本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物及其长循环脂质体，及其制备方法，以及在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
盐酸伊立替康(CPT-11)是一种半合成的可溶性喜树碱类衍生物，现已上市的剂型主要有注射液和冻干粉针，主要作用于细胞周期的S期，通过抑制拓扑异构酶Ⅰ，干扰DNA复制和细胞分裂，在临床作为一线药物与氟尿嘧啶、亚叶酸钙联合给药，用于治疗代谢性结肠或直肠癌患者，也可用于治疗经氟尿嘧啶治疗后无效或复发的代谢性结肠或直肠癌患者。本品单用或与其他药物联合用药也可用于小细胞肺癌、非小细胞肺癌、恶性脑瘤、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌等其他肿瘤的治疗。
7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)是CPT-11在体内的活性的代谢物，其对多种肿瘤细胞均有抑制作用，如结直肠癌、小细胞肺癌、淋巴癌、乳腺癌、食管癌、子宫癌、卵巢癌等。SN-38是优于CPT-11的高效抗肿瘤药物，体外细胞学实验表明，其对某些肿瘤细胞的效力大约是CPT-11的1000倍(Zhang J A,Xuan T,Parmar M,et al.Development and characterization of a novel liposome-based formulation of SN-38[J].International journal of pharmaceutics,2004,270(1):93-107)，而CPT-11进入体内转化为SN-38其转化效率低，仅为2-8％(Rowinsky E K,Grochow L B,Ettinger D S,et al.Phase I and pharmacological study of the novel topoisomerase I inhibitor CPT-11administered as a ninety-minute infusion every 3weeks[J].Cancer research,1994,54(2):427-436)。大量构效关系的研究证实SN-38闭合的内酯环结构是其发挥抗癌活性的有效成份，其内酯环结构在中性及碱性溶液中极不稳定，且在磷酸盐缓冲溶液和人体血液中主要以开环形式存在，不仅影响了其疗效，还增加了毒副作用。另外，闭环结构的SN-38在大部分生物相容和药剂学上可接受的溶剂中都很难溶解，成药性差，上述因素大大限制了其发展及临床应用。以下式1为SN-38的化学结构式；以下式2为SN-38在碱性条件下E环开环形成羧酸盐的结构式。
针对上述问题，国内外许多学者对SN-38进行结构修饰研究，以期解决上述问题。这些研究大多数采用水溶性的基团对SN-38进行修饰，如中国专利(申请)CN02112268.7(公开号为CN1465577A)、CN03117566.X(公开号为CN1534036A)、CN95190093.5(公开号为CN1123548A)、CN96106979.1(公开号为CN1145365A)、CN97180816.3(公开号为CN1241192A)、CN200710191520.5(公开号为CN101199857A)等都公开了一种喜树碱类似物衍生物，通过结构修饰增加了药物的水溶性，但是这些药物的水溶液普遍存在着体内稳定性差、闭环率低、无靶向作用等缺陷，从而导致疗效低，不良反应大等问题。其中中国专利CN02112268.7公开了一类喜树硷衍生物及制备方法，公开号为CN1465577A，该专利对喜树碱类化合物的10位和20位羟基采用羧酸酯或碳酸酯结构同时进行修饰，其目的在于提高喜树碱类化合物的水溶性，但是从该专利的
技术实现要素：
来看，不能得出相关化合物水溶性较修饰前化合物有提高的结论。目前上市的SN-38水溶性衍生物只有CPT-11，但是CPT-11存在着严重的不良反应，主要有迟发性腹泻、恶心、呕吐、中性粒细胞减少症、急性胆碱能综合征等(刘加葳,凌云华,陆益,等.盐酸伊立替康的不良反应及其预防处理[J].中国新药杂志,2007,16(17):1355‐1356)。
也有一部分学者采用脂溶性的基团对SN-38进行结构修饰，比如美国专利US20060229359公开了一种用天然维生素E对SN-38进行酯化的方法，结果显示修饰后的药物在维生素E中有很大的溶解性，该专利还将其制备成维E乳，但是研究表明维E乳药物给药系统存在一定的安全问题(张洪瑶.紫杉醇亚微乳注射液的研究[D].沈阳药科大学,2009)。例如美国Sonus药业的Tocosol紫杉醇维E乳会产生严重的毒副作用，主要表明为白细胞显著下降和较多的神经毒性，其III期临床研究已经宣布失败。目前也有用不饱和脂肪酸对SN-38进行酯化修饰，如Bo B.Lundberg等采用油酸进行修饰(Lundberg B B.Biologically active camptothecin derivatives for incorporation into liposome bilayers and lipid emulsions[J].Anti-cancer drug design,1998,13(5):453-461)；中国专利CN03818985.2公开了一种采用喜树碱衍生物与长链不饱和脂肪酸的共轭体的制备方法，公开号为CN1675219A，该专利虽然提到用长链不饱和脂肪酸修饰SN-38，但是该方法中要采用一种中间“衔接链”将SN-38与长链不饱和脂肪酸进行连接，而这种连接方式由于“衔接链”的存在，对于其合成的化合物相对于伊立替康而言是否能更加有效的转化为SN-38，该专利中并没有体现，并且由于中间“衔接链”的存在，其合成的化合物一定会在人体代谢过程中产生除长链不饱和脂肪酸与SN-38之外的其它物质，而这些“其它”物质是否对人体有害，专利中也没有进行说明，并且到目前为止也没有该合成方法合成的相关化合物用于临床研究，所以这种合成方法合成的化合物的有效性以及安全性值得商榷。同时上述两个专利都采用不饱和脂肪酸对SN-38进行修饰，但是不饱和脂肪酸容易氧化，稳定性差(王炜,张伟敏.单不饱和脂肪酸的功能特性[J].中国食物与营养,2005,4:44-46)，从而不利于制剂储存。中国专利申请CN200410017128.5公开了一种羟基喜树碱及其衍生物的碳酸酯前药及其制备方法，公开号为CN1673226A，该专利选取C1～30烷基、芳环、芳杂环、芳烷基、取代的芳环、取代的芳杂环、取代的芳烷基等各种不同的取代基对喜树碱进行修饰，该专利涉及到的化合物种类众多，但是都没有进行深入的研究。在上述的中国专利申请CN200410017128.5的实施例11中也涉及到了脂质体载药纳米粒子的制备，具体步骤为“将硬脂酸(12g)于80℃水浴上加热熔解后，加入羟基喜树碱-10，20-双硬脂酸(2g)，卵磷脂(10g)以及乙醇(10g)，轻度搅拌，形成透明微乳。然后将微乳分散到含有十二烷基硫酸钠的蒸馏水中(200ml)，再迅速冷却使脂质硬化，便得到固体脂质体载药纳米粒子，然后将药物粉碎加工成纳米混悬剂，适合于包括口服、注射等途径给药”，但是根据药剂学理论，按照上述方法制备得到的制剂是固体脂质纳米粒，并不是脂质体，有文献(侯冬枝，谢长生，朱长虹.固体脂质纳米粒的制备和载体结构的研究进展及其应用[J].中国医院药学杂志,2004,24(1):43-45)明确指出将药物溶解或分散在脂质熔融体中后，再将该熔融液分散到水相中，迅速冷却，该制备方法得到的是固体脂质纳米粒，而并不是上述专利所谓的脂质体。
