-in)针头。在某些实施方案中，针头在25号(G)和30G之间。在某些实施方案中，针头的长度在1/2英寸和5/8英寸之间。在一个实施方案中，皮下施用装置包含预充式1.0mL低硼硅酸钨玻璃(I型)注射器和不锈钢5斜面27G1/2英寸长的薄壁柱撑针头。在某些实施方案中，皮下施用装置包含刚性针护罩。在某些实施方案中，该刚性针护罩包含具有低锌含量的橡胶配方，例如，FM27/0(Daetwyler)并且包含刚性聚丙烯护罩。在某些实施方案中，活塞杆包括橡胶活塞挡止器。在某些实施方案中，橡胶活塞挡止器包含4023/50橡胶和乙烯-四氟乙烯(ETFE)涂层(WestPharmaceuticalServices,Inc.)。在某些实施方案中，皮下施用装置包括针头安全装置。示例性针头安全装置包括但不限于Ultrasafe针套X100L(SafetySyringes,Inc.)和RexamSafenSoundTM(Rexam)。
适于皮下递送的额外装置例如包括，但不限于，注射装置如INJECT-EASETM和GENJECTTM装置；输注泵如ACCU-CHECKTM；注射笔如GENPENTM；无针装置如MEDDCTORTM和BIOJECTORTM；自动注射器和皮下贴剂递送系统。
试剂盒将一般包含上文描述的容器和一个或多个其他容器，所述其他容器包含从商业和用户观点看合乎需要的材料，包括缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和含有使用说明的包装物插页。标签可以在容器上存在以表明该组合物用于特定疗法。
实施例
以下是本发明制剂和方法的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般表述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1
材料和方法
材料和样品制备方法
除了作为人源化IgG4单克隆抗体的抗-IL13之外，在下文描述的实验中使用的全部其他抗体均是人源化IgG1单克隆抗体。单克隆抗体在中国的仓鼠卵巢(CHO)细胞系中表达，并且通过一系列的标准色谱步骤(包括蛋白A和离子交换层析方法)纯化。纯化的抗体作为浓缩溶液从切线流过滤获得，伴以添加的溶液缓冲液和稳定剂。这些是作为起始材料用于下文所述研究的抗体母液。
这些母液mAb起始材料贮存在2-8℃直至进一步使用。mAb溶液的额外制备包括针对低离子强度缓冲液透析并经0.22μm改性PVDF(聚偏氟乙烯)滤器(MilliporeSteriflip,MilliporeCorp.,MA)过滤以移除大颗粒物。一般，透析后获得140-150mg/mL的mAb浓度。为了获得更高的mAb浓度，将10mL的mAb用2700转/分钟离心的AmiconYM30Centriprep(MilliporeCorp，MA)浓缩器浓缩。通过使用计重稀释度和280nm(A280)处的吸光度并且使用具有1cm光程长度的石英比色皿的8453型Agilent二极管阵列分光光度计时280nm(A280)处的UV吸收量值，确定透析和离心浓缩的制备物中的mAb终浓度。通过定量性氨基酸分析确定消光系数。
通过在层流洁净工作台中计重稀释已知的母液浓缩物，在20mL闪烁计数小瓶中在0.5-275mg/mL范围内制备用于光散射实验的单克隆抗体溶液。全部闪烁计数小瓶均用去离子水小心地清洁并且在过滤的压缩氮气流中干燥。在添加至蛋白质溶液之前，全部缓冲液和试剂溶液均经0.10μmWhatmanAnotop25滤器额外地过滤。在制备或稀释样品后，将mAb溶液混合至均一并允许在受控的室温达到热平衡和化学平衡持续2小时。将蛋白质溶液以3000转/分钟在室温离心20-30分钟以在用于光散射之前，从溶液中移除外来粉尘和气泡。将更高浓度的溶液(mAb>170mg/mL)离心更长时间直至光散射信号显示最小噪声。闪烁计数小瓶的外表面用硅油略微涂布以减少来自小瓶表面缺陷的不想要的散射。将如上制备的样品直接置于光散射仪中测量。
通过多角度光散射确定B2
