生产油脂成分的方法及高级不饱和脂肪酸的制造方法与流程

本发明涉及作为燃料、化学品原料等而有用的油脂成分的生产方法，尤其涉及特征在于用阶段性地增加盐浓度的培养基培养耐盐性的藻类的油脂成分的生产方法。
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：光合作用生物是利用光能来固定CO2的生物的总称，特别是，藻类是只要培养条件良好就具有高的光合作用效率的光合作用生物中的一种。藻类的工业化培养进行了半个世纪以上，有其作为工业原料、燃料、饲料及精细化工原料以及作为健康食品的需求，可认为在今后藻类生产在工业中也会占有重要的位置。在藻类的培养过程中，通过固定CO2的工序能够生产各种有用的碳成分，因此一直以来进行了对藻类的培养以及通过培养来生产各种碳成分的研究。由于担心今后会出现化石燃料的枯竭，因此越来越有必要进行替代燃料的早期探索，而且由于需求者的健康意识的提高，对有利于维持/提高健康的功能性化学品的需求增加，对藻类的产生有用的成分的关注在日益增长。以往，作为使用藻类的碳成分的制造方法、例如作为燃料、化学品原料等而有用的乙醇的制造，专利文献1中记载有：在海水的盐分浓度下生长并在细胞内蓄积淀粉并且通过保持在黑暗且厌氧的环境中由细胞内的淀粉产生乙醇的属于衣藻属的微藻类Chlamydomonassp.MT-JE-SH-1。作为解决上述课题的手段，记载了如下方法：(1)在海水的盐分浓度下生长并在细胞内蓄积淀粉，保持在黑暗且厌氧的环境中，从而由细胞内的淀粉产生乙醇的属于衣藻属的微藻类Chlamydomonassp.MT-JE-SH-1；以及(2)在海水的盐分浓度下对属于衣藻属的微藻类Chlamydomonassp.MT-JE-SH-1进行培养并使淀粉蓄积在细胞内之后，一边将含有培养的藻体的浆料pH保持为6.0～9.0的范围，一边保持在黑暗且厌氧的环境中来生成乙醇。另外，作为油脂成分的制造方法，专利文献2中记载了如下方法：培养属于网黏菌科网黏菌属(LabyrinthulaceaeLabyrinthulagenus.)的4,7,10,13,16‐二十二碳五烯酸的产生菌L59株(FERMP-18987)的微生物，使作为构成脂肪酸含有4,7,10,13,16‐二十二碳五烯酸的油脂蓄积在菌体中，之后分离菌体，利用溶剂从分离后的菌体中抽提前述油脂后，对该抽提物进行水解。非专利文献1中记载了：对使用了海生藻类的油脂产生与培养时的盐浓度的关系进行了研究，盐浓度在初始浓度超过1.5M的情况下，可抑制藻类的生长，在为0.5～1.0M时，以高含有率生成油脂。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特许第3837589号公报专利文献2：日本特许第4081794号公报非专利文献非专利文献1：生物科学和生物工程杂志(ジャーナルオブバイオサイエンスアンドバイオエンジニアリング)，101卷，223-226页(2006年)(JournalofBioscienceandBioengineering,Vol101,223-226(2006))技术实现要素：发明要解决的问题以上
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中，虽然藻类产生有用的碳成分，但大多生产效率低，不能充分地满足需求人的需要，期望提供使用了生产效率高的藻类的生产有用碳成分的方法。因此，鉴于上述
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，本发明的课题在于提供使用了藻类的高效率生产有用碳成分的方法。用于解决问题的方案本发明人等为了上述课题，对藻类的培养方法详细地进行了研究，从而解决了课题。即，本发明通过提供下面记载的生产油脂成分的方法，从而解决了上述课题。[1]一种生产油脂成分的方法，其特征在于，用阶段性地增加盐浓度的培养基培养耐盐性藻类。[2]根据[1]所述的生产油脂成分的方法，其中，用阶段性地各增加0.5％～5％盐浓度的培养基进行培养。[3]根据[1]或[2]所述的生产油脂成分的方法，其中，用每天阶段性地各增加0.5％～2％盐浓度的培养基进行培养。