本发明涉及疾病生物标志领域。在一个方面，本发明涉及使用这样的生物标志检测或诊断受试者中的结核病的方法。
发明背景
由于过度拥挤、基础设施差和高HIV感染率，结核病在发展中国家是一个主要的公共健康问题[1]。减少TB传播的主要障碍之一为缺乏在初级卫生诊所中使用的准确诊断检验，所述诊所预见（see）大多数TB患者(60%)，但不能提供实验室-确认的TB诊断[2]。在没有及时和准确的诊断的情况下，传播以每名患者每年15个密切接触者的速率发生[3]。
当前的TB诊断检验需要检测痰样品中的细菌。然而，这在灵敏度和特异性中显示相当大的变化，特别是对于HIV-阳性受试者，因为不产生痰或痰含菌少。当前的金标准诊断检验，痰培养，耗时、昂贵，易于污染并且需要基础设施。新的基于分子的检验例如GeneXpert?在设备齐全的实验室中提供TB和利福平抗性的快检测，但昂贵，需要基础设施并且在涂片-阴性(包括儿童和HIV-阳性)受试者中灵敏度不足。
对于TB诊断而言，基于微流体的快速检验(侧流检验)具有很大前景。它们易于使用、便宜、在数分钟内提供答案、不需要专门设备并且室温稳定；这使其对于在高-TB负担、资源匮乏的环境中使用很理想。侧流检验检测体液样品中的标志；尿和血液为最常用的。然而，迄今为止，由于缺乏与标志和/或样品类型相关的灵敏度，尚未开发出这样的用于TB的检验。
当前基于血液的IFN-γ释放测定(IGRAs)的低灵敏度[4]可能是由于在活性的TB期间TB-特异性细胞从血液迁移至肺，因为与同一受试者的血液相比胸膜液中存在显著更高水平的细胞和可溶性宿主免疫标志[5]。在不考虑HIV状态的情况下，分析导致对TB和或其它呼吸系统疾病的96%正确分类[5]。此外，分析不需要抗原-刺激，刚离体时存在高水平的标志。Mtb抗原根据感染阶段而大幅度变化，这提示抗原-不依赖的检验会增加特异性。
尽管微生物学信赖将痰样品收集物用于TB诊断，但尚未评估可溶部分(即宿主生物标志)的诊断潜能，如对于其它呼吸系统疾病例如哮喘[6]、囊性纤维化[7]和慢性阻塞性肺病(COPD)[7]所见到的。
因此仍存在对改进的用于检测受试者中的结核病的方法的需求。具体地，需要准确但快速、便宜但适合在护理点(即在非-实验室环境中)使用的方法。
发明概述
因此，本发明提供用于检测受试者中的结核病的方法，包括(a)测定从受试者获得的痰样品中的一种或多种宿主免疫系统生物标志的水平；和(b)比较痰样品中的生物标志水平与一个或多个参考值；其中与参考值相比的痰样品中的生物标志水平指示受试者中结核病的存在或不存在。
在一个实施方案中，所述生物标志包括可溶蛋白。例如，所述生物标志可包括一种或多种细胞因子、趋化因子和/或生长因子。
在一个实施方案中，所述生物标志包括一种或多种Th2细胞因子。优选地与参考值相比降低的Th2细胞因子水平指示受试者中存在结核病。在一个实施方案中，Th2细胞因子包括白细胞介素-10(IL-10)和/或白细胞介素-13(IL-13)。
在另一个实施方案中，所述生物标志包括选自白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)、白细胞介素-15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和血管内皮生长因子(VEGF)的一种或多种细胞因子。优选地与参考值相比降低的IL-1Ra、IL-15、G-CSF和/或VEGF水平指示受试者中存在结核病。
在另一个实施方案中，所述生物标志包括成纤维细胞生长因子(FGF)。优选地与参考值相比增加的FGF水平指示受试者中存在结核病。
在另一个实施方案中，所述生物标志进一步包括一种或多种Th1细胞因子。优选地与参考值相比降低的Th1细胞因子水平指示受试者中存在结核病。在一个实施方案中，所述Th1细胞因子包括IFN-γ。