用于光散射的样品制备利用20mL特富龙衬涂的隔膜盖小瓶，所述小瓶用MilliQ水清洁并且在过滤的氮气流下干燥。通过以下方式制备各种浓度的样品：取适宜体积的大约80mg/mL的mAb母液，首先用适宜的缓冲液稀释至大约8mg/mL，并且随后用20mL0.2μm过滤的缓冲液进行最终稀释。在开始测量之前，将每种缓冲条件总计8种蛋白质浓缩物(0.05-1.1mg/mLmAb)在室温平衡14-18小时。将全部测量作为渐增白质浓度的一系列溶液进行，每个实验一式三份进行。将具有25mmMillipore(Millipore，Billerica，MA)溶剂滤器(PVDF，0.1μm)的Agilent溶剂脱气机和等强度泵(Agilent，PaloAlto，CA)以连续流速率0.5ml/分钟使用。上样用GilsonGX281(Gilson,Inc.,MiddletonWI)液体处置装置自动化进行，所述装置配置有2mL注射环和带有0.1μm，10mMPVDF膜的WyattTechnologyDeutschland线内微量滤器。实施一系列浓度和光散射测量，在280nm进行AgilentMWDUV检测器测量，随后用18-角EOSMALS检测器(WyattTechnologyCorporation，SantaBarbara，CA)测量，增益降低至21x。获得数据并用AstraTM4.90.07(WTC)软件处理，通过输出分割(slice)结果实施其他分析。采用数据线性回归拟合情况下K*c/R(θ＝0)/K*c/或1/MWapp对浓度的曲线产生斜率＝2B2和截距1/Mw0(在无限稀释下的重均分子量)。
高浓度多角静态光散射(SLS)
来自WyattTechnology(SantaBarbara，CA)的具30mW固态激光器(λ＝690nm)的18-角DawnEOS光散射检测器用于全部静态光散射测量，同时水冷Peltier温度控制器设定在23℃。将该仪器用99.9％甲苯(色谱级)校准。对于常见的闪烁计数小瓶实验，将检测器增益设定1x以38°至148°的固定角度用于全部光电二极管。由于抗-CD11a的回转半径(Rg)小于10nm，在每种盐浓度使用抗-CD11a的稀溶液(1-2mg/mL)以便在每个实验结束时使用光电二极管检测器增益设定21x，使光电二极管的角度依赖性(angulardependency)相对于90°检测器归一化。随mAb浓度从0.5mg/mL变化至275mg/mL并且随NaCl浓度(0-600mM)变化，实施静态光散射强度的测量实施。在5-10分钟的间距范围内采集每份样品/小瓶的散射数据，数据采集频率为12个点/分钟。使用Astra4.90.07软件(WyattTechnologyCorporation，SantaBarbara，CA)来获得并处理静态光散射数据，dn/dc值0.185适用于可以作为分割结果输出的计算。在MicrosoftExcel、Originv7.5和MATLABR14中实施采用该输出结果的其他分析和计算。对于高浓度光散射数据，经常更容易解读MWapp相对mAb浓度格式的结果，其中分子量的增加对应于存在浓度依赖的可逆性自我缔合。(见，例如，Scherer,T.M.等人,TheJournalofPhysicalChemistryB114(40):12948-12957(2010)；Minton,A.P.,JPharmSci96(12):3466-9(2007)；Minton,A.P.BiophysicalJournal93(4):1321-1328(2007)。
通过UV光谱法获得的浊度
在环境温度通过使用Agilent8453分光光度计测量来自高浓度光散射实验的受测蛋白质溶液和来自pH筛选实验的蛋白质溶液的浊度(各自如下文描述)。将浊度计算为波长350nm处吸光度的平均数，其中波长范围340nm至360nm范围内以5nm为增量的吸光度值的总和除以5。在具有1cm光程长度的小体积石英比色皿中进行蛋白质溶液的测量。还记录690nm处的吸光度。
熔融温度(Tm)的毛细管差示扫描量热法(DSC)表征
通过使用MicroCal毛细管差异性扫描量热器评估蛋白质热构象稳定性。将MAb在缓冲液中稀释至1mg/mL。将500微升蛋白质和其匹配缓冲液装入96孔平板中。随着温度以60℃/hr扫描速率从15℃增加95℃，监测热容。VPViewer2000CapDSC用来获得数据并且MicroCal,LLCDSCDataAnalysis用来分析数据。见Yadav,S.等人,JPharmSci.99(3):1152-68(2010)。