[4]根据[1]～[3]中任一项所述的生产油脂成分的方法，其中，培养基中的第1阶段的盐浓度为0.5～5质量％的范围。[5]根据[1]～[4]中任一项所述的生产油脂成分的方法，其中，在氮含量低的条件下进行培养。[6]根据[1]～[5]中任一项所述的生产油脂成分的方法，其中，在220nm的波长下测定所述培养基中的硝酸盐含量的情况下，该含量为10mg/L以下时，增加第2阶段的盐浓度。[7]根据[1]～[6]中任一项所述的生产油脂成分的方法，其中，所述耐盐性藻类为衣藻(Chlamydomonas)属的藻类。[8]根据[1]～[7]中任一项所述的生产油脂成分的方法，其中，所述耐盐性藻类为衣藻种JSC4株(Chlamydomonassp.JSC4)。[9]根据[1]～[8]中任一项所述的生产油脂成分的方法，其中，所述培养基为含有海水、浓缩海水或人工海水的培养基。[10]一种高级不饱和脂肪酸的制造方法，其特征在于，对通过[1]～[9]中任一项所述的生产油脂成分的方法得到的油脂成分进行水解。[11]根据[10]所述的高级不饱和脂肪酸的制造方法，其中，所述高级不饱和脂肪酸为油酸或亚麻酸。发明的效果根据本发明能够提供可以高效率生产使用了藻类的有用碳成分的方法。附图说明图1是衣藻种JSC4株的营养型细胞(在适宜的生长环境、丰富的营养条件下旺盛地增殖的状态的细胞)的显微镜照片。图2是近缘的衣藻种的18SrDNA序列的比较。图3是近缘的衣藻种的18SrDNA序列的比较。图4是近缘的衣藻种的18SrDNA序列的比较。图5是表示OD220nm与硝酸盐浓度的关系的标准曲线。图6是在氮充分条件以及氮缺陷条件下培养的衣藻种JSC4株(Chlamydomonassp.JSC4)的脂肪酸的组成分析的结果。图7是以不同的海盐浓度培养的衣藻种JSC4株的CO2固定化能力的分析结果。图8是以不同的海盐浓度培养的衣藻种JSC4株的CO2固定化能力的分析结果。图9是以不同的海盐浓度培养的衣藻种JSC4株的CO2固定化能力的分析结果。图10是以不同的海盐浓度培养的衣藻种JSC4株的CO2固定化能力的分析结果。图11是表示以2阶段培养法培养衣藻种JSC4株而得到的生物质浓度、油脂含量随时间经过的分布图的结果。图12是表示以2阶段培养法培养衣藻种JSC4株而得到的生物质浓度、油脂含量随时间经过的分布图的结果。图13是表示以2阶段培养法培养衣藻种JSC4株而得到的生物质浓度、油脂含量随时间经过的分布图的结果。图14是表示以2阶段培养法培养衣藻种JSC4株而得到的生物质浓度、油脂含量、油脂产生速度、CO2固定化速度随时间经过的分布图的结果。图15是表示以梯度法培养衣藻种JSC4株而得到的生物质浓度、油脂含量随时间经过的分布图的结果。图16是表示以梯度法培养衣藻种JSC4株而得到的生物质浓度、油脂含量随时间经过的分布图的结果。图17是表示以梯度法培养衣藻种JSC4株而得到的生物质浓度、油脂含量随时间经过的分布图的结果。图18是表示以梯度法培养衣藻种JSC4株而得到的生物质浓度、油脂含量、油脂产生速度、CO2固定化速度随时间经过的分布图的结果。图19是以各种方法培养的衣藻种JSC4株(Chlamydomonassp.JSC4)的脂肪酸的组成分析的结果。图20是表示以分批处理法培养淡水小球藻NIES-2168株(ChlorellasorokinianaNIES-2168)而得到的生物质浓度、油脂含量随时间经过的分布图的结果。图21是表示以梯度法培养淡水小球藻NIES-2168株(ChlorellasorokinianaNIES-2168)而得到的生物质浓度、油脂含量随时间经过的分布图的结果。