实验研究表明抗肿瘤药物与白蛋白结合后，可以显著提高药物的抗肿瘤效果，例如纳米白蛋白结合型紫杉醇，具有肿瘤组织选择性和独特的转运机制，与溶液剂紫杉醇相比，肿瘤中紫杉醇药物的浓度增加33％(Desai N,Trieu V,Yao Z,et al.Increased antitumor activity,intratumor paclitaxel concentrations,and endothelial cell transport of cremophor-free,albumin-bound paclitaxel,ABI-007,compared with cremophor-based paclitaxel[J].Clinical cancer research,2006,12(4):1317-1324)。上述结果产生是因为药物与白蛋白结合后，可以利用肿瘤组织gp60受体与白蛋白结合，达到肿瘤主动靶向作用，以及利用药物白蛋白结合物纳米粒的EPR效应，达到肿瘤被动靶向作用，从而大大提高了药物的肿瘤分布，提高疗效、减小毒副作用(陈辰，何军，陆伟根，等.白蛋白作为注射用难溶性药物载体的研究进展[J].中国医药工业杂志，2010(1):51-54)。
因此，如何更有效提高SN-38衍生物的在体内碱性条件下的稳定性，提高其与白蛋白的结合能力，更有利于制备稳定的制剂形式，仍然是亟待需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一类饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物，本发明的另一目的是提供该类饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物的长循环脂质体，本发明的第三目的是提供该类饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物及其长循环脂质体在制备抗肿瘤药物中应用。
本发明为了克服现有技术缺陷，在SN-38基础上进一步尝试各种结构修饰，我们在对饱和脂肪酸修饰的SN-38进行深入的研究，惊喜的发现饱和长链脂肪酸(指的是其碳链上碳原子数大于12的脂肪酸)修饰后闭环形式的SN-38化合物与闭环形式的SN-38、CPT-11、及饱和短链、中链脂肪酸修饰后的SN-38化合物相比，其白蛋白结合大大增加。本发明合成出SN-38单饱和脂肪酸酯化合物，并将其制备成长循环脂质体制剂，该长循环脂质体具有提高药物抗肿瘤效果、增加药物稳定性、降低药物毒副作用等诸多优点。
本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供了一类饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物，其化合结构式如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，R表示C13、C15、C17的烷基，优选C15。
本发明的化合物为：
7-乙基-10-羟基喜树碱-10-肉豆蔻酸酯(SN-38-10-肉豆蔻酯)；
7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯(SN-38-10-棕榈酸酯)；
7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯(SN-38-10-硬脂酸酯)。
本发明同时合成的SN-38-10-丁酸酯、SN-38-10-辛酸酯、SN-38-10-月桂酸酯，这些化合物结合白蛋白的能力明显低于上述三个化合物，而这三个化合物中SN-38-10-肉豆蔻酯和SN-38-10-棕榈酸酯结合白蛋白的能力又明显高于SN-38-10-硬脂酸酯，特别是SN-38-10-棕榈酸酯，其结合白蛋白的能力最强。
本发明的第二方面，提供了上述的一类饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物的制备方法，该方法的合成路线是：
该方法包括以下步骤：
a.在反应容器中加入7-乙基-10-羟基喜树碱(式1化合物)，加入适量的有机溶剂溶解，然后加入缚酸剂，在冰浴条件下搅拌5～30分钟；
b.缓慢滴加饱和脂肪酰氯，冰浴条件下反应15～45分钟后，室温下反应4～24小时；
c.产物在重结晶溶剂中重结晶后得到目标化合物(Ⅰ)。
本发明提供的通式(Ⅰ)化合物的制备方法，所述的饱和脂肪酰氯为肉豆蔻酰氯、硬脂酰氯、棕榈酰氯中的一种。
本发明提供的通式(Ⅰ)化合物的制备方法，所述的有机溶剂为无水二氯甲烷、无水三氯甲烷、无水N,N-二甲基甲酰胺、无水N,N-二甲基乙酰胺中的一种或两种以上。
本发明提供的通式(Ⅰ)化合物的制备方法，所述的缚酸剂为N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、三乙胺、吡啶中的一种或两种以上。
本发明提供的通式(Ⅰ)化合物的制备方法，所述的7-乙基-10-羟基喜树碱与缚酸剂的摩尔比为1:1.2～2，优选1:1.2～1.5。
本发明提供的通式(Ⅰ)化合物的制备方法，所述的7-乙基-10-羟基喜树碱与酰氯的摩尔比为1:1.2～2，优选1:1.2～1.5。
本发明提供的通式(Ⅰ)化合物的制备方法，所述的重结晶溶剂为丙酮、乙酸乙酯、环己烷中的一种。
本发明的第三方面，提供了上述的一类饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物的长循环脂质体。
本发明提供了上述通式(Ⅰ)化合物的长循环脂质体，该脂质体冻干前由下列处方按照重量体积比配制而成：