散射比浊法
使用HACH(型号2100ANIS)实验室浊度计以90度散射强度检测进行散射比浊测量。将检测器用福尔马肼标准4000散射比浊浊度单位(NTU)母液校准，相对浊度标准浓度为0-0.5。将样品置于比色皿中和一式两份测量，报告样品的平均NTU。
流变学
使用锥体和平板测量系统，用MCR300流变仪(AntonPaar，Ashland，VA)测量样品的粘度。将样品加载到下部测量板上并允许在25℃达到热平衡。使用溶剂截留器来防止溶剂蒸发。样品经历两个循环的剪切速率扫描(每个循环包括从10秒-1递增至1000秒-1，在1000秒-1保持1分钟，从1000秒-1递降至10秒-1)。在循环之间存在一个1分钟停留时间。报告的值是以1000秒-1对一份样品进行两个剪切速率扫描的平均数。误差线代表两轮次的标准偏差，单位是milliPascal-秒(mPas)。样品总计以1000秒-1处于剪应力下2分钟。我们选择1000秒-1，原因是该粘度相对与这个范围内的剪切速率无关(200秒-1<剪切速率<2000秒-1)。一份样品的两个等分试样之间的粘度差异在1000秒-1处于±0.5mPa范围内。使用US200软件(AntonPaar，Ashland，VA)优化在每个剪切速率测量的持续时间。
浊点温度(cloudtemperature)确定
对于经历液-液相分离(LLPS)的体系，降低温度导致一个液相的液滴在另一个相中形成。形成这些液滴的温度称作浊点温度，并且可以通过显微术或通过监测溶液透射率实验地测定。对于本文所述的实验，通过在Aviv14DS分光光度计(AvivBiomedical,Lakewood,NJ)监测600nm处透射率随温度变化而丧失，测定浊点温度。将5mm方形比色皿用大约0.6mL抗体溶液填充。使用热电冷却器，将温度以0.5℃进阶从25℃降低至0℃。在记录透射之前，样品在每个温度平衡10分钟。浊点温度命名为％透射率降至50％初始值的温度(Asherie，2004)。通过使用AvivBiomedical14S型UV-Vis分光光度计测量在不同蛋白质浓度和在不同研究溶液中抗-IL13相分离的Tc。采用从25℃至0℃步长-0.5℃的温度扫描、平衡时间600秒和波长600nm，采集透射比百分比对温度数据。在具有1cm光程长度的石英比色皿中进行蛋白质溶液的测量。
大小排阻层析
大小排阻层析用来定量聚集物和片段。这种测定法利用TSKG3000SWXLTM，7.8X300mm柱并且在25℃在HP1100TMHPLC系统上运行。将样品用流动相稀释至2mg/mL并且进样量是25μL。流动相是0.2MK2HPO4，0.25MKCl，pH6.2，并且蛋白质以稳定流率0.5ml/分钟洗脱30分钟。在280nm监测洗脱剂吸光度。使用HPCHEMSTATIONMTM软件进行整合。
成像毛细管等电聚焦(icIEF)
使用icIEF分析样品以对抗-IL13抗体稳定性样品的电荷(酸性和碱性)变种定量。这种方法使用带PrinCE微量注射器的iCE280分析仪(ConvergentBioscience)中氟烃涂布的毛细管(ConvergentBioscience)。阳极电解质和阴极电解质的溶液从GEHealthcareBiosciences购买；pI标记的溶液从ConvergentBioscience购买。
毛细管电泳法-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)
使用能够从20至40+2℃控制毛细管温度的BeckmanP/ACEMDQ或PA800毛细管电泳法系统实施CE-SDS，所述系统带有在488nm处激发的LIF检测器。
抗-IL13抗体效力测定法