在另一个实施方案中，所述生物标志选自IL-1Ra、IL-10、IL-13、IL-15、FGF、G-CSF、VEGF和IFN-γ。优选地所述生物标志包括IL-13、FGF和/或IFN-γ。
在一个实施方案中，受试者疑似患有肺病(或呼吸系统病症)，并且受试者显示选自慢性咳嗽、胸痛和发烧的一种或多种症状。优选地与参考值相比的痰样品中的生物标志水平指示受试者是否患有结核病或另一种呼吸系统疾病(例如肺炎、哮喘或慢性阻塞性肺病)，即所述生物标志水平允许在受试者中区分结核病与其它呼吸系统疾病(例如肺炎、哮喘或慢性阻塞性肺病)。
在一个实施方案中，参考值包括来自未患结核病的受试者的痰样品中的生物标志水平。因此痰样品中的生物标志水平优选与对照样品中的相应生物标志水平(对于每一具体的生物标志)比较。在一个实施方案中，对照样品可包括患其它肺病(或呼吸系统病症)例如肺炎的受试者。
在一个实施方案中，生物标志水平通过免疫测定检测(例如，使用抗体或其片段检测每一生物标志)。优选地生物标志水平使用ELISA测定检测。在一个实施方案中，检测使用侧流免疫测定进行。在另一个实施方案中，生物标志水平使用多重细胞因子测定，例如，使用LuminexTM微球体检测。
在进一步的方面，本发明提供用于治疗疑似患有肺病的受试者的方法，包括(a)通过如上所定义的方法测定来自受试者的痰样品中的生物标志水平是否指示受试者中存在或不存在结核病；和(b)若痰样品中的生物标志水平指示存在结核病，针对结核病对受试者进行治疗。
在一个实施方案中，针对结核病的治疗包括给予受试者治疗有效量的抗-结核病剂。优选地所述治疗包括给予受试者异烟肼、利福平、乙胺丁醇和/或吡嗪酰胺。在另一个优选的实施方案中，针对结核病的治疗给予至少2个月、至少4个月或至少6个月。
在另一个实施方案中，若痰样品中的生物标志水平指示不存在结核病，所述方法包括针对不同的呼吸系统病况，例如肺炎、哮喘或慢性阻塞性肺病对受试者进行治疗。例如对肺炎的治疗可包括给予受试者阿莫西林、多西环素、克拉霉素、阿奇霉素和/或红霉素。
在进一步的方面，本发明提供用于检测受试者中的结核病的侧流免疫测定装置，其中所述装置包含适于检测从受试者获得的痰样品中的一种或多种宿主免疫系统生物标志的一种或多种试剂。
在一个实施方案中，所述装置包含与一种或多种宿主免疫系统生物标志特异性结合的一种或多种抗体。优选地，所述抗体与一种或多种细胞因子、趋化因子和/或生长因子结合。更优选地所述抗体与IL-1Ra、IL-10、IL-13、IL-15、FGF、G-CSF、VEGF和IFN-γ中的一种或多种特异性结合。最优选地所述抗体与IL-13、FGF和/或IFN-γ结合。
在一个实施方案中，所述装置包含标记抗体(例如用可检测的标志部分，例如荧光标记或放射性标记，标记的抗体)和固定抗体(例如固定在固相上的抗体)。优选地所述标记和固定抗体各自结合生物标志上的不同表位，即使得抗体不竞争结合生物标志。因此所述标记和固定抗体通常能够同时与生物标志结合。
优选地所述固定抗体固定在色谱载体材料上。色谱载体材料通常为，例如允许痰样品的流体组分迁移的，毛细管活性材料。
在一个优选的实施方案中，所述装置为测试条或浸渍片形式，例如色谱测试条。在一个实施方案中，样品与测试条接触可允许样品中的液体向固定抗体迁移。在一些实施方案中，标记抗体沉积在色谱载体材料上，并优选在向测试条加入样品之后也向固定抗体迁移。在一个优选的实施方案中，标记抗体与生物标志形成复合体，该复合体被色谱条检验区的固定抗体捕获。受试者中结核病的存在优选通过在将装置与痰样品接触后装置检验区的可见信号(例如颜色变化)指示。
在进一步的方面，本发明提供如上所述的侧流免疫测定装置用于检测受试者中的结核病的用途。
附图简述
图1：患者人口统计数据。TB=结核病；not-TB=其它呼吸系统疾病；WBA=全血测定；COPD=慢性阻塞性肺病；RTI=呼吸道感染(不明确的)；IQR=四分位数间距（interquartilerange）。
