技术领域本发明涉及生物技术领域中抗逆相关蛋白及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用。
背景技术：
干旱、高盐及氧化等逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。因此，了解烟草对逆境条件的应答与信号传导机制，提高烟草品种的抗逆性，成为烟草遗传研究及烟草品种改良的重要任务之一。在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，可以利用生物技术改进植物生长特性，进而提高植物对逆境的适应能力。在干旱、高盐和氧化等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性。为解决上述技术问题，本发明首先提供了抗逆相关蛋白。本发明所提供的抗逆相关蛋白，其名称为SiNF-YB8，来源于豫谷1号，是如下a)或b)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列1的蛋白质；b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有所述SiNF-YB8功能的蛋白质。为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述b)中的SiNF-YB8可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的SiNF-YB8的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述SiNF-YB8相关的生物材料。本发明所提供的与所述SiNF-YB8相关的生物材料，为下述B1)至B20)中的任一种：B1)编码所述SiNF-YB8的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；B17)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；B20)含有B4)所述重组载体的转基因植物器官。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：1)核苷酸序列是序列表中序列2的第1-639位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；2)核苷酸序列是序列表中序列2的第117-339位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述SiNF-YB8的cDNA分子或基因组DNA分子；4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述SiNF-YB8的cDNA分子或基因组DNA分子。其中，序列2由639个核苷酸组成，序列2的第1-639位核苷酸编码序列1所示的氨基酸序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码SiNF-YB8的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的SiNF-YB8的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SiNF-YB8且具有SiNF-YB8功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，B2)所述的含有编码SiNF-YB8的核酸分子的表达盒(SiNF-YB8基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达SiNF-YB8的DNA，该DNA不但可包括启动SiNF-YB8基因转录的启动子，还可包括终止SiNF-YB8基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶(\LAP\,Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。可用现有的表达载体构建含有所述SiNF-YB8基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。上述生物材料中，所述的微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。在本发明的一个实施方式中，SiNF-YB8的编码基因(即序列2的第1-639位核苷酸)通过含有SiNF-YB8的编码基因的表达盒的重组载体导入农杆菌C58C1中。所述重组载体为用序列2的第1-639位核苷酸所示的DNA分子替换pBI121的SmaⅠ和SacI识别位点间的片段得到的重组载体pBI121-SiNF-YB8，pBI121-SiNF-YB8表达SiNF-YB8蛋白。为解决上述技术问题，本发明还提供了所述SiNF-YB8或所述与所述SiNF-YB8相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用。上述应用中，所述植物为陆生植物。所述陆生植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为茄科植物和/或十字花科植物；所述茄科植物可为烟草；所述十字花科植物可为拟南芥；所述单子叶植物具体可为谷子(Setariaitalica)。所述烟草具体可为烟草W38；所述谷子(Setariaitalica)具体可为豫谷1号。上述应用中，所述抗逆性为抗旱性和/或耐盐性和/或耐渗透胁迫性。