使用细胞培养测定法评估抗-IL13抗体溶液的生物活性或效力，所述测定法测量抗-IL13抗体溶液在人支气管上皮细胞系L-Beas-2B细胞(从ATCC可获得，ATCC目录号CRL-9609TM)中抑制IL-13诱导的萤光素酶表达的能力。将不同浓度的抗-IL13抗体标准物、对照和样品与固定浓度的IL-13(例如，rhu-IL13，Peprotech，目录号200-13)混合并添加至96孔板，所述96孔板以2x105个细胞/ml的浓度接种L-Beas-2B细胞。在温育后，使用发光萤光素酶底物，根据制造商的说明书(Bright-GloTM萤光素酶测定法系统，Promega目录号E2620,E2650或Brite-LitePlus,PerkinElmer目录号6016761)对萤光素酶的表达定量。产生每种抗体溶液的稀释曲线并且与参比物质比较。结果以相对发光单位(RLU)表述。使用最小二乘法和平行线分析程序计算相对效力估计值。通过相对效力估计值乘以参比物质的比活性计算％比活性。
抗-IL13抗体(来金珠单抗)氨基酸序列
下表显示来金珠单抗CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3区的氨基酸序列，连同VH、VL、重链序列和轻链序列。如下表1中所示，VH和重链可以包括N端谷氨酰胺并且重链也可以包括C端赖氨酸。如本领域熟知，N端谷氨酰胺残基可以形成焦谷氨酸并且可以在生产过程期间修剪C端赖氨酸残基。
表1.抗-IL13抗体(来金珠单抗)氨基酸序列
结果
抗-IL13抗体制剂在多种pH时的物理及化学稳定性
使用20mM乙酸组氨酸或20mM磷酸钠，产生具有不同pH的缓冲液，以覆盖pH5.4-7.8的范围。乙酸组氨酸缓冲液覆盖pH范围5.4-6.0并且磷酸钠缓冲液覆盖pH范围6.6-7.8。对于每个缓冲液pH，维持以下恒定：150mg/mL的抗-IL13抗体浓度，175mM蔗糖和0.3mg/mL(0.03％)聚山梨酯20。
将抗体溶液在小瓶中在下表2中所示的温度并持续下表2中所示的时间段储存。在表2中“X”所指示的各种时间，通过评估物理稳定性的各种方法(包括SEC、A350浊度和非还原性CE-SDS)和化学稳定性的各种方法(包括icIEF)分析样品。
表2.稳定性时间点和用来测定抗-IL13抗体溶液的物理及化学稳定性的条件。
图1显示缓冲液中在所示pH每周单体丧失百分比，如通过SEC所测定。如图1中所示，％单体丧失在较低pH范围内比较高pH范围内低，最低％单体丧失在pH5.7处，其显示0.056的％单体丧失/周。
另一种物理稳定性测定法测量浊度(如通过A350所测定)随时间推移在30℃随pH变化的变化。如图2中所示，与更高的pH范围相比，pH5.4-6.0之间的缓冲液的初始浑浊和变化较高。在图2中，净浊度是A350＝1/T，其中T是在指定光程长度为1cm情况下350nm处的透射光强度。
第三种物理稳定性测定法测量在30℃储存六周期间抗-IL13抗体溶液中低分子量(LMW)可溶性片段和高分子量(HMW)聚集物随pH变化而增加。如图3中所示，片段化率和聚集率在较低pH范围pH5.4-6.6内最低。
使用icIEF，我们还评估了化学稳定性以确定酸性和碱性变种形成率随时间推移在30℃随pH变化的改变(图4)以及碱性变种和主要峰丧失比率随时间推移在30℃随pH变化的改变(图5)。如图4中所示，酸性变种的比率在低pH范围内最低并且在高pH范围内最高，而碱性变种(BV1峰)的比率在高pH范围内最低并且在低pH范围内最高。图5中所显示的结果表明主要峰丧失在pH5.4-6.0之间最小化。
为了确定pH是否影响溶液粘度，我们在不同pH(范围从pH5.5-7.2)进行不同抗-IL13抗体浓缩物(范围从0至200mg/mL抗体)的流变学表征。每种溶液具有175mM蔗糖和0.3mg/mL聚山梨酯20。图6中显示结果。那些结果表明维持了一致的粘度分布，无论给定抗体浓度的溶液pH是多少。具体而言，结果显示在较高抗体浓度时的粘度不受pH影响。
综上，图1-6中提出的数据显示在pH5.4-6.0，对于大部分物理变化和化学变化存在浅梯度(shallowgradient)。因此选择pH5.7的20mM乙酸组氨酸缓冲液用于后续研究和制剂评估。
高浓度单克隆抗体溶液的流变学表征