具体实施方式[耐盐性藻类]本发明中使用的藻类只要是耐盐性的藻类就没有特别限制，可以举出衣藻(Chlamydomonas)属的藻类、小球藻(Chlorella)属的藻类、杜氏藻(Dunaliella)属的藻类、微拟球藻(Nannochloropsis)属的藻类、丛粒藻(Botryococcus)属的藻类、角毛藻(Chaetoceros)属的藻类、绿球藻(Chlorococcum)、眼虫(Euglena)属的藻类、红球藻(Haematococcus)属的藻类、等鞭金藻(Isochrysis)属的藻类、舟形藻(Navicula)属的藻类、新绿藻(Neochloris)属的藻类、紫球藻(Porphyridium)属的藻类、定鞭金藻(Prymnesium)属的藻类、栅列藻(Scenedesmus)属的藻类、螺旋藻(Spirulina)属的藻类、水绵(Spirogyra)属的藻类、聚球藻(Synechococcus)属的藻类、扁藻(Tetraselmis)属的藻类，优选衣藻(Chlamydomonas)属的藻类、小球藻(Chlorella)属的藻类、杜氏藻(Dunaliella)属的藻类、微拟球藻(Nannochloropsis)属的藻类。衣藻是由属于绿藻纲衣藻目(或团藻目)的单细胞的鞭毛虫组成的属。多数衣藻是淡水产的，但也有海生的。海生的衣藻(Chlamydomonas)属的藻类是指能够在海中、淡咸水中以及在包含海盐的培养基中生长的衣藻(Chlamydomonas)属的藻类。作为衣藻(Chlamydomonas)属的藻类，可以举出莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)等。作为小球藻(Chlorella)属的藻类，可以举出普通小球藻(Chlorellavulgaris)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、淡水小球藻(Chlorellasorokiniana)，优选淡水小球藻(Chlorellasorokiniana)。作为淡水小球藻(Chlorellasorokiniana)，可以举出淡水小球藻(Chlorellasorokiniana)NIES-2168株。作为杜氏藻(Dunaliella)属的藻类，可以举出双眼杜氏藻(Dunaliellabioculata)、盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)、杜氏盐藻(Dunaliellatertiolecta)。作为盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)，可以举出盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)NIES-2168株。作为双眼杜氏藻(Dunaliellabioculata)，可以举出双眼杜氏藻(Dunaliellabioculata)NIES-2253株。作为杜氏盐藻(Dunaliellatertiolecta)，可以举出杜氏盐藻(Dunaliellatertiolecta)NIES-2258株。作为微拟球藻(Nannochloropsis)属的藻类，可以举出眼点拟微绿球藻(Nannochloropsisoculata)。作为眼点拟微绿球藻(Nannochloropsisoculata)，可以举出眼点拟微绿球藻(Nannochloropsisoculata)NIES-2146株。进而，为了解决上述课题，本发明人等对以高效率产生目标油脂成分的藻类进行了探索，发现特别优选衣藻种JSC4株(Chlamydomonassp.JSC4)。[衣藻种JSC4株]本发明中使用的衣藻种JSC4株(Chlamydomonassp.JSC4)的分离纯化通过以下步骤进行。即，通过常规方法从在台湾中西部海岸采集的淡咸水样品仅离析出1个细胞，进行无菌操作。使用下面所示组成的HSM琼脂培养基，通过在20℃、8～15μmol光子(photons)/m2/秒、12小时光期、12小时暗期的光条件下进行培养该细胞，每两周进行1次传代培养来建立藻株，通过形态观察等鉴定为衣藻属的绿藻，并命名为JSC4株。[表1]成分mg/LNH4Cl500MgSO4·7H2O20CaCl2·2H2O10K2HPO41，440KH2PO4720Na2EDTA50ZnSO4·7H2O22H3BO311.4MnCl2·4H2O5.1CoCl2·6H2O1.6CuSO4·5H2O1.6(NH4)6Mo7O24·4H2O1.1FeSO4·7H2O5KOH16琼脂15gpH(用KOH调节)7.0衣藻种JSC4株的藻类学性质如下所述。