为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗逆性转基因植物的方法。本发明所提供的一种培育抗逆性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述SiNF-YB8的编码基因得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物的步骤。在本发明的实施例中，所述SiNF-YB8的编码基因(即序列2的第1-639位核苷酸)通过含有SiNF-YB8基因表达盒的SiNF-YB8基因重组表达载体导入目的植物中。上述方法中，其中所述SiNF-YB8基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述SiNF-YB8基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。在本发明的一个实施例中，SiNF-YB8基因重组表达载体具体为用序列2的第1-639位核苷酸所示的DNA分子替换pBI121的SmaⅠ和SacI识别位点间的片段得到的重组载体pBI121-SiNF-YB8，pBI121-SiNF-YB8表达SiNF-YB8蛋白。所述SiNF-YB8基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII,AcademyPress,NewYork,pp.411-463；GeisersonandCorey,1998,PlantMolecularBiology(2ndEdition).)。上述方法中，所述SiNF-YB8的编码基因可为序列表中序列2的第1-639核苷酸所示的DNA分子。上述方法中，所述植物为陆生植物。所述陆生植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为茄科植物和/或十字花科植物；所述茄科植物可为烟草；所述十字花科植物可为拟南芥；所述单子叶植物具体可为谷子(Setariaitalica)。所述烟草具体可为烟草W38；所述谷子(Setariaitalica)具体可为豫谷1号。上述方法中，所述抗逆性为抗旱性和/或耐盐性和/或耐渗透胁迫性。上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述SiNF-YB8基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。为解决上述技术问题，本发明还提供了扩增编码所述SiNF-YB8的核酸分子全长或其片段的引物对。实验证明，本发明的抗逆相关蛋白SiNF-YB8可以提高植物的抗旱性、耐渗透胁迫性和耐盐性。B8-1、B8-2和B8-3的萌发率在MS0平板上分别与W38没有差异；B8-1、B8-2和B8-3的萌发率在PEG平板上分别是W38的3.15倍、3.15倍、3.15倍；B8-1、B8-2和B8-3的萌发率在甘露醇平板上分别是W38的2.25倍、2.24倍、2.25倍。B8-1、B8-2和B8-3的根长在MS0平板上与W38没有差异；B8-1、B8-2和B8-3的根长在PEG平板上分别是W38的2.41倍、2.40倍、2.41倍；B8-1、B8-2和B8-3的根长在甘露醇平板上分别是W38的1.80倍、1.81倍、1.81倍。干旱处理后的B8-1幼苗的存活率为W38的3.5倍；干旱处理后的B8-2幼苗的存活率为W38的3.6倍；干旱处理后的B8-3幼苗的存活率为W38的3.5倍。atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3/SiNF-YB8-2的根长在MS0平板上分别是atnf-yb3的1.37倍、1.38倍；atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3/SiNF-YB8-2的根长在甘露醇平板上分别是atnf-yb3的1.30倍、1.31倍。实验证明，本发明的抗逆相关蛋白SiNF-YB8及其编码基因可用来提高植物的抗旱性和耐渗透胁迫性。附图说明图1为干旱环境诱导SiNF-YB8编码基因的表达。其中，A为干旱处理后SiNF-YB8编码基因的相对表达量；B为双氧水抑制剂DMTU处理抑制滤纸吸水模拟的干旱环境对SiNF-YB8表达的诱导；C为甘露醇处理后SiNF-YB8编码基因的相对表达量；D为DMTU处理抑制甘露醇模拟的干旱环境对SiNF-YB8表达的诱导。图2为转SiNF-YB8基因烟草中SiNF-YB8及其表达的鉴定。其中，A为转SiNF-YB8基因烟草中SiNF-YB8的鉴定；B为转SiNF-YB8基因烟草中SiNF-YB8表达的鉴定。图3为不同处理的转基因烟草种子的萌发情况。其中，MS0表示MS0平板，PEG表示PEG平板，甘露醇表示甘露醇平板。图4为不同处理的转基因烟草幼苗的根长。图5为干旱处理前后的转基因烟草的幼苗生长状况。图6为atnf-yb3的根长。其中A为atnf-yb3的幼苗外观；B为atnf-yb3的根长。图7为转基因植株atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3atnf-yb3/SiNF-YB8-2的SiNF-YB8表达量及幼苗根长。其中，A为转基因植株atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3/SiNF-YB8-2的幼苗外观；B为转基因植株atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3/SiNF-YB8-2的SiNF-YB8表达量；C为转基因植株atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3/SiNF-YB8-2的幼苗根长，1表示atnf-yb3/SiNF-YB8-1，2表示atnf-yb3/SiNF-YB8-2。