为了探索以150mg/mL在20mM乙酸组氨酸pH5.7，175mM蔗糖，0.3mg/mL聚山梨酯20中配制的抗-IL13抗体所观察到的粘度(在25℃<15cP)是否将总体上对各种不同的抗体观察到，我们检验了150mg/mL的三种额外抗体在相似制剂中的粘度。如对抗-IL13抗体观察到的这种粘度分布对于以高抗体浓度制造和对于某种药物施用途径(例如，皮下注射)是合乎需要的。如图7中所示，抗-IL13抗体维持与抗-CD11a抗体相似的粘度分布，即25℃粘度<15cP的。相比之下，抗-CD20抗体和mAb-1抗体显示相当不同的粘度分布。抗-CD20抗体在150mg/mL时的粘度是在25℃>15cP，而mAb-1不能以150mg/mL在这种缓冲液中配制，原因在于如可以在图7中见到的伴随粘度的明显问题。图7显示mAb-1在125mg/mL时的粘度是在25℃>45cP。因此，从该数据清晰可见，当以150mg/mL在20mM乙酸组氨酸pH5.7，175mM蔗糖，0.3mg/mL聚山梨酯20中配制时，不同抗体具有不同的流变学特征。
目视外观和乳光的表征
使用90度散射比浊法和A350浊度量值，与抗-CD20抗体制剂相比，我们表征了抗-IL13抗体制剂的目视外观和乳光。图8以散射比浊浊度单位(NTU)显示两种不同抗体制剂的目视外观的量化。在图8中，R1、R2、R3和R4指参比标准物，R4具有最高程度的目视乳光并且R1最低程度的目视乳光。图9中显示抗-IL13和抗-CD20抗体的A350浊度量值。如图9中所示，对于每种抗体制剂，浊度随渐增的蛋白质浓度增加。这些图中所显示的结果表明两种抗体的两种不同目视外观量值具有不同的趋势，尤其在较高蛋白质浓度时，原因在于本征所测量的差异。数据还显示量值趋势在似乎具有升高的溶液乳光的这两种抗体之间是一致的。
我们还检验了随浓度和pH变化的抗-IL13抗体浓度。图10中显示结果。显示最大浊度的溶液处在mAb等电点(pI)附近。
尽管不受理论约束，但是我们解释这些结果以表明350nm波长处的吸光度(浊度)随渐增的蛋白质浓度增加，原因是蛋白质吸收带吸收光，其中最大值因这个峰的尾宽阔而在280nm附近。增加A350对mAb溶液浓度的第二促进因素是光散射的非线性增加，从而减少总透射光。
此外，我们评估了随mAb浓度变化的亚可见颗粒计数并且图11中显示这些结果。没有通过HIAC光阻分析观察到尺寸>2μm的亚可见颗粒物的显著增加，这表明>2μm的颗粒物并不有助于抗-IL13抗体溶液的乳光或浊度。图12显示当抗体溶液用逐步变小的孔径过滤(降至0.1μm或100nm)时，125mg/mL抗-IL13抗体溶液的散射比浊、透射比浊和静态光散射的量值。图11和图12中所显示的这些结果总体上表明抗-IL13抗体溶液和药品制剂外观不由引起光散射的浓度依赖性的亚可见或亚微米颗粒物质决定。
接下来，我们研究在125mg/mL和204mg/mL时溶液外观随溶液pH变化的依赖性。使用在600nm的透射光强度的温度扫描评估溶液外观。结果在图13中显示并且表明，随递减温度变化而保持恒定的抗-IL13抗体溶液乳光不归因于临界现象如液-液相分离，其中溶液组分具有发散性溶解度并形成不同组成的两个分立相。这表明不考虑初始溶液乳光/目视外观(室温)外，溶液均匀性(相分离)在常见的储存和/或暴露温度范围内不受温度影响。
热稳定性(Tmelt)研究
我们在毛细管差异性扫描量热器中测量了两个部分可分辨峰e随制剂组成和溶液pH变化的热熔化跃迁峰。图14中显示结果。如图14中所示，在pH6.0-7.5之间观察到随pH变化的抗-IL13熔化跃迁行为的最大值。主流科学观点是熔化跃迁越低地出现，体系在储存任何时间时的预期物理稳定性越低。见，例如，Chi等人,ProteinScience12(5):903-913(2003)；Chi等人,PharmaceuticalResearch20(9):1325-1336(2003)；Goldberg等人,J.Pharm.Sciences100(4):1306-1315(2011)。因此，对于抗-IL13抗体制剂(pH5.7)，本文中显示的物理稳定性数据是令人惊讶和出乎意料的。
胶体稳定性