将衣藻种JSC4株的营养型细胞(在适宜的生长环境、丰富的营养条件下旺盛地增殖状态的细胞)的显微镜照片示于图1。(形态性质)(1)营养型细胞为椭圆形，大小约为10μm。营养型细胞具有两根与细胞长度约等倍的鞭毛。营养型细胞具有运动性。(2)营养型细胞的外围被细胞壁包围，内部存在一个核、叶绿体，此外还可以看到线粒体、高尔基体、液胞、油滴等。叶绿体内的基底部具有蛋白核(pyrenoid)。(生殖方式)(1)在营养细胞内形成有二～八个内生孢子，均匀地分布于细胞内。内生孢子在该细胞内具有一个核、叶绿体。(2)也进行通过二分裂的增殖。(生理/生化性状)(1)培养液：能够在海水中、淡咸水中和含有海盐的培养液中生长。(2)光合能力：能够进行利用光合作用的光合自养生长。(3)含有色素：叶绿素a、叶绿素b、以及其它的类胡萝卜素类。(4)同化贮藏物质：淀粉。(5)生长温度区域：15℃～35℃(最适温度25℃)。(6)生长pH区域：pH6.0～10.0(最适pH为7.0)。由上述内容可知，衣藻种JSC4株根据形态观察及其他被确定为衣藻属的绿藻。将衣藻种JSC4株的18SrDNA基因的碱基序列示于序列表的序列号1。图2～图4是对近缘的衣藻种的18SrDNA序列进行比较的图。阴影(shaded)为衣藻种JSC4株的分子标记序列。衣藻种JSC4株的最近缘种为德巴衣藻(Chlamydomonasdebaryana)，但若着眼于分子标记序列，则并非为相同物种。如此，从比较18SrDNA序列的，将衣藻种JSC4株判断为新型的微藻类株。衣藻种JSC4株在2014年3月5日被保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(千叶县木更津市上总镰足2-5-8)，根据布达佩斯条约的规定，以保藏号FERMBP-22266进行了国际保藏。[培养基]本发明中使用的培养基只要是可使耐盐性藻类生长的条件就没有限制，但含有海水、浓缩海水或人工海水的培养基由于可提高产油脂能力，因此特别优选为包含海盐的培养基。例如，作为这样的培养基，特别优选使用改良Bold3N培养基。作为其它可使用的培养基，举出改良Basal培养基、改良Bristol培养基、BG-11培养基、改良HSM培养基等，但考虑到能够以高效率产生油脂成分，特别优选改良Bold3N培养基。作为本发明中使用的培养的特征，可以举出氮含量低的条件下的培养。氮含量低的条件下的培养可以是伴随增殖的氮消耗引起的氮缺陷状态下的培养，也可以是通过将藻体移植到氮含量低的培养基等的培养。本发明中，培养基中所含氮含量可以通过在220nm的波长下测定培养基中所含硝酸盐的含量来评价。培养基中所含氮含量不限于该方法，例如可以通过用利用离子传感器、利用显色试剂的吸光度测定等对硝酸盐、铵盐的含量进行测定来评价。测定方法是对1999年由Collos等人报告的方法进行改良而进行的(文献：应用藻类学杂志(ジャーナルオブアプライドファイコロジー)，11卷，179-184页(1999年)(JournalofAppliedPhycology,Volume11,P179-184(1999))。详细的测定方法记载于下述实施例。以下记载了本发明中使用的改良Bold3N培养基的组成。[表2]成分NaNO3K2HPO4MgSO4·7H2OKH2PO4NaClCaCl2·2H2OFeCl3·6H2ONa2·EDTA·2H2OZnSO4·7H2OCoSO4·7H2OMnSO4·5H2ONa2MoO4·2H2ONa2SeO3NiCl2·6H2O海盐(海盐)本发明发现，阶段性地增加培养基中的盐浓度(占培养基整体的质量％)会大大地影响产油脂成分的能力。因此，例如，通过在上述培养基中阶段性地添加规定浓度的海盐，能够提高油脂成分的产生效率。作为本发明中可使用的海盐，可以举出公知惯用的海盐。本发明中使用的海盐可将海水蒸发干燥而得到，也可以使用海水、海水的浓缩液，但为了调节培养基中所含浓度，更优选使用海水的固体成分形式的海盐。另外，也可以使用人工海水。本发明中使用的人工海水是模拟海水的组成而人工调节而成的粉末、浓缩液，在需要海水的生物的饲养、培养中，出于获得性、重现性、廉价性等理由来替代天然海水。