图8为不同处理的转基因拟南芥幼苗的根长。图9为SiNF-YB8的亚细胞定位。其中，A为SiNF-YB8的亚细胞定位；B为16318hGFP空载体对照。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的pBI121(LiZY,XuZS,HeGY,YangGX,ChenM,LiLC,MaYZ.(2012)OverexpressionofsoybeanGmCBL1enhancesabioticstresstoleranceandpromoteshypocotylelongationinArabidopsis.BiochemBiophysResCommun，427:731-736.)公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的烟草W38(LUYan,LIUPei,XUZhao-Shi,ZHANGRui-Yue,LIULi,LILian-Cheng,CHENMing,YEXing-Guo,CHENYao-Feng,andMAYou-Zhi(2008)OverexpressionofW6GeneIncreasesSaltToleranceinTransgenicTobaccoPlant.ActaAgronSin,34:984–990.)公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的野生型拟南芥Col-0(LiZY,XuZS,HeGY,YangGX,ChenM,LiLC,MaYZ.(2012)OverexpressionofsoybeanGmCBL1enhancesabioticstresstoleranceandpromoteshypocotylelongationinArabidopsis.BiochemBiophysResCommun，427:731-736.)公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的16318hGFP(LiZY,XuZS,HeGY,YangGX,ChenM,LiLC,MaYZ.(2012)OverexpressionofsoybeanGmCBL1enhancesabioticstresstoleranceandpromoteshypocotylelongationinArabidopsis.BiochemBiophysResCommun，427:731-736.)公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例1、抗逆相关蛋白SiNF-YB8编码基因的克隆与表达水平1、抗逆相关蛋白SiNF-YB8编码基因的克隆本发明的发明人从豫谷1号中分离克隆出谷子抗逆相关蛋白SiNF-YB8基因。具体克隆方法如下：将沙土中生长20天左右的谷子品种豫谷1号(中国农业科学院作物科学研究所)进行干旱处理5小时，用液氮速冻，采用Trizol法(TianGen)提取谷子叶片总RNA，用反转录酶XL(AMV)合成第一链cDNA，采用SMART法合成dscDNA，将dscDNA作为基因克隆的模板，进行PCR扩增，扩增得到核苷酸序列为序列表的序列2的第1-639位核苷酸的DNA分子，该DNA分子编码序列表中序列1所示的蛋白质，将序列表的序列1所示的蛋白质命名为SiNF-YB8。2、抗逆相关蛋白SiNF-YB8编码基因的表达分析2.1干旱诱导抗逆相关蛋白SiNF-YB8编码基因的表达实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：2.1.1将室温生长20d左右的盆栽的豫谷1号幼苗取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于干燥的滤纸上，干旱培养0.5小时，提取植株总RNA，得到干旱0.5小时RNA。按照上述方法，将0.5小时分别替换为1小时、2小时、5小时、12小时和24小时，其他步骤均不变，分别得到干旱1小时RNA、干旱2小时RNA、干旱5小时RNA、干旱12小时RNA和干旱24小时RNA。提取室温生长20d左右的盆栽的豫谷1号幼苗植株的总RNA，得到对照RNA。对上述RNA中的SiNF-YB8编码基因的表达量进行定量分析(图1中A)，引物为CGAGGACTTCATCTGCGCGT和CTCGTCATCTTGTTCTCCAT，内参为Actin，内参的引物为CTGACGCCGAGGATATCCA和GCCTTGACCATACCAGTTCCA。结果表明，SiNF-YB8在干旱条件下，一直被诱导表达，SiNF-YB8的相对表达量在干旱诱导12小时达到最大值，随后下降：SiNF-YB8在干旱诱导0.5小时时的相对表达量为1.6，在干旱诱导1小时时的相对表达量为1.8，在干旱诱导2小时时的相对表达量为3.4，在干旱诱导5小时时的相对表达量为6.5，在干旱诱导12小时时的相对表达量为8.4，在干旱诱导24小时时的相对表达量为7.8。2.1.2将室温生长20d左右的盆栽的豫谷1号幼苗20株取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于干燥的滤纸，10株培养6小时，另10株培养12小时，然后提取植株总RNA，分别得到滤纸干燥处理6小时与滤纸干燥处理12小时RNA。将室温生长20d左右的盆栽的豫谷1号幼苗20株取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于10mM的双氧水抑制剂DMTU水溶液中，培养6小时，取出幼苗，吸干根上的水分后将幼苗置于干燥的滤纸，其中10株培养6小时，另10株培养12小时，然后提取植株总RNA，分别得到DMTU-滤纸干燥处理6小时RNA与DMTU-滤纸干燥处理12小时RNA。