图2：无抗原刺激孵育24小时之后的细胞因子水平(Nil对照)。孵育24小时之后20名TB和26名非-TB(其它呼吸系统病症)的细胞因子水平分析。框指示四分位数间距；线指示中位数；棒指示5-95%范围并且点指示异常值。使用Mann-WhitneyU-检验比较TB和非-TB来分析数据。P-值≤0.035被认为显著并标明。
图3：用PPD孵育24小时之后的细胞因子水平。用PPD孵育24小时之后20名TB和26名非-TB(其它呼吸系统病症)的细胞因子水平分析。框指示四分位数间距；线指示中位数；棒指示5-95%范围并且点指示异常值。使用Mann-WhitneyU-检验比较TB和非-TB来分析数据。P-值≤0.035被认为显著并标明。
图4：离体血清和唾液中的细胞因子水平。A：来自20名TB(灰色)和42名非-TB(白色)受试者的离体唾液的分析。B：来自25名TB(灰色)和52名非-TB(白色)受试者的离体血清的分析。框指示四分位数间距；线指示中位数；棒指示5-95%范围并且点指示异常值。使用Mann-WhitneyU-检验比较TB和非-TB来分析数据。P-值≤0.035被认为显著并标明。
图5：刚离体时痰显示高细胞因子水平。A：比较来自TB患者的血清(白色)、唾液(灰色)和痰(黑色)中的细胞因子水平(n分别=25、20和23)。注意显示的值未针对消化期间痰细胞因子的稀释度调整。B：来自TB(n=23)和非-TB(n=29)受试者的痰的离体细胞因子水平分析。框指示四分位数间距；线指示中位数；棒指示5-95%范围并且点指示异常值。使用Mann-WhitneyU-检验比较TB和非-TB来分析数据。P-值≤0.035被认为显著并标明。
图6：离体痰中细胞因子水平的热图。对于具有TB的受试者(n=23)和具有其它呼吸系统病症的那些(not-TB；n=29)标明了中位数值(红色=高，蓝色=低)。
发明详述
本发明提供用于检测受试者中的结核病的新方法。所述方法有利地使用提供结核病特异性蛋白特征的宿主生物标志，而非试图检测结核病抗原(其为动态的并且根据细菌的状态、存在量、菌株和毒力变化)。该特征不受所述感染基于的分枝杆菌菌株影响，使该方法比现有的基于抗原的方法更广泛适用。此外，所述方法可用于区分结核病与其它肺病况例如肺炎。由于该方法在痰样品上实施而不需要抗原刺激或培养，所述方法是快速的并且可在非-实验室环境中实施。因此所述方法可不使用针或血液取样、不需要先进的诊断技术并且不需要基础设施例如医疗设施、电等而进行。这对于促进该方法在发展中国家使用尤为重要。
检测结核病
在一个方面，本发明提供用于检测受试者中的结核病的方法。“检测结核病”通常意指该方法可用于确定受试者是否患有结核病。因此在具体的实施方案中，所述方法可用于诊断结核病、筛查患者群的结核病的存在、检测有活性的结核病感染、检测肺分枝杆菌(例如结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis))感染的存在和/或监测受试者中结核病感染的进展。
结核病(TB)为通常由分枝杆菌例如结核分枝杆菌感染引起的慢性、传染性疾病。在一个实施方案中，检测TB意指检测结核分枝杆菌复合体的细菌的感染。结核分枝杆菌复合体由狭义结核分枝杆菌(M.tuberculosissensustricto)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、北京分枝杆菌(M.Beijing)和其它组成。在一些情况下可与结核病相关的其它分枝杆菌物种包括牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、卡氏分枝杆菌(Mycobacteriumcanetti)和田鼠分枝杆菌(Mycobacteriummicroti)。通常仅约10%的感染这些分枝杆菌的受试者发展成有活性的(即有症状的)结核病。有活性的结核病感染通常主要影响肺，导致诸如胸痛、发烧和生痰的慢性咳嗽等症状。还可出现肺外症状，例如在中枢神经和淋巴系统中。因此本方法通常用于检测有活性的结核病感染，例如其中受试者显示一种或多种上述症状。
