本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种通用型的枯草芽胞杆菌整合表达载体，特别适用于提高α-淀粉酶表达量的枯草芽胞杆菌整合表达载体。
背景技术：
枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilis）属于革兰氏阳性菌，是一种非致病性的重要工业微生物。其全基因组测序工作已经完成。人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于大肠杆菌。利用枯草芽胞杆菌表达外源蛋白具有诸多优点：（1）安全性高，可用于食品、药物等工业生产；（2）能直接将分泌蛋白释放到培养基中，利于分离纯化；（3）具有高效的分泌目的蛋白的能力，其分泌的真核来源的重组蛋白多数情况下依然能够保持天然构象和生物活性；（4）生长迅速，培养条件简单，遗传背景了解清晰，具有较好的工业生产基础。
α-淀粉酶（α-amylase，EC3.2.1.1），也称液化型淀粉酶，是以糖原或者淀粉为底物，从分子内部切开α-1，4糖苷键，产物为糊精，含四个以上葡萄糖残基的低聚糖及少量的葡萄糖和麦芽糖。长期以来，α-淀粉酶一直被广泛应用于包括淀粉液化、纺织物退浆、酿造及焙烤等领域。
利用野生型枯草芽胞杆菌表达系统生产α-淀粉酶通常产量很低，这是由于α-淀粉酶在蛋白转运与分泌过程中存在很多瓶颈，一方面当细胞中涉及蛋白转运的调控元件不能满足需求时，会造成α-淀粉酶在蛋白转运过程中不能及时的被转运到合适的细胞部位而被细胞内蛋白酶降解，另一方面细胞中涉及蛋白分泌的限制性因子缺乏时，影响α-淀粉酶在分泌过程中的正确折叠，从而造成α-淀粉酶在胞壁间被蛋白酶所降解。因此通过在枯草芽胞杆菌中增加涉及蛋白表达分泌的各种限制性调控因子，将有利于α-淀粉酶表达分泌量的提升。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种通用型的枯草芽胞杆菌基因组整合型表达载体，该载体通过将各种可能涉及外源蛋白表达分泌瓶颈的限制性因子通过同源重组整合到枯草芽胞杆菌染色体amyE基因上，能够大幅度提高外源蛋白尤其是α-淀粉酶的表达水平。
本发明的所述的质粒载体，包含有：
枯草芽胞杆菌的grac启动子序列，其核苷酸序列为SEQIDNO:1。
用于插入外源基因片段的多克隆位点MCS，其核苷酸序列为SEQIDNO:2。
用于整合amyE位点的基因5’和3’同源臂序列，其核苷酸序列分别为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。
本发明的载体，还包含有大肠杆菌复制子以及氯霉素抗性基因编码序列。
本发明的载体，其遗传图谱如图2所示，核苷酸序列为SEQIDNO:5。
本发明涉及的过表达调控元件PrsA，其核苷酸序列为SEQIDNO:6。
本发明中的具体实施例3中的质粒，其遗传图谱如图3所示，核苷酸序列为SEQIDNO:7。
本发明中的的具体实施例4中的各种调控元件SecA、SecDF、SecG、Ffh、SipU、SipV、SipW的核苷酸序列为SEQIDNO8-14。
本发明构建的整合载体用于在枯草芽胞杆菌（例如B.subtilis168，WB600，WB700，WB800，1A751，DB104等）中提高外源蛋白特别是α-淀粉酶的表达水平。
本发明构建的表达载体，能够通过同源重组的方式特异性整合到枯草芽胞杆菌染色体的amyE基因位置上，通过在细胞中过量表达各种可能涉及外源蛋白表达分泌瓶颈的限制性因子，提高外源蛋白尤其是α-淀粉酶在枯草芽胞杆菌中的转运水平或者促进蛋白的正确折叠，从而大幅度提高外源蛋白尤其是α-淀粉酶在培养基中的分泌水平。
附图说明：
图1：本发明的质粒载体pPgrac-MCS的构建示意图；
图2：本发明的质粒载体pPgrac-MCS的遗传图谱；
图3：实施例3中pPgrac-PrsA的遗传图谱；