对上述RNA及2.1.1的对照RNA中的SiNF-YB8编码基因的表达量进行定量分析(图1中B)，引物为CGAGGACTTCATCTGCGCGT和CTCGTCATCTTGTTCTCCAT，内参为Actin，内参的引物为CTGACGCCGAGGATATCCA和GCCTTGACCATACCAGTTCCA。结果表明，滤纸干燥模拟的干旱环境能够诱导SiNF-YB8的表达，DMTU处理能够抑制干旱环境对SiNF-YB8表达的诱导：SiNF-YB8的相对表达量在滤纸干燥处理豫谷1号6小时时为3.8，在DMTU-滤纸干燥处理豫谷1号6小时时为1.3，为滤纸干燥处理的0.2；SiNF-YB8的相对表达量在滤纸干燥处理豫谷1号12小时时为8.4，在DMTU-滤纸干燥处理豫谷1号12小时时为4.1，为滤纸干燥处理的0.49。2.2甘露醇诱导抗逆相关蛋白SiNF-YB8编码基因的表达实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：2.2.1将室温生长20d左右的盆栽的豫谷1号幼苗取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于200mM的甘露醇水溶液中，培养0.5小时，提取植株总RNA，得到甘露醇处理0.5小时RNA。按照上述方法，将0.5小时分别替换为1小时、2小时、6小时、12小时和24小时，其他步骤均不变，分别得到甘露醇处理1小时RNA、甘露醇处理2小时RNA、甘露醇处理6小时RNA、甘露醇处理12小时RNA和甘露醇处理24小时RNA。对上述RNA及2.1.1的对照RNA中的SiNF-YB8编码基因的表达量进行定量分析(图1中C)，引物为CGAGGACTTCATCTGCGCGT和CTCGTCATCTTGTTCTCCAT，内参为Actin，内参的引物为CTGACGCCGAGGATATCCA和GCCTTGACCATACCAGTTCCA。结果表明，SiNF-YB8在甘露醇模拟的干旱环境下，一直被诱导表达，SiNF-YB8的相对表达量在甘露醇模拟的干旱环境诱导6小时达到最大值，随后下降：SiNF-YB8在甘露醇模拟的干旱环境诱导0.5小时时的相对表达量为1.8，在甘露醇模拟的干旱环境诱导1小时时的相对表达量为2.5，在甘露醇模拟的干旱环境诱导2小时时的相对表达量为6.0，在甘露醇模拟的干旱环境诱导6小时时的相对表达量为9.2，在甘露醇模拟的干旱环境诱导12小时时的相对表达量为5.3，在甘露醇模拟的干旱环境诱导24小时时的相对表达量为2.8。2.2.2将室温生长20d左右的盆栽的豫谷1号幼苗取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于200mM的甘露醇水溶液中，培养2小时，提取植株总RNA，得到甘露醇处理2小时RNA。按照上述方法，将2小时替换为6小时，其他步骤均不变，得到甘露醇处理6小时RNA。将室温生长20d左右的盆栽的豫谷1号幼苗取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于10mM的双氧水抑制剂DMTU水溶液中，培养2小时，取出幼苗，吸干根上的水分后将幼苗置于200mM的甘露醇水溶液中，培养2小时，提取叶片总RNA，得到DMTU-甘露醇处理2小时RNA。按照上述方法，将2小时均替换为6小时，其他步骤均不变，得到DMTU-甘露醇处理6小时RNA。对上述RNA及2.1.1的对照RNA和中的SiNF-YB8编码基因的表达量进行定量分析(图1中D)，引物为CGAGGACTTCATCTGCGCGT和CTCGTCATCTTGTTCTCCAT，内参为Actin，内参的引物为CTGACGCCGAGGATATCCA和GCCTTGACCATACCAGTTCCA。结果表明，甘露醇模拟的干旱环境能够诱导SiNF-YB8的表达，DMTU处理后能够抑制干旱环境对SiNF-YB8表达的诱导：SiNF-YB8的相对表达量在甘露醇处理豫谷1号2小时时为6.0，在DMTU-甘露醇处理豫谷1号2小时时为4，为甘露醇处理的0.67；SiNF-YB8的相对表达量在甘露醇处理豫谷1号6小时时为9.2，在DMTU-甘露醇处理豫谷1号6小时时为6.2，为甘露醇处理的0.67。实施例2、转SiNF-YB8基因的植株的抗逆性增强一、转SiNF-YB8基因植株的构建1、重组表达载体的构建将pBI121的SmaⅠ和SacI识别位点之间的序列替换为序列2的第1-639位核苷酸，保持其他序列不变，得到重组载体pBI121-SiNF-YB8。pBI121-SiNF-YB8含有序列2的第1-639位核苷酸所示的SiNF-YB8编码基因，可表达SiNF-YB8蛋白。2、重组菌的构建将步骤1的pBI121-SiNF-YB8导入农杆菌C58C1(北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组菌C58C1-pBI121-SiNF-YB8，C58C1-pBI121-SiNF-YB8含有序列2的第1-639位核苷酸所示的SiNF-YB8编码基因。将pBI121导入农杆菌C58C1，得到重组菌C58C1-pBI121。