本方法还可用于区分结核病与其它肺病或呼吸系统病症，特别是肺炎。所述方法还可用于区分结核病与非传染性肺病，例如慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。
肺炎为肺的炎症性病况，通常由病毒或细菌感染引起。肺炎的症状也可包括咳嗽、体重减轻、胸痛和发烧。因此在许多情况下不对受试者实施X-射线难以区分肺炎与结核病。然而，肺炎和结核病通常需要用截然不同的治疗方案治疗，并且误诊的后果可非常严重。例如，除降低对个体受试者的疗效外，不准确的诊断可引起疾病传播增加和药物抗性随时间增加。本发明因此在一个方面提供用于确定疑似患有肺病(例如显示一种或多种指示结核病和/或肺炎的症状)的受试者是否患有结核病或另一种肺病，例如肺炎。
受试者
在一个实施方案中，受试者为人。然而，本发明方法不限于人，并且还可在，例如非-人哺乳动物上实施。在一个优选的实施方案中，所述受试者为成人，尽管在一些实施方案中该方法可在儿童或婴儿上实施。
通常受试者疑似患有肺病。因此受试者可显示与肺病相关的一种或多种症状，例如慢性咳嗽(通常产生痰)、胸痛、呼吸困难、发烧和/或体重减轻。
样品
在本发明的实施方案中，生物标志在从受试者获得的痰样品中检测。痰(或粘痰)为肺衍生的浓稠粘性流体。痰样品通常通过咳嗽从肺带出。痰应与唾液区分，唾液明显更稀并且从口腔而不是肺衍生。
疑似患有肺病例如结核病的受试者通常产生显著量的可使用本文所述的方法分析的痰。用于从受试者获得痰样品的方案众所周知。例如，在一些情况下可指示受试者做一个或两个深呼吸然后咳嗽直至其能够咳吐出浓稠粘滞的痰样品。
若需要，可采取进一步的步骤帮助受试者提供痰样品。呼吸湿热空气可使气道的粘液变稀，使得更容易咳出痰样品。例如，受试者可在咳嗽前呼吸包含3-15%盐溶液的(例如，由喷气式手持雾化器或超声波雾化器提供的)雾5-15分钟。
宿主免疫系统生物标志
在本发明的实施方案中，检测一种或多种宿主免疫系统生物标志。“宿主生物标志”通常意指生物标志衍生自宿主本身(而不是例如感染宿主的病原体)。例如，宿主生物标志可由受试者的基因组而不是感染剂的遗传物质编码。因此通常宿主生物标志为人类蛋白生物标志。
“免疫系统生物标志”通常意指生物标志在受试者的免疫系统中表达。例如，生物标志可由免疫系统的细胞(例如白细胞如淋巴细胞、中性粒细胞或巨噬细胞)表达，或生物标志可对免疫系统的细胞产生生物学作用。在一个优选的实施方案中，一种或多种生物标志为免疫调节剂。
通常生物标志为可溶蛋白或肽。例如，所述生物标志可为免疫系统的细胞分泌的和/或与免疫系统细胞上的细胞表面受体结合的信号传导分子。
在优选的实施方案中，所述生物标志包括一种或多种细胞因子、趋化因子和/或生长因子。细胞因子为通常具有免疫调节作用(往往通过与免疫系统细胞(例如白细胞)上的受体结合)的信号传导分子(通常为蛋白或肽)的群体。细胞因子亚群的实例包括淋巴因子类、白细胞介素类和干扰素类。
辅助性T细胞应答通常分类为Th1或Th2，Th1典型地与抗胞内病原体的细胞介导的(例如细胞毒性T细胞和巨噬细胞)应答相关，Th2与抗胞外病原体的体液(例如，B细胞的分泌性抗体产生)应答相关。Th1和Th2应答通常与特定细胞因子相关，所述细胞因子可相应分类。