图4：实施例3中的菌落PCR验证图；其中：M.TIANGENDNAMarkerⅢ；1.菌落PCR结果；2.阳性对照；
图5：实施例3中发酵液上清的SDS-PAGE电泳图：其中：M.PageRulerTMPrestainedProteinLadder；1.1A751发酵液上清；2.1A751（amyE::Pgrac-PrsA）发酵液上清；3.pMA5-AmyL(1A751)发酵液上清；
4.pMA5-AmyL(1A751(amyE::Pgrac-PrsA))发酵液上清。
具体实施方式
本发明的载体以pDL为出发质粒，在构建过程中，通过双酶切连接及点突变的方式引入枯草芽胞杆菌启动子grac序列及多克隆位点，对原有的bgaB序列进行替换。该载体能够通过同源重组的方式高效的整合到枯草芽胞杆菌染色体amyE位置上。整合后的枯草芽胞杆菌能够在细胞中过量表达各种可能涉及外源蛋白表达分泌瓶颈的限制性因子，从而提高外源蛋白在枯草芽胞杆菌中的分泌水平。
下面对本发明的载体构建过程及应用进行详细描述。
实施例1质粒载体pPgrac-MCS的构建。
第一步，在pDL（来源自BGSC，编号为ECE144）的多克隆位点EcoRI及BamHI中间引入枯草芽胞杆菌Pgrac启动子（包含groE启动子，lacO操纵子及gsiBCD核糖体结合位点序列）。
设计引物，其中黑色加粗字体部分为酶切位点：
Pgrac-F:5’-CCGGAATTCGAAAAGAATGATGTAAGC-3’（包含EcoRI酶切位点），
Pgrac-R:5’-CGCGGATCCTTCCTCCTTTAATTGG-3’（包含BamHI酶切位点）。
以pHT43为模板，利用上述引物进行PCR，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，反应体系为：
上游引物Pgrac-F（10μmol/L）2μL，
下游引物Pgrac-R（10μmol/L）2μL，
DNA模板1μL，
PrimeSTARMaxPremix(2×)10μL，
ddH2O5μL，
总体积20μL。
扩增条件为：98℃3min，1个循环；98℃10s，55℃15s，72℃5s，30个循环；最后一个循环为72℃4min。
PCR产物进行EcoRI和BamHI双酶切和回收，获得目的片段P1；对载体pDL进行EcoRI和BamHI双酶切，回收目的片段P2。P1同P2进行16℃过夜连接并转化大肠杆菌DH5α，获得质粒，命名为pDL-Pgrac。
第二步，在上述获得质粒pDL-Pgrac的载体基础上，通过点突变的方式引入多克隆位点，构建pPgrac-MCS整合载体。
设计引物，其中黑色加粗字体部分为酶切位点：
MCS-F:5’-GCCGCACTCGAGCGAGCTCCTGCACTGGATG-3’(5’端进行磷酸化修饰，包含XhoI，SacI酶切位点)，
MCS-R:5’-CGCAAGCTTGTCGAGGTACCTACGTAGGATCCTTCCTC-3’(5’端进行磷酸化修饰，包含HindIII，KpnI，BamHI酶切位点）。
以质粒pDL-Pgrac为模板，进行PCR，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，反应体系为：
上游引物MCS-F:（10μmol/L）2μL，
下游引物MCS-R:（10μmol/L）2μL，
DNA模板1μL，
PrimeSTARMaxPremix(2×)10μL，
ddH2O5μL，
总体积20μL。
扩增条件为：98℃3min，1个循环；98℃10s，55℃15s，72℃4min，30个循环；最后一个循环为72℃4min。
PCR产物利用DpnI进行37℃酶切3h用于消化模板质粒，反应体系如下：
PCR产物17μL，
DpnI（NEB）1μL，
10×Cutsmartbuffer2μL，
总体积20μL。
酶切后的目的片段进行回收，T4连接酶16℃过夜连接并转化大肠杆菌DH5α，获得质粒，测序正确的质粒命名为pPgrac-MCS。