3、转基因植物的构建3.1将步骤2的C58C1-pBI121-SiNF-YB8接种于LB液体培养基(LB液体培养基中含有终浓度为50mg/ml的利福平、100mg/ml的卡那霉素和50mg/ml的庆大霉素)中，28℃、3000rpm下培养30小时；3.2将步骤3.1的菌液转接至LB液体培养基(LB液体培养基中含有终浓度为50mg/ml的利福平、100mg/ml的卡那霉素和50mg/ml的庆大霉素)中，28℃、300rpm下培养14小时(此时菌液的OD600为1.5-3.0)；3.3将步骤3.2的菌液4℃、4000g离心10min，收集菌体，用含10％蔗糖和0.02％silwet的MS液体培养基重悬菌体，得到农杆菌侵染液，使农杆菌侵染液的OD600为0.8-1.0；3.4将烟草W38无菌苗的叶片剪成0.5cm×0.5cm大小，放入步骤3.3的农杆菌侵染液中10分钟，期间不断轻摇几次，得到侵染后的叶片；3.5用无菌滤纸吸去步骤3.4的侵染后的叶片上的多余菌液，置于MS固体培养基上于28℃下暗培养3天；3.6将步骤3.5的叶片用无菌水清洗2-3次后转入分化培养基(该分化培养基为在MS液体培养基中加入下述浓度的物质得到：6-BA(2mg/L)、NAA(0.2mg/L)、Cb(500mg/L)、Kan(lOOmg/L)、Agar(8g/L)、蔗糖(30g/L)，该分化培养基的pH为5.8)中，于25℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养至愈伤组织分化出小芽；3.7将步骤3.6的长度大于1cm的小芽转入1/2MS生根培养基(1/2MS生根培养基为在1/2MS液体培养基中加入下述浓度的物质得到：Kan(100mg/L)、Cef(250mg/L)、Agar(8g/L)、蔗糖(30g/L)，该1/2MS生根培养基的pH为5.8)上，于25℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养；3.8将步骤3.7的生根后的烟草幼苗复壮后移栽至温室中，该植株即为T0代转基因植株，将转基因植株传代至T3代(每代均为自交)，得到T3代植株；3.9在基因组水平上鉴定步骤3.8的T3代植株中的SiNF-YB8基因。烟草W38(WT)为野生型对照。引物对为：F:5′-CGAGGACTTCATCTGCGCGT-3′；R:5′-CTCGTCATCTTGTTCTCCAT-3′；预期条带大小为271bp。部分样本的结果见图2中A，结果表明，编号为B8-1、B8-2和B8-3的T3代植株的PCR产物中均有约271bp的条带，说明B8-1、B8-2和B8-3的T3代植株中均含有SiNF-YB8基因；3.10利用半定量PCR鉴定步骤3.9的B8-1、B8-2和B8-3的T3代植株中的SiNF-YB8基因的表达。烟草W38(WT)为野生型对照。引物对为：F:5′-CGAGGACTTCATCTGCGCGT-3′；R:5′-CTCGTCATCTTGTTCTCCAT-3′，预期条带大小为271bp。内参为Tublin，内参的引物为GTCTGGTGATGGTGTTAGC和CCTATCAGCAATTCCAGGAAAC。结果见图2中B，结果表明，编号为B8-1、B8-2和B8-3的T3代植株的PCR产物中均有约271bp的条带，说明B8-1、B8-2和B8-3的T3代植株中均表达SiNF-YB8基因。按照步骤3.1-3.8的方法，将C58C1-pBI121-SiNF-YB8替换为C58C1-pBI121，替他步骤不变，得到转空载体的转基因烟草，将其命名为空载体烟草。二、转SiNF-YB8基因植株的抗逆性鉴定对实施例2中的编号为B8-1、B8-2和B8-3转基因烟草进行抗逆性(即抗旱性和耐渗透胁迫性)鉴定。其中，用经PEG6000处理的种子的萌发率与幼苗的根长及干旱处理后的幼苗存活率评判转基因烟草的抗旱性与耐渗透胁迫性，用经甘露醇处理的种子的萌发率和幼苗的根长评判转基因烟草的耐渗透胁迫性与抗旱性。实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：1、种子萌发率将每个MS0培养基(在MS中加入琼脂得到的固体培养基)平板(即MS0平板)分为4个区域，分别在每个平板的每个区域放入无菌烟草W38种子、实施例2的空载体烟草的无菌种子、实施例2的无菌B8-1的种子、实施例2的无菌B8-2的种子和实施例2的无菌B8-3的种子，每个区域一种烟草种子，每种烟草的种子均为60粒。将每个含有终浓度为3％的PEG6000的MS培养基平板(即PEG平板，该平板是在MS0培养基中加入PEG6000至PEG6000的质量含量为3％得到的固体培养基)分为4个区域，分别在每个平板的每个区域放入无菌烟草W38种子、实施例2的空载体烟草的无菌种子、实施例2的无菌B8-1的种子、实施例2的无菌B8-2的种子和实施例2的无菌B8-3的种子，每个区域一种烟草种子，每种烟草的种子均为60粒。将每个含有终浓度为200mM的甘露醇的MS培养基平板(即甘露醇平板，该平板是在MS0培养基中加入甘露醇至甘露醇的终浓度为200mM得到的固体培养基)分为4个区域，分别在每个平板的每个区域放入无菌烟草W38种子、实施例2的空载体烟草的无菌种子、实施例2的无菌B8-1的种子、实施例2的无菌B8-2的种子和实施例2的无菌B8-3的种子，每个区域一种烟草种子，每种烟草的种子均为60粒。将上述MS0平板、PEG平板和甘露醇平板在25℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养5天，统计烟草种子的发芽率(图3与表2)。表2、不同处理的转基因烟草种子的萌发率(％)W38空载体烟草B8-1B8-2B8-3MS0平板100100100100100PEG平板20±320±462±362±662±2甘露醇平板41±241±391±291±491±2结果表明，MS0平板和PEG平板上的W38与空载体烟草的萌发率没有显著产差异，B8-1、B8-2和B8-3的萌发率在MS0平板上与W38没有差异；B8-1、B8-2和B8-3的萌发率在PEG平板上分别是W38的3.15倍、3.15倍、3.15倍；B8-1、B8-2和B8-3的萌发率在甘露醇平板上分别是W38的2.25倍、2.24倍、2.25倍。