在一个实施方案中，一种或多种生物标为Th2细胞因子。如本文所证明的，与未患TB的受试者相比，Th2细胞因子水平在来自具有结核病的受试者的痰样品中降低。因此Th2细胞因子优选为白细胞介素-4、白细胞介素-10或白细胞介素-13。更优选地一种或多种生物标志包括IL-10或IL-13。在这样的实施方案中，与参考值相比降低的一种或多种Th2细胞因子水平通常指示受试者中存在结核病。
或者，在一些实施方案中一种或多种生物标志为Th1细胞因子。Th1细胞因子包括，例如，干扰素-γ。尽管在一些情况下特定Th1细胞因子的水平可能在TB和非-TB患者之间无显著差异，如实施例中所证明的当与进一步的生物标志组合使用时Th1细胞因子例如IFN-γ可具有诊断潜能。因此在一个优选的实施方案中，当一种或多种生物标志为Th1细胞因子时，测定至少一种另外的宿主免疫系统生物标志(例如Th2细胞因子和/或生长因子)。在这样的实施方案中，与参考值相比降低的一种或多种Th1细胞因子(例如IFN-γ)的水平通常指示受试者中存在结核病。
除了上文提及的那些外，在本发明的具体实施方案中可使用多种其它细胞因子。例如，额外的细胞因子包括IL-1β、IL-2、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-17和TNF-α。特别优选的细胞因子包括白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)、白细胞介素-15、血管内皮生长因子(VEGF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。与参考值相比降低的这些细胞因子的水平通常指示受试者中存在结核病。
趋化因子为介导细胞之间的化学吸引（chemoattraction）(趋化性)的信号传导分子。趋化因子通常担负向炎症位点招募细胞例如白细胞(例如中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞或淋巴细胞)的责任，例如通过与这些细胞上的细胞表面受体结合。趋化因子通常为可溶蛋白或肽并且在一些情况下可归类为细胞因子的亚群。趋化因子的实例包括单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)、干扰素γ-诱导蛋白10(IP-10)、RANTES(正常T细胞表达和分泌的，调节活性的(RegulatedonActivation,NormalTcellExpressedandSecreted))和嗜酸细胞活化趋化因子。
生长因子为通常能够刺激细胞生长、增殖和/或分化包括血管发生的信号传导分子。归类为细胞因子的一些剂也可认为是生长因子，反之亦然，例如VEGF、G-CSF和GM-CSF。生长因子通常为蛋白或肽或甾类。在本发明的实施方案中，一种或多种生物标志包括成纤维细胞生长因子(FGF)。通常与参考值相比在痰样品中增加的该生长因子的水平指示受试者中存在结核病。
生物标志组合
在优选的实施方案中，测定痰样品中多种(例如2、3、4、5、6或更多种)宿主免疫系统标志的水平。
在一个实施方案中，所述方法包括测定至少一种Th2细胞因子和至少一种生长因子的水平。在另一个实施方案中，所述方法包括测定至少一种Th1细胞因子和至少一种Th2细胞因子的水平。优选地，所述方法包括测定至少一种Th1细胞因子、至少一种Th2细胞因子和至少一种生长因子的水平。
在一个特别优选的实施方案中，所述生物标志选自IL-1Ra、IL-10、IL-13、IL-15、FGF、G-CSF、VEGF和/或IFN-γ。更优选地，所述生物标志包括IL-13、FGF和/或IFN-γ。例如，在具体的实施方案中所述生物标志可包括(i)IL-13和FGF；(ii)IL-13和IFN-γ；(iii)FGF和IFN-γ；或(iv)IL-13、FGF和IFN-γ。
测定生物标志水平