本发明提供的上述通式(Ⅰ)化合物的长循环脂质体，冻干前其各种配方的百分含量均为重量体积比，例如克/毫升，千克/升等。
本发明提供的饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物长循环脂质体，所述的磷脂A为蛋黄磷脂、大豆磷脂或各种动物来源的磷脂、氢化蛋黄磷脂、氢化大豆磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂中的一种或两种以上。
本发明提供的饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物长循环脂质体，所述的磷脂B为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二肉豆蔻磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-聚己内酯、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯，聚乙二醇-聚乳酸中的一种或两种以上，优选聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
本发明提供的饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物长循环脂质体，所述磷脂B的聚乙二醇的分子量为1000～8000。
本发明提供的饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物长循环脂质体，所述的冻干保护剂为甘露醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖中的一种或两种以上。
本发明提供的饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物长循环脂质体，所述的pH调节剂为氢氧化钠、醋酸钠、醋酸、磷酸盐、碳酸盐、盐酸、柠檬酸、碳酸等中的一种或两种以上。
进一步地，本发明提供了优选的7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯长循环脂质体的处方，该脂质体冻干前由下列处方按照重量体积比配制而成：
本发明提供的优选的7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯长循环脂质体的处方，其中磷脂A为蛋黄磷脂(E PC S)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)中的一种或两种，磷脂B为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
本发明的第四方面，提供了上述的一类饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物的长循环脂质体的制备方法，该方法包括如下步骤：
a.取处方量冻干保护剂溶于适量注射用水中；
b.取处方量药物、磷脂A、磷脂B、胆固醇溶于有机溶媒中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有冻干保护剂的注射用水溶液水化干膜，水浴超声；
c.高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，调节pH至3～7，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；
d.转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
本发明提供的饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物长循环脂质体的制备方法，所述的有机溶媒为二氯甲烷或三氯甲烷中的一种或两种。
本发明的第五方面，提供了上述的一类饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物及其长循环脂质体在制备抗肿瘤药物中应用。
所述的肿瘤，优选为结肠癌、直肠癌、小细胞肺癌、淋巴癌、乳腺癌、食管癌、子宫癌、卵巢癌等。
本发明采用了饱和长链脂肪酸对SN-38进行化学修饰，并将其制备成长循环脂质体制剂。本发明具备以下优势：
(1)本发明采用的修饰基团为饱和长链脂肪酸，其性质稳定，不易氧化，利于药物的储存；
(2)本发明提供的SN-38单饱和脂肪酸酯化合物，其闭环形式与白蛋白的结合大大增强，药物与白蛋白结合后，可以利用肿瘤组织gp60受体与白蛋白结合，达到肿瘤主动靶向作用，以及利用药物白蛋白结合物纳米粒的EPR效应，达到肿瘤被动靶向作用，从而大大提高了药物的肿瘤分布，提高疗效、减小毒副作用；
(3)本发明提供的SN-38单饱和脂肪酸酯化合物长循环脂质体，能提高药物的稳定性。经实验证明，该长循环脂质体的内酯环稳定性大大提高，内酯环开环速度明显减慢，至12h其内酯环部分量仍大于95％，这进一步表明其内酯环受到了磷脂双分子层的保护，避免与水的环境之间接触，这为避免内酯环在体内开环，保持生物活性提供了可能；
(4)本发明提供的SN-38单饱和脂肪酸酯化合物长循环脂质体，能提高药物的抗肿瘤效果，体内药效学实验证明该制剂的抗肿瘤效果显著优于上市制剂盐酸伊立替康注射液，同时实验过程中未观察到明显的毒副作用，证明该制剂是一种安全、高效的药物制剂。
附图说明
图1为抗小鼠S180实体瘤的药效学图，其中表示Saline表示生理盐水；CPT-11Injection表示盐酸伊立替康注射液；Liposome表示本发明制备的7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯脂质体。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。
本发明SN-38购自成都兰贝植化科技有限公司；CPT-11购自江苏恒瑞医药股份有限公司。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯的制备
在反应容器中加1mmol的7-乙基-10-羟基喜树碱，加入0.2L无水三氯甲烷溶解，再加入1.2mmol的DIPEA，在冰浴条件下搅拌5分钟，缓慢滴加1.2mmol的棕榈酰氯，冰浴条件下继续反应15分钟，再在室温下反应4小时，反应物在丙酮里面重结晶，分离得到7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯620.12mg，收率98.37％。