表明，转SiNF-YB8基因烟草的抗旱性耐渗透胁迫性和耐渗透胁迫性均显著提高。2、幼苗根长分别在MS0培养基(在MS中加入琼脂得到的固体培养基)平板上放入无菌烟草W38种子、实施例2的空载体烟草的无菌种子、实施例2的无菌B8-1的种子、实施例2的无菌B8-2的种子和实施例2的无菌B8-3的种子，然后在25℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养7天，分别得到烟草W38幼苗、空载体幼苗、B8-1幼苗、B8-2幼苗和B8-3幼苗。分别将烟草W38幼苗、空载体幼苗、B8-1幼苗、B8-2幼苗和B8-3幼苗各3株移入MS0培养基(在MS中加入琼脂得到的固体培养基)平板(即MS0平板)上，然后在25℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养7天，分别得到待测W38幼苗、待测空载体幼苗、待测B8-1幼苗、待测B8-2幼苗和待测B8-3幼苗，分别测定待测W38幼苗、待测空载体幼苗、待测B8-1幼苗、待测B8-2幼苗和待测B8-3幼苗的根长(表3和图4)。按照上述方法，将MS0培养基平板替换为含有终浓度为6％的PEG6000的MS培养基平板(即PEG平板，该平板是在MS0培养基中加入PEG6000至PEG6000的质量含量为6％得到的固体培养基)，其他步骤均不变，分别得到待测PEG处理W38幼苗、待测PEG处理空载体幼苗、待测PEG处理B8-1幼苗、待测PEG处理B8-2幼苗和待测PEG处理B8-3幼苗，分别测定待测PEG处理W38幼苗、待测PEG处理空载体幼苗、待测PEG处理B8-1幼苗、待测PEG处理B8-2幼苗和待测PEG处理B8-3幼苗的根长(表3和图4)。按照上述方法，将MS0培养基平板替换为含有终浓度为200mM的甘露醇的MS培养基平板(即甘露醇平板，该平板是在MS0培养基中加入甘露醇至甘露醇的终浓度为200mM得到的固体培养基)，其他步骤均不变，分别得到待测甘露醇处理W38幼苗、待测甘露醇处理空载体幼苗、待测甘露醇处理B8-1幼苗、待测甘露醇处理B8-2幼苗和待测甘露醇处理B8-3幼苗，分别测定待测甘露醇处理W38幼苗、待测甘露醇处理空载体幼苗、待测甘露醇处理B8-1幼苗、待测甘露醇处理B8-2幼苗和待测甘露醇处理B8-3幼苗的根长(表3和图4)。表3、不同处理的转基因烟草幼苗根长(cm)W38空载体烟草B8-1B8-2B8-3MS0平板4.31±0.34.31±0.24.41±0.144.42±0.114.41±0.12PEG平板1.40±0.131.41±0.143.44±0.103.42±0.143.45±0.11甘露醇平板1.60±0.151.60±0.142.91±0.152.91±0.142.92±0.13结果表明，在MS0平板、PEG平板和甘露醇平板上W38与空载体烟草的根长没有显著产差异，B8-1、B8-2和B8-3的根长在MS0平板上与W38没有差异；B8-1、B8-2和B8-3的根长在PEG平板上分别是W38的2.41倍、2.40倍、2.41倍；B8-1、B8-2和B8-3的根长在甘露醇平板上分别是W38的1.80倍、1.81倍、1.81倍。表明，转SiNF-YB8基因烟草的抗旱性和耐渗透胁迫性均显著提高。3、幼苗存活率在装有营养土的花盆(花盆中营养土和蛭石的体积比为1:1)中分别放入无菌烟草W38种子、实施例2的空载体烟草的无菌种子、实施例2的无菌B8-1的种子、实施例2的无菌B8-2的种子和实施例2的无菌B8-3的种子，然后在25℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养15天，分别得到W38幼苗、空载体幼苗、B8-1幼苗、B8-2幼苗和B8-3幼苗。对W38幼苗、空载体幼苗、B8-1幼苗、B8-2幼苗和B8-3幼苗进行干旱处理(即均不再浇水)至W38幼苗枯萎(不浇水2周)，然后对所有幼苗复水一周，统计干旱处理后的幼苗存活率(图5)。结果显示，W38幼苗的存活率为25％±2％；干旱处理后的空载体幼苗的存活率为24％±5％，与干旱处理后的W38幼苗的存活率没有显著差异；B8-1幼苗的存活率为88％±4％，是W38的3.5倍；B8-2幼苗的存活率为90％±7％，是W38的3.6倍；B8-3幼苗的存活率为86％±4％，是W38的3.5倍。结果表明，转SiNF-YB8基因烟草的抗旱性和耐渗透胁迫性均显著提高。实施例3、SiNF-YB8基因可提高atnf-yb3突变体的抗逆性一、拟南芥突变体抗逆性的鉴定从ABRC得到atnf-yb3(AtNF-YB3基因在ABRC中的突变体编号为SALK_074951)。测定atnf-yb3的根长，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：分别在MS0培养基(在MS中加入琼脂得到的固体培养基)平板上放入无菌野生型拟南芥Col-0(WT)种子、步骤1的atnf-yb3无菌种子，然后在25℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养7天，分别得到WT幼苗和atnf-yb3幼苗。分别将WT幼苗和atnf-yb3幼苗各3株移入MS0平板上，然后在25℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养7天，分别得到待测WT幼苗和待测atnf-yb3幼苗，分别测定待测WT幼苗和待测atnf-yb3幼苗的根长(图6中A和图6中B)。结果显示，待测WT幼苗的根长为3.2±0.52，待测atnf-yb3幼苗的根长为2.3±0.19，AtNF-YB3基因的突变抑制了拟南芥根长的正常生长。