可以使用市售的人工海水，市售的人工海水将氯化钠作为主要成分，含有各种无机盐类、pH调节剂等，根据用途用自来水、蒸馏水稀释而成为近似于海水的成分。此外，可以使用即使不为上述海盐等也可以用作适合本发明的目的的培养基的盐。(盐浓度的逐步控制)本发明发现，盐浓度的逐步控制会大大影响油脂产生效率。实施例中如后述那样可以明确，若在高盐浓度下培养藻类，则虽然会受到增殖阻碍，但油脂的含量会增加。因此，为了增加油脂的产生量，优选在低盐浓度下培养藻类，增加为规定的细胞数之后，增加培养基中的盐浓度，在高盐浓度下培养藻类，从而增加细胞中的油脂的含量。本发明中，将开始培养耐盐性藻类时所使用的培养基中的盐浓度称为“第1阶段的盐浓度”。仅增加1次培养基中的盐浓度时，集菌时的培养基中的盐浓度为“第2阶段的盐浓度”。在多阶段增加盐浓度来培养时，例如将培养基中的盐浓度增加N-1次(N表示3以上的整数)时，集菌时的培养基中的盐浓度为“第N步的盐浓度”。从提高藻类的增殖效率的观点出发，培养基中的第1阶段的盐浓度优选为0.5～5质量％的范围，更优选为0.5～3质量％的范围，进一步优选为0.5～2质量％的范围。第1阶段的培养期会因所使用的耐盐性藻类的增殖速度而不同，但优选1天～3天。如上述那样，为了增加油脂的含量，优选在氮含量低的条件下进行培养。氮含量低的条件下的培养可以是伴随增殖的氮消耗引起的氮缺陷状态下的培养，也可以是利用将藻体移植到氮含量低的培养基等的培养。若在氮含量低的条件下培养藻类，则从受到增殖阻碍的观点出发，为了增加油脂的产生量，优选在氮含量充分的条件下培养藻类，增加到规定的细胞数之后，在氮含量低的条件下培养来增加细胞中的油脂的含量。除了盐浓度的控制以外，通过控制氮含量，可以进一步增加油脂产生效率。从这样的观点出发，在220nm的波长下，测定前述培养基中的硝酸盐含量时，该含量为10mg/L以下时，优选增加第2阶段的盐浓度。在产生本发明的油性成分的方法中，优选使用阶段性地各增加0.5％～5％盐浓度的培养基培养耐盐性藻类。作为盐浓度的逐步控制方法，可以举出将培养基中的盐浓度仅增加1次的“2阶段培养法”和将培养基中的盐浓度增加N-1次(N表示3以上的整数)的“多阶段培养法(也称为梯度法)”。需要说明的是，本发明中，将盐浓度恒定的培养方法称为分批处理法。(2阶段培养法)在2阶段培养法中，增加的盐浓度优选为0.5％～5％，更优选为1％～5％。第2阶段的培养期会因所使用的耐盐性藻类的增殖速度而不同，但优选3天～8天。(多阶段培养法)多阶段培养法中，每阶段增加的盐浓度优选为0.5％～2％，更优选为0.5％～1.5％。每阶段增加的盐浓度虽然各自不同，但从易于培养的观点出发，优选为相同。同样地，各步中的培养期虽然也可以各不相同，但优选相同。各步中的培养期优选1天～3天，更优选1天。阶段数(上述N)优选为3～8，更优选为4～6。第2阶段～第N阶段的总培养期会因所使用的耐盐性藻类的增殖速度而不同，但优选3天～8天，更优选4天～6天。需要说明的是，在设想藻类的大量培养时，虽然使用海水会有便利性，但使用氯化钠也会对油脂产生具有同样的效果，可以优选使用。(培养方法)本发明中，耐盐性藻类的培养方法可以用公知惯用的方法来进行。关于培养，本发明中可以使用前述培养基。作为用于本发明的培养方法，也可以使用静置培养法，但考虑到藻类的藻体产生性和油脂成分的产生性，则优选利用振荡培养法或深部通气搅拌培养法的培养。振荡培养可以是往返振荡，也可以是旋转振荡。作为培养温度，通常可在15～40℃下进行藻体产生。如上述那样用上述培养方法来培养耐盐性藻类时，能够得到不仅显示出稳定的增殖而且油脂成分的比例充分高的耐盐性藻类。另外，光条件只要是可进行光合作用的条件就没有特别限制，优选为连续光照。培养结束后，作为得到粗油脂的方法的自培养液的藻体的回收可通过属于常规方法的离心分离法、利用滤纸和玻璃过滤器的过滤法等来进行。如此操作而回收的藻体可以保持原样，或者利用冷冻干燥法、热风干燥法等来制成干燥藻体。可从得到的藻体或其干燥藻体抽提油脂成分。本发明中，通常优选供给二氧化碳气体来进行。作为二氧化碳气体的供给法，可用公知惯用的方法来进行，例如可以通过向培养液中通气来适宜地进行二氧化碳气体的供给。