该物质的1HNMR和MS(ESI)数据如下：
1HNMR(CDCl3,600MHz)δ:8.22(1H，d，J＝9.12Hz)，7.81(1H，d，J＝2.46Hz)，7.64(1H，s)，7.54(1H，dd，J＝9.12and J＝2.46Hz)，5.74(1H，d)，5.30(1H，d)，5.25(2H，s)，3.86(1H，s)，3.15(2H，q)，2.65(2H，t)，1.95-1.85(2H，m)，1.84-1.79(2H，m)，1.50-1.26(27H，m)，1.03(3H，t)，0.87(3H，t)。
MS(ESI-)m/z:629(M-H+)。
化学结构式如下：
实施例2：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯的制备
在反应容器中加1mmol的7-乙基-10-羟基喜树碱，加入1L无水二氯甲烷溶解，再加入2mmol的三乙胺，在冰浴条件下搅拌30分钟，缓慢滴加2mmol的棕榈酰氯，冰浴条件下继续反应45分钟，再在室温下反应24小时，反应物在乙酸乙酯里面进行重结晶，分离得到7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯621.33mg，收率98.56％。
实施例3：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯的制备
在反应容器中加1mmol的7-乙基-10-羟基喜树碱，加入0.5L无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，再加入1.5mmol的DMAP，在冰浴条件下搅拌15分钟，缓慢滴加1.5mmol的棕榈酰氯，冰浴条件下继续反应20分钟，再在室温下反应8小时，反应物在环己烷中进行重结晶，分离得到7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯610.28mg，收率96.81％。
实施例4：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-肉豆蔻酸酯的制备
在反应容器中加1mmol的7-乙基-10-羟基喜树碱，加入0.7L的无水二氯甲烷与N,N-二甲基乙酰胺的混合溶剂溶解，再加入1mmol的DMAP和0.2mmol的DIPEA，在冰浴条件下搅拌20分钟，缓慢滴加1.2mmol的肉豆蔻酰氯，冰浴条件下继续反应30分钟，再在室温下反应12小时。反应物在丙酮中重结晶，分离得到7-乙基-10-羟基喜树碱-10-肉豆蔻酸酯590.17mg，收率97.98％。
该物质的1HNMR和MS(ESI)数据如下：
1HNMR(CDCl3,600MHz)δ:8.22(1H，d，J＝9.14Hz)，7.80(1H，d，J＝2.46Hz)，7.63(1H，s)，7.56(1H，dd，J＝9.14and 2.46Hz)，5.74(1H，d)，5.30(1H，d)，5.25(2H，s)，3.80(1H，s)，3.16(2H，q)，2.65(2H，t)，1.95-1.85(2H，m)，1.84-1.79(2H，m)，1.52-1.27(23H，m)，1.02(3H，t)，0.87(3H，t)。
MS(ESI-)m/z:601(M-H+)。
化学结构式如下：
实施例5：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-肉豆蔻酸酯的制备
在反应容器中加1mmol的7-乙基-10-羟基喜树碱，加入0.7L无水二氯甲烷溶解，再加入1.5mmol的吡啶，在冰浴条件下搅拌20分钟，缓慢滴加1.5mmol的肉豆蔻酰氯，冰浴条件下继续反应30分钟，再在室温下反应12小时，反应物在环己烷中重结晶，分离得到7-乙基-10-羟基喜树碱-10-肉豆蔻酸酯588.36mg，收率97.68％。
实施例6：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯的制备
在反应容器中加1mmol的7-乙基-10-羟基喜树碱，加入0.7L无水二氯甲烷溶解，再加入1.5mmol的吡啶，在冰浴条件下搅拌20分钟，缓慢滴加1.5mmol的硬脂酰氯，冰浴条件下继续反应30分钟，再在室温下反应12小时，反应物在丙酮中重结晶，分离得到7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯650.16mg，收率98.75％。
该物质的1HNMR和MS(ESI)数据如下：
1HNMR(CDCl3,600MHz)δ:8.22(1H，d，J＝9.18Hz)，7.79(1H，d，J＝2.46Hz)，7.65(1H，s)，7.52(1H，dd，J＝9.18and 2.46Hz)，5.74(1H，d)，5.30(1H，t)，5.25(2H，s)，3.97(1H，s)，3.14(2H，q)，2.65(2H，t)，1.95-1.85(2H，m)，1.84-1.79(2H，m)，1.48-1.25(31H，m)，1.02(3H，t)，0.87(3H，t)。
MS(ESI-)m/z:657(M-H+)。
化学结构式如下：
实施例7：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯的制备
在反应容器中加1mmol的7-乙基-10-羟基喜树碱，加入0.5L无水N,N-二甲基乙酰胺溶解，再加入1.2mmol的DIPEA，在冰浴条件下搅拌20分钟，缓慢滴加1.2mmol的硬脂酰氯，冰浴条件下继续反应30分钟，再在室温下反应10小时，反应物在环己烷中重结晶，分离得到7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯645.21mg，收率98.00％。
实施例8：闭环形式的药物与人血清白蛋白结合常数的测定
取实施例1、5、6制备的7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、7-乙基-10-羟基喜树碱-10-肉豆蔻酸酯、7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯作为实验化合物。参考实施例1所述的制备方法，制备7-乙基-10-羟基喜树碱-10-丁酸酯、7-乙基-10-羟基喜树碱-10-辛酸酯、7-乙基-10-羟基喜树碱-10-月桂酸酯。