在本方法中，生物标志水平在来自受试者的痰样品中测定。样品中特定生物标志的量可通过任何合适的方法测量。例如，用于检测蛋白生物标志的方法可包括使用抗体、捕获分子、受体或与蛋白选择性结合的其片段。与本文所述生物标志结合的抗体为已知的或可通过本领域已知的方法生产，所述方法包括免疫动物和收集血清(以生产多克隆抗体)或脾细胞(以通过与永生的细胞系融合产生杂交瘤，其导致单克隆抗体)。本文所述生物标志的氨基酸序列为已知的并且从可公开访问的数据库可得，并可用于产生合适的免疫原用于抗体生产。检测分子例如抗体可任选结合至固体载体例如塑料表面或小球上或处于阵列中。用于检测蛋白水平的适当检验形式包括，但不限于，免疫测定例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、蛋白质印迹、抗体阵列、多重细胞因子测定和免疫沉淀。
在一个优选的实施方案中，生物标志可使用多重细胞因子测定，例如，使用LuminexTM微球体检测。例如，可将与每一细胞因子生物标志特异性结合的抗体附着至微球体上，例如至设计为与LuminexTM仪器一起使用的LuminexTM微球体。可将大量(例如多达100种)不同类型的微球体混合并一起分析。在一个实施方案中所述方法在单个反应容器中进行。每个微球体群可通过其独特的荧光特征或颜色区分。
在一个典型的多重细胞因子测定形式中，不同的小球类型包含不同细胞因子生物标志的抗体。小球的等分试样允许用小体积的检验痰样品孵育。然后洗涤小球以去除未结合的样品。然后加入与可检测标志(例如生物素，通过加入链霉亲和素-藻红蛋白可检测)缀合的检测抗体。然后，例如在流式分析仪中，通过分离不同小球类型和检测标志的存在来分析样品。将来自每一小球的信号强度与小球制备物中包含的阴性对照小球的信号强度比较以确定对于每一细胞因子小球是阳性还是阴性。
在另一个实施方案中，生物标志可使用抗体阵列检测。抗体阵列通常包括固定在固体载体的离散区域的免疫球蛋白分子或其功能衍生物或相等物的阵列，使得不同的离散区域对不同的生物标志具有特异性。固定免疫球蛋白与其各自的抗原的结合模式指示样品中特定生物标志的存在。合适的抗体阵列在，例如，Chang(1983)J.Immunol.Methods65,217223和WO00/39580中公开。
或者生物标志蛋白的水平可通过质谱测定。质谱允许凭借其分子量检测和定量分析物。可使用本领域已知的任何质谱学领域中的适当的电离方法，包括但不限于电子轰击(EI)、化学电离(CI)、场电离(FDI)、电喷雾电离(ESI)、激光解吸电离(LDI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)和表面增强激光解吸电离(SELDI)。可使用任何合适的质谱检测方法，例如四极子质谱(QMS)、傅里叶变换质谱(FT-MS)和飞行时间质谱(TOF-MS)。
侧流免疫测定
在一个特别优选的实施方案中，生物标志水平使用侧流免疫测定检测。侧流免疫测定特别适合单步、护理点检验(POCT)并提供灵敏和快速的靶分子检测方法。侧流免疫测定可以以夹心或竞争检验形式使用。一般而言具有几个可用表位的高分子量分析物可以以夹心形式分析，而仅表现单一可用表位的较小分子可依靠竞争测定来检测。
合适的侧流免疫测定装置在，例如，US2005/0175992和US2007/0059682中公开。通常侧流装置可为浸入样品中的测试条或浸渍片形式。所述装置可由色谱载体材料形成，以致样品中的液体从施用区向试剂区侧向迁移。通常分析物的分子然后与经标记的对该分析物特异的抗体相遇，并形成分析物-抗体复合体。然后该复合体继续向检验线区进一步侧向迁移，在所述检验线区(例如在夹心测定形式中)另外的抗体固定在色谱载体材料上。与第一个(标记)抗体相比此第二个(固定)抗体通常与分析物上的不同表位结合。样品中分析物的存在因此通过因固定抗体捕获标记抗体-分析物复合体所致的对检验线区的信号(例如颜色变化)的可视化而检测。在一些情况下，可在同样存在于测试条上的对照线区固定在分析物存在和不存在时均与标记抗体结合的另外的抗体(例如与标记抗体的Fc区域结合的抗-免疫球蛋白抗体)。若检验正确运行，对照线区应显现信号，无论样品中是否存在分析物。