实施例2构建质粒载体pPgrac-PrsA并将其整合到枯草芽胞杆菌染色体amyE上。
胞壁间分子伴侣PrsA（核苷酸序列为SEQIDNO:6）能够帮助α-淀粉酶快速正确折叠，减少α-淀粉酶在胞壁间被蛋白酶降解的机会，有可能促进α-淀粉酶表达分泌量的提升。利用本发明的载体对枯草芽胞杆菌中PrsA过表达情况下对α-淀粉酶的表达分泌的影响进行评价。
（一）构建质粒载体pPgrac-PrsA。
以pPgrac-MCS质粒为基础，构建pPgrac-PrsA整合载体。
设计引物，其中黑色加粗字体部分为酶切位点：
PrsA-F:5’-CGGGGTACCATGAAGAAAATCGCAATAGCAGCT-3’(包含KpnI酶切位点)，
PrsA-R:5’-TGAGAGCTCTTAGCATATTATGTTGCCAACTGT-3’(包含SacI酶切位点)，
以枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis168基因组为模板，进行PCR，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，反应体系为：
上游引物PrsA-F（10μmol/L）2μL，
下游引物PrsA-R（10μmol/L）2μL，
DNA模板1μL，
PrimeSTARMaxPremix(2×)10μL，
ddH2O5μL，
总体积20μL。
扩增条件为：98℃3min，1个循环；98℃10s，55℃15s，72℃1min，30个循环；最后一个循环为72℃4min。
PCR产物进行KpnI和SacI双酶切和回收，获得目的片段P3；对载体pDL-MCS进行KpnI和SacI双酶切，回收目的片段P4。P3同P4进行16℃过夜连接并转化大肠杆菌DH5α，获得质粒，命名为pPgrac-PrsA。
（二）pPgrac-PrsA整合到枯草芽胞杆菌染色体amyE上。
按下述方法制备枯草芽孢杆菌1A751（实验室保存）的感受态细胞：
1.挑取新鲜活化的1A751单菌落接入5mLGMI（10×Spizizen盐（(NH4)2S042g，K2HPO418.3g，KH2PO46g，柠檬酸钠1.2g，去离子水定容至100mL）0.5mL，2%酸水解酪素0.1mL，5%酵母提取物0.1mL，40%葡萄糖0.1mL，20%一水硫酸镁5μL，0.5%L-色氨酸50μL，无菌水补齐至5mL）培养基中，37℃200rpm震荡培养14-16h；
2.取上述500μL菌液转接到4.5mLGMI培养基中，37℃200rpm震荡培养4.5h；
3.取上述750μLGMI菌液接种于4.25mLGMII（其中5mLGMII包含10×Spizizen盐0.5mL，2%酸水解酪素50μL，40%葡萄糖0.1mL，20%一水硫酸镁40μL，无菌水补齐至5mL）培养液中，37℃240rpm震荡培养1.5h，制备感受态细胞。
取1μg质粒pPgrac-PrsA用PstI酶切线性化后，转化枯草芽胞杆菌1A751，利用含有氯霉素(25μg/mL）抗性的平板筛选阳性克隆，通过菌落PCR方法进行验证。
菌落PCR引物：
AmyE-PrsA-F:5’-GGAAGGATCCTACGTAGGT-3’
AmyE-PrsA-R:5’-ACTGTCGGAACGAGACTTC-3’
反应体系为
上游引物AmyE-PrsA-F（10μmol/L）2μL，
下游引物AmyE-PrsA-R（10μmol/L）2μL，
DNA模板1μL，
PrimeSTARMaxPremix(2×)10μL，
ddH2O5μL，
总体积20μL。
扩增条件为：98℃3min，1个循环；98℃10s，55℃15s，72℃1min，30个循环；最后一个循环为72℃4min。
PCR产物条带大小与预期一致（附图4），将菌落PCR产物送测序，测序结果显示Pgrac-PrsA已经整合到amyE基因内部，将构建好的菌株命名为1A751（amyE::Pgrac-PrsA）。