通过使用稀释抗体溶液(0.10-1mg/mL之间)的静态光散射以及在抗体浓度超过200mg/mL时通过光散射测量胶体稳定性。胶体稳定性指悬浮于溶液中的大分子的溶液行为，并且允许人们研究大分子如单克隆抗体之间的平衡、时间平均化相互作用。不受理论约束，当相互作用是排斥时，则可以预期溶液组成保持稳定。然而，净吸引性相互作用在溶质分子之间出现，并且通常与相变和蛋白质溶解性问题相关。
采用简单缓冲液中的样品，我们测量了随溶液pH变化的抗-IL13抗体的渗透第二维里系数(B2)(在范围从0.1至1.0mg/mL的浓度)。注意在图15和图16中，高于0的值是表示净排斥性相互作用的正渗透第二维里系数，并且低于0的值是表示净吸引性分子间相互作用的负渗透第二维里系数。图15中的数据显示抗-IL13抗体具有跨该pH范围的吸引性相互作用，但是最强烈的吸引性相互作用在pH5.5-6.5之间出现。对于图16中所显示的结果，将制剂添加物添加至处于不同pH的溶液。如可以在图16中见到，在pH5.5-6.5测量的渗透第二维里系数保持为负并且因此吸引性的。图17中显示用多角度光散射检测器在将强度外推至散射角0的浓度范围1-200mg/ml范围内的光散射量值。这些数据揭示散射强度分布与针对HACH比浊计所观察到的散射强度分布高度相似(比较图8至图17)。两种仪器均测量散射光强度，并且因此均测量瑞利散射。这种散射在不含颗粒物的溶液中占优势并由溶液的低密度和浓度波动引起，所述低密度和浓度波动还依赖于散射分子之间的相互作用。当分子彼此逐渐密切接触并且它们的时间/空间位置变得相关，导致破坏性干扰散射光时，散射光强度出现下降(见，例如，Bettelheim等人,BiophysicalJournal41(1):29-33(1983)；Xia等人,BiophysicalJournal66(3_Pt_1):861-872(1994)；和Xia等人,BiophysicalJournal41(1):29-33(1996)。图18显示随制剂pH变化的抗-IL13抗体静态光散射数据。图18中的数据表述为在抗体浓度直至200mg/mL时观察到的表观分子量。图18中显示的数据相对于排除mAb体积的简单硬球种类模型的理论散射(图18中的短划线)，显示跨浓度范围的弱(pH7.2)至适度吸引性胶体(pH6.5)相互作用和抗-IL13抗体自我缔合。
抗-IL13和抗-CD20均显示可比较水平的由吸引性胶体互作用和mAb自我缔合引起的浊度，如图19中所显示。令人惊讶地，这类吸引性胶体相互作用不表现为伴随抗-IL13抗体制剂的高粘度问题(例如，在150mg/mL时>15cP)或流变学问题，如图20中所显示。然而，抗-CD20抗体的胶体相互作用的确对溶液流变学产生影响，不仅产生溶液乳光(图8)，还产生在25℃和150mg/mL时>15cP的高粘度(图20)。
长期物理稳定性、化学稳定性和效力稳定性
为检验长期稳定性和效力，将抗-IL13抗体以125mg/mL在20mM乙酸组氨酸pH5.7，175mM蔗糖和0.3mg/mL聚山梨酯20中配制并且随后经受各种储存条件。将小瓶在5℃或25℃储存表3中所示的周数(在5℃至多156周和在25℃至多26周)。在如表3中所示的每个时间点，分析样品的颜色外观和澄清度(CAC)、pH和所示的化学或物理稳定性量值。此外，在每个时间点还评估生物活性(效力)。如通过表3中的数据显示，以125mg/mL在20mM乙酸组氨酸pH5.7，175mM蔗糖和0.3mg/mL聚山梨酯20中配制的抗-IL13抗体维持效力并且在5℃持续全部156周(三年)和在25℃持续全部26周展示良好的化学稳定性和物理稳定性。这些数据证实，这种制剂维持抗-IL13抗体的所需化学属性、物理属性和效力属性持续延长的时间段。
表3.稳定性和用来确定抗-IL13抗体的长期物理稳定性、化学稳定性和效力稳定性的条件。
CAC：颜色外观和澄清度
SY＝略微黄色
LIQ＝液体
SOPL＝略微乳白色
结论
我们已经显示抗-IL13抗体已经成功地在促进长期化学稳定性和物理稳定性并维持效力的pH和溶液条件下用赋形剂配制。具体而言，该制剂含有在20mM乙酸组氨酸pH5.7，175mM蔗糖和0.3mg/mL聚山梨酯20中浓度100mg/mL和以上(包括125mg/mL和150mg/mL)的抗体。令人惊讶地，我们发现该制剂具有在25℃<15cP的合乎需要的粘度分布。这种粘度分布对于易制性是合乎需要的并且还易于施用性，例如皮下注射是是合乎需要的，其中出于几个理由(包括患者舒适和依从性)，小体积的高浓度药物是最佳的。我们观察到相同或相似制剂中的其他抗体具有在25℃>15cP的不利粘度分布，这突显抗-IL13抗体制剂的粘度分布的不可预测性。