在备选的实施方案中，生物标志可通过竞争侧流免疫测定检测。在这样的测定形式中，样品通常首先遇到标记的分析物或其类似物(而不是上文所讨论的夹心测定形式中的标记抗体)。样品衍生的分析物然后与标记分析物一起向固定有分析物的抗体的检验线迁移。样品中未标记的分析物与标记的分析物竞争结合抗体，以致检验线处可见带的缺失指示样品中存在分析物。该测定形式可在其中期需提供阳性视觉信号指示TB存在，例如其中生物标志为Th2细胞因子（其在来自具有疾病的受试者的痰样品中降低）的情况下使用。
抗体
本文所述检测方法优选使用与本文所述宿主免疫系统生物标志结合的一种或多种抗体。合适的抗体市售可得或可使用已知的技术产生。
抗体包括免疫球蛋白分子。免疫球蛋白分子在免疫球蛋白超家族（一个包含抗体分子特有的免疫球蛋白折叠的多肽家族，所述免疫球蛋白折叠包含两个β折叠以及，通常，一个保守的二硫键）的最广义的成员内。如本文所使用的，抗体指能够与所选的靶生物标志结合的完全抗体或抗体片段，并且其包括Fv、ScFv、F(ab’)和F(ab’)2、单克隆和多克隆抗体、经工程改造的抗体，其包括嵌合、CDR-嫁接的和人源化抗体，以及使用噬菌体展示或替代技术产生的人工选择的抗体。
抗体可从动物血清获得，或，在单克隆抗体或其片段的情况下，在细胞培养物中产生。重组DNA技术可用于按照已建立的程序，在细菌、酵母、昆虫或优选哺乳动物细胞培养物中生产抗体。所选的细胞培养系统优选分泌抗体产物。
体外生长杂交瘤细胞或哺乳动物宿主细胞在合适的培养基中进行，所述培养基为惯用标准培养基，例如Dulbecco’sModifiedEagleMedium(DMEM)或RPMI1640培养基，任选补充哺乳动物血清，例如胎牛血清，或微量元素和生长维持补充剂，例如饲养细胞如正常小鼠腹膜渗出物细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞、2-氨基乙醇、胰岛素、转铁蛋白、低密度脂蛋白、油酸等。培养基可无血清或非动物产生（animal-producefree），例如化学成分确定的培养基，以最小化动物衍生的污染。为细菌细胞或酵母细胞的宿主细胞的繁殖同样在本领域已知的合适培养基中进行，例如对于细菌在培养基LB、NZCYM、NZYM、NZM、TerrificBroth、SOB、SOC、2xYT或M9MinimalMedium中，对于酵母在培养基YPD、YEPD、MinimalMedium或CompleteMinimalDropoutMedium中。
昆虫细胞可在与含血清培养基相比更便宜和安全的无血清培养基中培养。重组杆状病毒可用作表达载体和用于转染宿主细胞系(其可为许多鳞翅类细胞系中的任一种，特别地草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9)的构建体，如本领域所已知的。Altmann等人(1999),GlycoconjJ1999,16,109-23以及Kost和Condreay(1999),CurrOpinBiotechnol,10,428-33提供了在昆虫宿主细胞中表达重组蛋白的综述。
体外生产提供相对纯的抗体制备物并允许增大规模以产生大量的期需抗体。用于细菌细胞、酵母、昆虫和哺乳动物细胞培养的技术为本领域所已知并且包括，例如在气升式反应器或在连续搅拌反应器中的均质悬浮培养，或例如在空心纤维、微胶囊中、在琼脂糖微球或陶瓷盒上固定或截留的细胞培养。