本发明中产生的油脂成分的特征在于，其为甘油三酯。甘油三酯为甘油的酰化产物，通过进行烷基酯化，可以期待将其用作生物柴油燃料。本发明中，可作为甘油三酯举出的化合物为甘油与脂肪酸的酯化产物，脂肪酸为碳数10～30的高级饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。另外，本发明还提供作为生物柴油燃料而有用的高级不饱和脂肪酸的制造方法。即，通过对本发明的方法中得到的油脂成分进行水解，能够制造燃烧效率高的高级不饱和脂肪酸。作为燃烧效率高的高级不饱和脂肪酸，可以举出油酸或亚麻酸，由于燃烧效率特别高，因此特别优选油酸。对用于产生上述高级不饱和脂肪酸而言最适宜的海盐浓度进行了研究，结果可以举出优选为0.5～5质量％、特别优选为2.0～5质量％的范围。(油脂的抽提方法)作为从藻体抽提油脂成分的方法，可以使用通常的油脂的抽提方法，尤其可以使用以Folch法、Bligh-Dyer法为代表的利用氯仿/甲醇系等的有机溶剂的常规的抽提方法，对其没有限制。实施例下面，举出实施例进一步详细说明本发明，但本发明不限于这些实施例。(培养液中的藻浓度的测定)将取自光生物反应器的液体样品用预先精密地秤量好的0.45μm孔径的过滤器进行过滤，对其进行冷冻干燥直至成为恒重并精密地秤量。将过滤前后的过滤器质量的差除以经过过滤的液体样品量，确定了藻浓度。(培养液中的氮含量的测定)将取自光生物反应器的液体样品用0.22μm孔径的过滤器进行过滤，用蒸馏水稀释至20倍。使用UV/VIS分光光度计通过在220nm(OD220)的波长下的光学浓度来确定硝酸盐含量。即，使用图5所示OD220与硝酸盐含量的标准曲线将OD220的值换算为硝酸盐浓度。(藻体中的油脂成分的分析)将冷冻干燥的藻体15mg量取到装有0.5g的直径0.5mm的玻璃珠微量瓶中，向其中加入1mL的0.5M浓度KOH溶液，用珠磨器式均质器粉碎处理40分钟。一边用7mL的0.5M浓度KOH溶液进行润洗，一边将处理液转移至50mL容积的耐热玻璃瓶中进行密封，在水浴中、100℃下处理15分钟。冷却至室温之后，加入8mL的0.7M浓度的HCl甲醇溶液和10mL的14％(v/v)的三氟化硼甲醇溶液(Sigma-AldrichCorporation)，再次在水浴中、100℃下处理15分钟。冷却至室温之后，加入4mL的饱和盐水和3mL的正己烷，用涡流混合器搅拌5分钟。将经过搅拌的液体移至50mL容积的塑料离心管中，并以7000rpm离心分离2分钟。取上清液100μL至微量离心管(Eppendorf)，加入890μL的正己烷和10μL的内标物质(十五烷酸甲酯，SIGMACorporation)，之后以10000rpm离心分离3分钟，用GCMS分析装置对上清液进行分析。在GCMS分析装置(GCMS-QP2010Plus，岛津制作所)中安装DB-23毛细色谱管柱(0.25mmφ×60m，0.15μm膜厚，AgilentTechnologiesInc.)，以2.3mL/分钟流通氦气。将喷射器、离子源以及接口的温度分别设定为230℃、230℃以及250℃，柱温在样品注入后1分钟保持为50℃之后，以25℃/分钟升温至175℃，进而以4℃/分钟升温至230℃之后，保持5分钟。注入上述上清液1μL，以分流比5：1进行柱分离，以50～500m/z的全扫描模式检测脂肪酸甲脂的各成分，以内标的添加量作为基准进行定量并将其作为油脂量。(CO2固定化能力的分析)使用生物质的浓度(g/L)随时间经过的分布图，计算出对应于干燥藻体单位重量的时间曲线的增殖率。生物质的产生速度(Pbiomass；mg/L/天)通过下式求出。[数学式1]Pbiomass＝ΔX/Δt式中，ΔX表示培养时间Δt(d)中的生物质的浓度(mg/L)的变化量。进而，CO2固定化速度(PCO2；mg/L/天)可由以下式来求出。[数学式2]PCO2(mg/L/天)＝1.88×Pbiomass作为藻类的生物质的典型的分子式，使用CO0.48H1.83N0.11P0.01。CO2固定化率(％)由以下式来求出。