实验原理(Ziomkowska B,Cyrankiewicz M,Wybranowski T,et al.Determination of the Protein Binding Properties of Camptothecins by Means of Optical Spectroscopy Methods[J].Acta Physica Polonica,A.,2014,125)
结合常数K根据下列公式(1)计算,
K＝Fb/(FfL) (1)
式中为Ff未与白蛋白结合的药物质量分数；Fb为与白蛋白结合的药物质量分数；L为人血清白蛋白的总浓度。
因为Ff+Fb＝1，所以1/Fb＝1+1/KL，1/Fb与1/K呈线性相关，因此结合常数K可以通过回归方程计算出来。
实验方法
分别将适量的SN-38，CPT-11，SN-38-10-丁酸酯、SN-38-10-辛酸酯、SN-38-10-月桂酸酯(参考实施例1，将棕榈酰氯分别替换为丁酸酰氯、辛酸酰氯、月桂酸酰氯即可)、SN-38-10-肉豆蔻酯，SN-38-10-棕榈酸酯、SN-38-10-硬脂酸酯溶解在乙腈后，再分别加入到一系列不同浓度的人血清白蛋白(HSA)的PBS溶液(pH7.4)中，样品涡旋15s，在37℃下孵育12小时。再将孵育液摇匀后一分为二，取一半于超滤离心管中，12000r/min离心10min，超滤液用高效液相色谱法进样检测，测定以闭环形式未与白蛋白结合的药物浓度。另一半孵育液加入适量的甲醇沉淀蛋白，测定溶液中所有的保持闭环形式的药物浓度。具体实验结果见表1。
表1几种喜树碱类化合物(闭环形式)与人血清白蛋白结合常数
实验结果表明饱和长链脂肪酸修饰后的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物，其以闭环形式与白蛋白的结合大大增加，显著优于闭环形式的SN-38、CPT-11、以及饱和短链、中链脂肪酸修饰后的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物，在三种饱和长链脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱化合物，其中SN38-10-肉豆蔻酸酯与SN38-10-棕榈酸酯与白蛋白的结合较强。
实施例9：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、E 80、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量甘露醇和蔗糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用氢氧化钠和盐酸调节pH至3.0，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例10：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、E PC S、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇溶于三氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量乳糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用磷酸氢二钠和盐酸调节pH至7.0，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例11：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、E PC S、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇溶于二氯甲烷和三氯甲烷的混合溶剂中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量甘露糖和蔗糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸和碳酸钠调节pH至5.5，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例12：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、PC-98T、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量海藻糖和蔗糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用醋酸和醋酸钠调节pH至5.0，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例13：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、PC-98T、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇8000、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇8000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量甘露醇和蔗糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸和碳酸调节pH至5.0，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例14：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、E 80、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇溶于二氯甲烷和三氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量甘露醇和蔗糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸调节pH至3.0，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例15：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、E PC