实施例3利用枯草芽胞杆菌1A751（amyE::Pgrac-PrsA）发酵生产α-淀粉酶。
将实验室已有的携带有地衣芽孢杆菌淀粉酶基因的质粒pMA5-AmyL（AmyL基因来源于地衣芽胞杆菌CICC10181）分别转化1A751和1A751(amyE::Pgrac-PrsA)，分别挑取一个转化子接种于2×SR培养基(3%蛋白胨，6%酵母提取物，0.6%K2HPO4)中，37℃培养过夜。第二天按照1%接种量接种于30mL2×SR培养基培养液中，37℃200rpm发酵培养48h，将发酵液4℃12000rpm离心10min，取上清液检测淀粉酶酶活，每个发酵样品设置两个平行，结果如表1所示。
α-淀粉酶酶活检测方法参照国标法（GBT24401-2009α-淀粉酶制剂检测方法）进行。
酶活力定义：在规定的条件下，1h液化1g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以“U/g（U/mL）”表示。测定方法如下：1．酶液制备：用缓冲液配制成酶溶液，使其最终酶浓度控制在65U/mL-70U/mL范围之内。2．测定：(1)吸取可溶性淀粉溶液（20g/L）20mL和磷酸缓冲液（相应pH6.0）5mL于试管中。在70℃恒温水浴中预热8min。(2)加入稀释好的待测酶液1.00mL，立即计时，摇匀，准确反应5min。(3)立即吸取1.00mL反应液移入预先装有0.5mL0.1mol/LHCl和5mL稀碘液的试管中摇匀。(4)以0.1mol/LHCl0.5mL和5mL稀碘液的混合液作空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定吸光度(A)。根据吸光度查表，求得测试酶液的浓度(C)。3．计算：X=C×N×16.67式中：X-样品的酶活力U/mL（U/g）；C-测试的酶液浓度U/mL；N-样品的稀释倍数；16.67-换算常数。所得结果表示至整数。
表1
由表1实验结果可知：pPgrac-PrsA该质粒整合到枯草芽胞杆菌1A751染色体amyE上后，α-淀粉酶的酶活有明显的提高。与正对照组（即野生型1A751）相比较，试验组摇瓶水平发酵后的酶活可以达到750U/mL，提高了2.42倍。
将发酵48h后的发酵液进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图4所示。
由图4电泳检测结果可知：试验组中发酵液上清中含有的α-淀粉酶的表达量要明显高于正对照组，即pPgrac-PrsA质粒整合到枯草芽胞杆菌1A751染色体amyE上后，对α-淀粉酶的分泌有明显的提高作用。
实施例4应用本发明的载体对SecA、SecDF、SecG、Ffh、SipU、SipV、SipW等在枯草芽胞杆菌细胞中的过量表达对α-淀粉酶的表达分泌的影响进行评价。
除具体实施例3中的胞壁间分子伴侣PrsA外，细胞中还存在很多可能涉及蛋白转运分泌过程中的限制性因子，具体包括以下几类，分别为（1）SRP（信号肽识别颗粒）系列：Ffh、HBsu、scRNA等；（2）信号肽酶系列：SipS、SipT、SipU、SipV、SipW等；（3）转运蛋白系列：SecA、SecYEG、SecDF等；（4）分子伴侣系列：GroES、GroEL、DnaK等。通过将各种可能涉及的调控元件因子构建到本发明的枯草芽胞杆菌整合载体上，整合到枯草芽胞杆菌1A751染色体上进行过表达。将实验室已有质粒pMA5-AmyL（AmyL基因来源于地衣芽胞杆菌CICC10181）转化各种构建好的枯草芽胞杆菌菌株，并发酵检测α-淀粉酶的酶活。部分调控元件（SecA、SecDF、SecG、Ffh、SipU、SipV、SipW等，其核苷酸序列为SEQIDNO:8-14）对该实施例中AmyL的表达分泌有不同程度的促进作用。
（一）质粒载体的构建。