[数学式3]100×(CCO2，influent-CCO2，effluent)/CCO2，influent式中，CCO2,influent和CCO2,effluent分别表示CO2的流入浓度和流出浓度。(参考例1)(培养基的比较)将表3所示组成的改良Basal培养基、改良Bristol培养基、BG-11培养基、改良Bold3N培养基、改良HSM(HighSaltmedium)培养基制备各1升，分别投入到体积1升的光生物反应器中，用高压釜进行灭菌。在各光生物反应器中以藻浓度为约100mg/L的方式接种衣藻种JSC4株(Chlamydomonassp.JSC4)，以室温下、连续照射24小时200μmol光子/m2/秒的强度的荧光灯光、以50mL/分钟通气含有2％二氧化碳气体的空气、用搅拌器以200rpm进行搅拌，在上述条件下培养5.7天。表4中示出对分析各培养液的油脂成分的结果。藻体中的油脂含量、单位培养液的油脂产生速度均是改良Bold3N培养基的最高。[表3][表4](参考例2)(海盐的添加效果(分批处理法))将表3所示组成的改良Bold3N培养基的海盐添加量设为0.5％、2％、3.5％、以及5％(w/v)的培养基各制备1升，分别投入到体积1升的光生物反应器中，用高压釜进行灭菌。在各个光生物反应器中以藻浓度为约100mg/L的方式接种衣藻种JSC4株(Chlamydomonassp.JSC4)，以室温下、连续照射24小时200μmol光子/m2/秒的强度的荧光灯光、以50mL/分钟通气含有2％二氧化碳气体的空气、用搅拌器以200rpm搅拌，在上述的条件下培养10天。本发明中，将盐浓度恒定的培养方法称为分批处理法。在藻体的增殖的同时，培养液中的硝酸盐含量均出现了降低，1.9或2.7天后成为10mg/L以下。其后，藻体中的油脂含量和油脂产生速度显著地增加。尤其，以2％、3.5％、以及5％添加量添加海盐时，藻体中的油脂含量达到50％以上的高含量，最大的油脂产生速度非常高，达到140mg/L/天以上。[表5](参考例3)(在氮缺陷条件下的培养对生物柴油的品质带来的效果)生物柴油的品质可用不饱和脂肪酸相对于饱和脂肪酸的比例进行评价。生物柴油中的饱和脂肪酸的含量会影响高温下的氧化抑制。另一方面，不饱和脂肪酸含量会影响低温下的流动性。对用于赋予生物柴油低温下和高温下的良好的特性而言，重要的是，生物柴油中的饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸是等量的。脂肪酸特征会受到由培养基中的营养成分、外部气温、以及光强度产生的环境压力的影响。这些压力中，氮缺陷条件是影响藻类的脂肪代谢的最重要的因素。将氮充分条件下以及氮缺陷条件下培养的衣藻种JSC4株(Chlamydomonassp.JSC4)的脂肪酸的组成示于图6。图6中，作为对照，对来自大豆油的脂肪酸的组成进行了比较。衣藻种JSC4株的培养条件与参考例2相同。如图6所示可以确认，在氮缺陷条件下，衣藻种JSC4株中的脂肪的蓄积存在油酸(C18：1)增加的倾向且存在亚麻酸(C18：3)减少的倾向。根据生物柴油的特性，通过以高比例含有油酸，具备更良好的氧化稳定性和低外部气温下的合适的冷滤点(CFPP)。进而，根据欧洲生物燃料标准(EN14214)，亚麻酸(C18：3)的含量被限定为最大12％(m/m)。因此，可以确认，通过衣藻种JSC4株产生的油脂用于制造生物燃料具有合适的品质。进而，如图6所示的那样，与来自大豆油的脂肪酸的组成相比，衣藻种JSC4株显示出高饱和脂肪酸含量和低的多元不饱和脂肪酸(n≥2)含量。通常，油脂中富含的饱和脂肪酸会使生物燃料具有优异的流动性和密度。另一方面，多元不饱和脂肪酸的低含量不仅会增加低户外气温下的氧化稳定性而且会赋予合适的冷滤点。因此，从油脂具有合适的脂肪酸的特征的观点出发，可以确认衣藻种JSC4株对于生物燃料的制造而言是合适的。(参考例4)(海盐和氮源的控制也对衣藻种JSC4株的CO2固定化带来效果)以一定的时间间隔对不同的海盐浓度下培养的衣藻种JSC4株的CO2固定化能进行调查。将结果示于图7～图10。如图7～图10所示的那样，不同的海盐浓度中的CO2固定化率和CO2固定化速度随着时间经过显示出相同的倾向。