二、atnf-yb3突变体中转入SiNF-YB8基因1、atnf-yb3中转入SiNF-YB8基因将生长有atnf-yb3(处于开花期)的花盆倒扣在盛有实施例2步骤3步骤3.3的农杆菌侵染液的容器上方，使atnf-yb3的花器官浸泡在农杆菌侵染液中50s，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，室温培养24h，揭开塑料布，直立放置花盆，在25℃、16h光照/8h黑暗的光周期下进行培养，此时的植株即为T0代转基因植株，将转基因植株传代至T3代(每代均为自交)，得到T3代植株atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3/SiNF-YB8-2。按照实施例步骤一步骤3的3.1-3.8的方法，将C58C1-pBI121-SiNF-YB8替换为C58C1-pBI121，并将烟草W48替换为atnf-yb3，替他步骤不变，得到转空载体的转基因拟南芥，将其命名为空载体拟南芥。利用半定量PCR鉴定T3代植株atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3/SiNF-YB8-2中的SiNF-YB8基因的表达。对照为野生型拟南芥Col-0(WT)。引物对为：F:5′-ATGGGTCGCAAGGGAAAGCG-3′；R:5′-TCACATGTCTCCGGTGTAAC-3′；预期条带为639bp。内参为Actin，内参的引物为GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG和ACGACCTTAATCTTCATGCTGC。结果见图7中B，结果表明，编号为atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3/SiNF-YB8-2的T3代植株中均有SiNF-YB8基因的表达，即atnf-yb3中成功转入了SiNF-YB8基因。2、atnf-yb3atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3/SiNF-YB8-2的根长测定实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：分别在MS0培养基(在MS中加入琼脂得到的固体培养基)平板上放入无菌野生型拟南芥Col-0(WT)种子、步骤1的空载体拟南芥的无菌种子、步骤1的atnf-yb3/SiNF-YB8-1无菌种子和步骤1的atnf-yb3/SiNF-YB8-2无菌种子，然后在25℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养7天，分别得到WT幼苗、空载体幼苗、atnf-yb3/SiNF-YB8-1幼苗和atnf-yb3/SiNF-YB8-2幼苗。分别将WT幼苗、空载体幼苗、atnf-yb3/SiNF-YB8-1幼苗和atnf-yb3SiNF-YB8-2幼苗各3株移入MS0平板上，然后在25℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养7天，分别得到待测WT幼苗、待测空载体幼苗、待测atnf-yb3/SiNF-YB8-1幼苗和待测atnf-yb3/SiNF-YB8-2幼苗，分别测定待测WT幼苗、待测空载体幼苗、待测atnf-yb3/SiNF-YB8-1幼苗和待测atnf-yb3/SiNF-YB8-2幼苗的根长(图7中A和图7中C)。结果显示，待测WT幼苗的根长为3.2±0.52；待测空载体幼苗的根长为3.2±0.50，与待测WT幼苗的根长无显著差异；待测atnf-yb3/SiNF-YB8-1幼苗的根长为3.17±0.52，与待测WT幼苗的根长无显著差异；待测atnf-yb3atnf-yb3/SiNF-YB8-2幼苗的根长为3.18±0.52，与待测WT幼苗的根长无显著差异；表明SiNF-YB8基因恢复了AtNF-YB3突变引起的抑制拟南芥根长的正常生长的表型。三、atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3SiNF-YB8-2的抗逆性鉴定对步骤二中的atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3/SiNF-YB8-2转基因拟南芥及步骤一的atnf-yb3进行抗逆性(即抗旱性和耐渗透胁迫性)鉴定，用经PEG6000处理和甘露醇处理的幼苗的根长评判转基因植株的抗旱性和耐渗透胁迫性。实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：分别在MS0培养基(在MS中加入琼脂得到的固体培养基)平板上放入无菌Col-0(WT)种子、步骤一的空载体拟南芥的无菌种子、步骤二的无菌atnf-yb3/SiNF-YB8-1的种子、步骤二的无菌atnf-yb3/SiNF-YB8-2的种子和步骤一的无菌atnf-yb3的种子，然后在25℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养7天，分别得到WT幼苗、空载体幼苗、atnf-yb3/SiNF-YB8-1幼苗、atnf-yb3/SiNF-YB8-2幼苗和atnf-yb3幼苗。分别将WT幼苗、空载体幼苗、atnf-yb3/SiNF-YB8-1幼苗、atnf-yb3/SiNF-YB8-2幼苗和atnf-yb3幼苗各3株移入MS0平板上，然后在25℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养7天，分别得到待测WT幼苗、待测空载体幼苗、待测atnf-yb3/SiNF-YB8-1幼苗、待测atnf-yb3/SiNF-YB8-2幼苗和待测atnf-yb3幼苗，分别测定待测WT幼苗、待测空载体幼苗、待测atnf-yb3/SiNF-YB8-1幼苗、待测atnf-yb3/SiNF-YB8-2幼苗和待测atnf-yb3幼苗的根长(表4和图8)。