以pPgrac-MCS质粒为基础，构建pPgrac-SecA、pPgrac-SecDF、pPgrac-SecG、pPgrac-Ffh、pPgrac-SipU、pPgrac-SipV、pPgrac-SipW整合载体。
选取合适的多克隆位点，设计引物，以枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis168基因组为模板，进行PCR，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，反应体系为：
上游引物（10μmol/L）2μL，
下游引物（10μmol/L）2μL，
DNA模板1μL，
PrimeSTARMaxPremix(2×)10μL，
ddH2O5μL，
总体积20μL。
扩增条件为：98℃3min，1个循环；98℃10s，55℃15s，72℃2kb/min，30个循环；最后一个循环为72℃4min。
PCR产物进行双酶切和回收，获得目的片段P5；对载体pPgrac-MCS进行相应酶切位点的双酶切，回收目的片段P6。P5同P6进行16℃过夜连接并转化大肠杆菌DH5α，获得质粒，分别命名为pPgrac-SecA、pPgrac-SecDF、pPgrac-SecG、pPgrac-Fth、pPgrac-SipU、pPgrac-SipV和pPgrac-SipW。
（二）上述构建好的质粒整合到枯草芽胞杆菌染色体amyE上。
按照具体实施例3中的制备方法制备枯草芽孢杆菌1A751感受态细胞。取1μg构建好的质粒选取合适的酶切位点进行单酶切后，转化枯草芽胞杆菌1A751，利用含有氯霉素(25μg/mL）抗性的平板筛选阳性克隆，设计引物，通过菌落PCR方法进行验证。将验证正确的菌落PCR产物送测序，经过验证正确的菌株分别命名为1A751（amyE::Pgrac-SecA）、1A751（amyE::Pgrac-SecDF）、1A751（amyE::Pgrac-SecG）、1A751（amyE::Pgrac-Ffh）、1A751（amyE::Pgrac-SipU）、1A751（amyE::Pgrac-SipV）和1A751（amyE::Pgrac-SipW）。
（三）利用本实施例中构建的枯草芽胞杆菌菌种发酵生产α-淀粉酶。
实验室已有质粒pMA5-AmyL（AmyL基因来源于地衣芽胞杆菌CICC10181）分别转化1A751和其他构建好的整合菌株，分别挑取一个转化子接种于2×SR培养基(3%蛋白胨，6%酵母提取物，0.6%K2HPO4)中，37℃培养过夜。第二天按照1%接种量接种于30mL2×SR培养液中，37℃200rpm发酵培养48h，将发酵液4℃12000rpm离心10min，取上清液检测淀粉酶酶活，结果如表2所示。
α-淀粉酶酶活检测方法参照：GBT24401-2009α-淀粉酶制剂检测方法。
具体方法参照具体实施例3中的方法。
表2
由表2实验结果可知：pPgrac-SecA、pPgrac-SecDF、pPgrac-SecG、pPgrac-Fth、pPgrac-SipU、pPgrac-SipV、pPgrac-SipW等质粒整合到枯草芽胞杆菌1A751染色体amyE上后，对α-淀粉酶的分泌均有一定的促进作用。与正对照组（即野生型1A751）相比较，摇瓶水平发酵后的酶活可以达到（287-345）U/mL，分别提高了0.2-0.5倍。
因此本发明构建的枯草芽胞杆菌整合型载体具有一定的通用性，可以通过选择合适的酶切位点，将各种可能涉及蛋白转运及表达分泌相关的限制性因子通过酶切连接的方式插入到该载体中，从而整合到枯草芽胞杆菌染色体amyE上，通过各种调控元件的过表达，促进外源蛋白特别是α-淀粉酶的表达分泌水平。
SEQUENCELISTING
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<212>DNA
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