S、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量甘露醇和蔗糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸和醋酸钠调节pH至4.5，过孔径0.22μm的微孔滤膜，加注射用水至全量，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例16：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、PL-100M、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量海藻糖和麦芽糖的注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸调节pH至4.5，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例17：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、DSPC、E PC-3、聚乙二醇-聚己内酯、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量海藻糖和麦芽糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用醋酸和醋酸钠调节pH至4.5，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例18：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、S 100、S PC-3、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量葡萄糖和乳糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸调节pH至3.5，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例19：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、DMPC、HSPC、聚乙二醇-聚乳酸、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量葡萄糖和乳糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸调节pH至3.5，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例20：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、E PC S、DPPC、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量葡萄糖和乳糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用氢氧化钠和盐酸调节pH至4.5，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例21：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、DPPC、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量葡萄糖和乳糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸调节pH至4.5，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例22：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量葡萄糖和乳糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸调节pH至4.5，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例23：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯、鞘磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量葡萄糖和乳糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸调节pH至4.5，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例24：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-肉豆蔻酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-肉豆蔻酸酯、E 80、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量甘露醇和蔗糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸调节pH至5.0，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例25：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-肉豆蔻酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-肉豆蔻酸酯、PC-98T、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量葡萄糖和乳糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸调节pH至4.5，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例26：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-肉豆蔻酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-肉豆蔻酸酯、E PC