按照上述方法，将MS0培养基平板替换为含有终浓度为6％的PEG6000的MS培养基平板(即PEG平板，该平板是在MS0培养基中加入PEG6000至PEG6000的质量含量为6％得到的固体培养基)，其他步骤均不变，分别得到待测PEG处理WT幼苗、待测PEG处理空载体幼苗、待测PEG处理atnf-yb3/SiNF-YB8-1幼苗、待测PEG处理atnf-yb3/SiNF-YB8-2幼苗和待测PEG处理atnf-yb3幼苗，分别测定待测PEG处理WT幼苗、待测PEG处理空载体幼苗、待测PEG处理atnf-yb3/SiNF-YB8-1幼苗、待测PEG处理atnf-yb3/SiNF-YB8-2幼苗和待测PEG处理atnf-yb3幼苗的根长(表4和图8)。表4、不同处理的转基因拟南芥幼苗根长(cm)WT空载体拟南芥atnf-yb3/SiNF-YB8-1atnf-yb3/SiNF-YB8-2atnf-yb3MS0平板3.2±0.222.3±0.313.17±0.343.18±0.332.3±0.20PEG平板2.5±0.141.8±0.122.34±0.132.5±0.151.8±0.11甘露醇平板3.5±0.131.8±0.153.38±0.113.5±0.121.8±0.12结果表明，atnf-yb3与空载体拟南芥在MS0平板、PEG平板和甘露醇平板上的根长没有显著产差异，atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3/SiNF-YB8-2的根长在MS0平板上分别是atnf-yb3的1.37倍、1.38倍；atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3/SiNF-YB8-2的根长在PEG平板上分别是atnf-yb3的1.30倍、1.31倍；atnf-yb3/SiNF-YB8-1和atnf-yb3/SiNF-YB8-2的根长在甘露醇平板上分别是atnf-yb3的1.8倍、1.94倍。表明，转SiNF-YB8基因的atnf-yb3的抗旱性和耐渗透胁迫性均显著提高。实施例4、SiNF-YB8的亚细胞定位一、重组载体的构建将16318hGFP的SalI和SmaI识别位点之间的序列替换为序列2的第1-639位核苷酸(SiNF-YB8的编码基因)，保持其他序列不变，得到重组载体16318hGFP-SiNF-YB8，16318hGFP-SiNF-YB8表达SiNF-YB8蛋白和GFP蛋白。二、SiNF-YB8的亚细胞定位1、材料准备：在9cm培养皿上铺一薄层MS培养基，将洋葱表皮撕下后内表面朝上平铺于MS培养基中心(洋葱表皮的直径在3cm范围内)，于25℃预培养4h。2、金粉的处理：2.1将100mg直径为1.0μM的金粉放入1.5ml离心管中，而后向该离心管中加入1ml无水乙醇，充分振荡3min，于12000rpm下离心1min，弃上清；2.2向该离心管中再加入1ml无菌水，重悬沉淀并充分混匀后，于12000rpm下离心；重复该步骤3次；2.3向该离心管中再加入1ml无菌水，混匀后得到金粉悬液，-20℃保存备用。3、制备微粒子弹：3.1将3μg步骤一的16318hGFP-SiNF-YB8加入6μl步骤2的金粉悬液(50mg/ml)中，而后向该混合液中分别加入0.1M的亚精胺水溶液4μl、2.5M的CaCl2水溶液6μl，然后振荡混匀3min，冰上静置15min；3.212000rpm离心10s(即转速达到12000rpm后离心10s)，弃上清；3.3加入140μl无水乙醇，粗振荡后(打散金粉)12000rpm离心10s，收集沉淀；3.420μl无水乙醇重悬步骤3.3的沉淀，得到金粉-质粒复合体。4、基因枪轰击受体材料：4.1选用一定压力的可裂膜(本实验用1100psi)，与轰击膜一起，在70％的酒精中浸泡1～2h，取出晾干；4.2金属挡板用酒精浸泡，在酒精灯上灭菌，基因枪的超净工作台用紫外线灭菌；4.3取20μl上述制备好的金粉-质粒复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置上，不要涂于整个膜上，大小与载体固定圈上的孔径范围一致，晾干，然后固定在载体固定圈上；4.4将上述载体固定圈安装到发射装置上；4.5将可裂膜安装到气体加速管下端；4.6将洋葱表皮培养皿放入真空室内，取下培养皿盖；4.7抽真空指针到26In/Hg；4.8放氦气于气体加速管，直到管中压力达到可裂膜所能承受的压力时，可裂膜破开；4.9气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属挡板挡住，而下面的金粉-质粒复合体却透过金属挡板的网孔射向靶细胞；4.10将轰击好的洋葱表皮细胞放入25℃培养箱中，暗培养16～24h后，得到转基因洋葱表皮。5、洋葱表皮细胞镜检：将步骤4的转基因洋葱表皮压片，然后在激光扫描共聚焦显微镜(Bio-RadMicroRadiance)(Laserscanningconfocalmicroscopy,LSMC)观察GFP(绿色荧光蛋白)荧光，并进行扫描照像(图9)。LSCM的工作参数为：Ex＝488nm,Em＝525±15nm，Power＝10％,Zoom7,中速扫描，Frame512×512。软件为TIME-COURSE和PHOTOSHOP5.0。按照上述步骤1-5的方法，将16318hGFP-SiNF-YB8替换为16318hGFP，其他步骤均不变，作为对照实验，结果如图9所示。结果显示，SiNF-YB8定位于细胞核，细胞膜以及细胞质中。