此外，两种经常使用的蛋白质制剂选择标准包括热稳定性和胶体稳定性(见Chi等人,ProteinScience12(5):903-913(2003)；Chi等人,PharmaceuticalResearch20(9):1325-1336(2003))。对抗-IL13抗体溶液的解折叠温度的热分析表明，在pH5.4-6.0条件下的物理稳定性将对抗体制剂的物理稳定性不是最佳的。抗-IL13抗体溶液的胶体稳定性分析还表明，在pH范围5.5-6.5内的配制条件将是维持低聚集率的最低要求。然而，令人惊讶地，如本文所提出的数据显示，在pH5.7配制的抗-IL13抗体在延长的时间段范围内在5℃并且还在加速条件下展示良好的物理稳定性。还令人惊讶的是，这些条件下的产品稳定性在物理和化学方面均优于更高pH时所观察到的产品稳定性，即便存在较低的热熔化跃迁和胶体稳定性。尽管配制的抗-IL13抗体溶液外观(和浊度)在选择的配制条件下比某些未选择的条件下更为乳白色，但是分子特性和制剂组成在实时和加速的储存条件下均维持最佳稳定性，维持效力并且为以小体积递送高浓度药品提供所需的溶液流变学特性。
皮下施用装置
通过评价多种市售部件选择一种用于施用上述抗-IL13制剂的皮下施用装置，所述皮下施用装置包括带针头的预充式注射器、带活塞挡止器的活塞、针护罩和针头安全装置。例如，评价的部件包括玻璃棒，带柱撑针的成型注射器、活塞和活塞挡止器、刚性针护罩和针头安全装置。
出于对下述制剂特性的影响，根据本领域技术人员已知的方法以各种组合评价各种部件，所述制剂特性包括但不限于稳定性和其他考虑事项：如患者舒适和方便，这包括多种因素，如在制剂具有如本文所述的某些粘度时针头规格和针头内直径对注射时间和滑移力的影响。这些研究导致我们选择一种预充式1.0mL低钨硼硅酸盐玻璃(I型)注射器和带刚性针护罩(包括FM27/0(Daetwyler)和刚性聚丙烯护罩)的不锈钢5斜面27G1/2英寸薄壁柱撑针头作为最佳皮下施用装置用于施用如本文所述的以高浓度配制的来金珠单抗。此外，活塞杆含有橡胶活塞挡止器，所述橡胶活塞挡止器包含4023/50橡胶和乙烯-四氟乙烯(ETFE)涂层(WestPharmaceuticalServices,Inc.)。该皮下施用装置还包含针头安全装置，Ultrasafe针套X100L(SafetySyringes,Inc.)。上文详述的皮下施用装置在下文称作柱撑针头预充式注射器或“SINPFS”。
为了显示小瓶中来金珠单抗药品与选择的SINPFS相当的稳定性，我们在40℃/环境相对湿度评价了手工填入2cc小瓶或1mLSINPFS中的GMP原料药。我们通过大小排阻层析(SEC)评估如以单体变化表征为特征的降解速率以及通过成像毛细管等电聚焦(ICIEF)和毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)评估主要峰百分比的变化。
这些研究揭示在40℃储存4周后，在小瓶和SINPFS之间如通过SEC所测量的单体减少方面(各自显示0.6％-0.9％减少)或在主要峰百分比下降方面(各自显示18-21％减少，如通过ICIEF所测量，和0.9％-1.5％减少，如通过CE-SDS所测量)不存在显著差异。此外，层析图是彼此可比较的并且与小瓶样品相比，在SINPFS样品中没有观察到新峰。
存在降解速率的轻微差异(在40℃，4周后，小瓶的高分子量种类增加0.5％-0.6％，相对而言SINPFS的高分子量种类增加0.8％)。认为这种轻微差异不可能在实时储存期间影响产品质量。
因此，我们得出结论：上文描述的数据显示在小瓶中如上文所述配制的高浓度来金珠单抗药品的稳定性可比于上文描述的选择的SINPFS中的稳定性。
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