S、DMPC、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量甘露醇和蔗糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸调节pH至5.0，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例27：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯、DMPC、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量甘露醇和蔗糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用醋酸和醋酸钠调节pH至7.0，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例28：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯、E PC S、DSPC、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量甘露醇和蔗糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用醋酸和醋酸钠调节pH至5.5，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例29：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯长循环脂质体的制备
处方：
制备工艺：
取处方量7-乙基-10-羟基喜树碱-10-硬脂酸酯、E PC S、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇溶于二氯甲烷中，40～45℃真空旋转拉膜，用含有处方量葡萄糖和乳糖的适量注射用水溶液水化干膜，水浴超声；高压均质机在10000～15000psi压力下均质三次，用柠檬酸调节pH至4.5，加注射用水至全量，过孔径0.22μm的微孔滤膜，然后分装到西林瓶中；转移至冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例30：长循环脂质体对药物稳定性的影响
取实施例11制备的7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体作为实验制剂，市售盐酸伊立替康注射液(规格：100mg，江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号14021915)作为对比制剂，进行稳定性研究。
在含有4％人血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH7.4)中加入适量的盐酸伊立替康和7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯脂质体，在37℃下孵育，分别于0h(质量分数视为100％)，0.5h，1h，4h，8h，12h取样，用高效液相分别测定不同时间药物的闭环形式的浓度，将0h时刻药物闭环形式的质量分数设为100％，其它时间点闭环形式药物浓度与0h时刻药物闭环形式浓度相比，可以得到药物的闭环形式随着时间的变化。结果见表2。
表2药物不同时间的内酯环百分率
实验结果表明7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体的内酯环稳定性大大提高，内酯环开环速度明显减慢，至12h其内酯环部分量仍大于95％。这进一步表明其内酯环受到了磷脂双分子层的保护，避免与水的环境之间接触，这为避免内酯环在体内开环，保持生物活性提供了可能。
实施例31：7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体对S180荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用研究
取实施例11制备的7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体作为实验制剂，市售盐酸伊立替康注射液(规格：100mg，江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号14021915)作为对比制剂，进行抗肿瘤药效学研究。
S180腹水型细胞的培养与接种
将S180细胞株培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，培养细胞至对数生长期，1000r/min离心，用不含血清的培养基适量稀释，调整细胞浓度至1×10^6/ml。一次性注射液器抽取适量混悬液无菌条件下于5只昆明种小鼠腹腔内注射，0.2ml/只，10天后S180腹水型荷瘤小鼠模型制备成功，成功率100％，腹水生成齐性好，未见血性腹水。
昆明种小鼠移植S180肉瘤模型的建立与给药
无菌条件下取已制备好的5只S180腹水型荷瘤小鼠腹水，用生理盐水适量稀释，调整细胞浓度至1×10^6/ml，于小鼠右侧腋窝皮下注射S180细胞悬液，每只0.2ml。24h后称重，随机分为3组，生理盐水组，盐酸伊立替康注射液组，7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯脂质体组。于接种后24h给药，生理盐水组给与0.2ml生理盐水，盐酸伊立替康注射液组与7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯脂质体组给药剂量为15mg/kg，隔两天给一次药，共给药3次。停药次日处死小鼠，称取小鼠体重，剥离瘤体称重，计算给药后体重变化及抑瘤率(计算方法见公式(2)、结果见表3)。
抑瘤率＝(C—T)/C×100％ 公式(2)
式中C为实验组平均瘤重；T为阴性对照组平均瘤重。
表37-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯长循环脂质体对S180荷瘤小鼠的影响
实验结果表明7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯脂质体与盐酸伊立替康注射液组小鼠体重随时间而增长，实验过程中老鼠未见死亡，也没有观察到明显毒副反应，在相同剂量下脂质体组的抑瘤率显著高于注射液组(P＜0.001)。本实验说明7-乙基-10-羟基喜树碱-10-棕榈酸酯脂质体无明显毒性并且其对肿瘤的抑制作用高于已上市的盐酸伊立替康注射液。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。