即，显示出培养2-3天后达到最高值之后逐渐减少的锥体型曲线。图7～图10中，在海盐的添加量为2％的条件下可以得到CO2固定化率和CO2固定化速度的最大值，分别为54.9％和1319.0mg/L/天。由该优异的CO2固定化能力可以确认，衣藻种JSC4株是对于使用了工业气体的CO2固定实用的株。(实施例1)(对用于促进衣藻种JSC4株的油脂蓄积的2阶段培养法的研究)为了进一步改善藻体中的油脂含量和油脂产生速度，尝试2阶段培养法。首先，使用含有2％海盐的改良Bold3N培养基进行约2天的第1阶段的培养。接着，在95％以上的氮源枯竭之后，将培养基分别替换为含有3％、5％、以及7％的海盐的氮源限制培养基，进行第2阶段的培养。如图11～图14所示的那样，从分别替换为含有3％、5％、以及7％的海盐的氮源限制培养基之日起进行7天的第2阶段的培养之后的衣藻种JSC4株的油脂含量分别为56％、61％、以及58％。这些油脂含量为在第1阶段的培养后得到的油脂含量约15％的大约4倍。其中，用含有5％的海盐培养基进行7天第2阶段的培养时，随着海盐浓度的上升，油脂含量也显著地上升，油脂含量为61.2％。另外，用含有3％海盐的培养基进行3天第2阶段的培养时，油脂产生速度为183.9mg/L/天。可以确认2阶段培养法会显著地促进衣藻种JSC4株的油脂含量，其油脂含量高于用分批处理法得到的油脂含量。(实施例2)(用多阶段添加海盐的培养基培养的衣藻种JSC4株中的细胞增殖和油脂蓄积的效果的研究)在含有高浓度的海盐的培养基中的衣藻种JSC4株的培养虽然会促进油脂含量，但存在导致增殖率降低的风险。为了实现高油脂产生速度，优选减少由盐浓度的压力引起的增殖阻碍。于是，尝试了梯度法。首先，使用含有2％海盐的改良Bold3N培养基进行了约2天的培养。接着，在95％以上的氮源枯竭之后，将培养液中的盐浓度分别每天阶段性地各增加0.5％、1.0％以及1.5％来培养5天。将结果示于图15～图18。如图15～图18所示可以确认，通过阶段性地添加海盐来进行培养，即使不显著地阻碍细胞增殖也能够迅速地增加油脂含量。尤其可在少量的海盐的供给群中明显地确认该效果。例如，每天阶段性地各增加0.5％来培养时，可以得到223.2mg/L/天的最大油脂产生速度和59.4％的油脂含量。用梯度法得到的油脂产生速度高于用分批处理法(158.9mg/L/天)、2阶段培养法(183.9mg/L/天)得到的油脂产生速度。另外，将用梯度法得到的脂肪酸的组成示于图19。图19中，Batch表示通过分批处理法得到的脂肪酸的组成，Two-stage表示通过2阶段培养法得到的脂肪酸的组成，Salinity-gradient表示通过梯度法得到的脂肪酸的组成。如图19所示的那样，用梯度法得到的脂肪酸组合物以饱和脂肪酸和一价不饱和脂肪酸为主。可以确认，该脂肪酸组合物具有对用于制造生物燃料而言合适的品质。(实施例3)(对于用阶段性地添加海盐的培养基培养的淡水小球藻NIES-2168株(ChlorellasorokinianaNIES-2168)中的细胞增殖和油脂蓄积的效果的研究)使用淡水小球藻NIES-2168株(ChlorellasorokinianaNIES-2168)来研究梯度法在其它的海洋微藻类中是同样有效的。首先，使用含有2％海盐的改良Bold3N培养基进行约2天的培养。接着，在95％以上的氮源枯竭之后，将培养液中的盐浓度每天以0.5％阶段性地增加来进行培养。将结果示于图21。作为对照，还利用将培养液中的盐浓度固定为2％的分批处理法来进行了培养。将结果示于图20。如图21所示的那样，淡水小球藻NIES-2168株的油脂产生速度由缺乏氮源的培养第2天的139.6mg/L/天被显著地促进至197.8mg/L/天。由该结果可以确认，梯度法在其它的海洋性微藻类中也是同样有效的。以上说明的各实施方式中的各方案和它们的组合等为一个例子，可在不脱离本发明的主旨的范围内进行方案的附加、省略、置换及其它的变更。另外，本发明不限于各实施方式，仅限于权利要求(claim)的范围。产业上的可利用性根据本发明能够以高效率产生使用了藻类的有用碳成分。PCT/RO/134表当前第1页1 2 3