大量期需抗体还可通过体内繁殖哺乳动物细胞获得。对于该目的，将产生期需抗体的杂交瘤细胞注射入组织相容的哺乳动物以引起抗体-产生肿瘤生长。任选，所述动物在注射之前用烃，特别是矿物油例如姥鲛烷(四甲基-十五烷)致敏（prime）。1-3周后，从那些哺乳动物的体液分离抗体。例如，将通过融合合适的骨髓瘤细胞与来自Balb/c小鼠的抗体-产生脾细胞获得的杂交瘤细胞或从杂交瘤细胞系Sp2/0衍生的产生期需抗体的转染细胞腹膜内注射入任选用姥鲛烷预处理的Balb/c小鼠，并且，1-2周后，从动物获取腹水。
前述以及其它技术在，例如，通过引用结合到本文中的Kohler和Milstein,(1975)Nature256:495-497;US4,376,110;Harlow和Lane,Antibodies:aLaboratoryManual(抗体：实验室手册),(1988)ColdSpringHarbor中讨论。用于制备重组抗体分子的技术在上述参考中以及还在，例如，EP0623679、EP0368684和EP0436597中描述，所述专利通过引用结合到本文中。
优选通过经由免疫印迹、酶免疫测定，例如夹心测定或点测定、或放射免疫测定免疫荧光染色表达期需靶的细胞对细胞培养上清液进行期需抗体筛查。
对于抗体分离，可，例如通过用硫酸铵沉淀、对抗吸湿材料例如聚乙二醇透析、通过选择性膜过滤等浓缩培养上清液或腹水中的免疫球蛋白。若必要和/或期需，通过惯用色谱方法，例如凝胶过滤、离子交换色谱、在DEAE-纤维素上的色谱和/或免疫亲和色谱，例如用包含靶的蛋白或用蛋白-A亲和色谱纯化抗体。
根据前述程序产生的抗体可通过按照标准程序从细胞分离核酸克隆。有用地，可分离抗体的核酸可变结构域并用于构建抗体片段，例如scFv。
本文所述方法可使用包含编码抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的插入物的重组核酸。按照定义这样的核酸包括编码单链核酸、由编码核酸及其互补核酸组成的双链核酸，或这些互补(单链)核酸本身。
此外抗体可通过诱变抗体基因产生以产生人工抗体所有组分(repertoires)。该技术允许制备抗体文库；抗体文库也是市售可得的。因此，人工免疫球蛋白所有组分，优选人工ScFv所有组分，可用作免疫球蛋白源。
分离或克隆的抗体可与其它分子，例如核酸或蛋白缔合工具，通过化学偶联，使用本领域已知的方案连接(例如，Harlow和Lane,抗体：实验室手册(Antibodies:aLaboratoryManual),(1988)ColdSpringHarbor,以及Maniatis,T.,Fritsch,E.F.和Sambrook,J.(1991),分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual).ColdSpringHarbor,NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress)。这样的方法可用于产生标记抗体或将抗体固定在固相上。
在一些实施方案(例如涉及侧流免疫测定的)中抗体可为标记的。通常标记抗体能够产生可检测的信号。所述信号可为，例如，产生酶活性，例如蛋白酶活性、转录活性或发光诱导活性。然而，优选地，所述信号为发射或吸收电磁辐射，例如，光。更优选地所述信号为可见信号，例如信号用肉眼可检测。所述信号可为，例如，当标记抗体存在时发生的颜色变化。
将可见或荧光标记缀合至各种实体（包括肽、多肽和抗体）的方法为本领域周知的。在某些实施方案中，可期需在抗体和标记之间包含间隔工具。间隔工具可包括为不同长度的聚合物(其长度可通过控制多聚化程度来控制)的接头或间隔物。本领域已知许多间隔物和接头，并且本技术人员会知道如何根据应用选择和使用这些。技术人员还会知道要使用何种间隔物长度。
与参考值比较
在本发明的实施方案中，将痰样品中的生物标志水平与一个或多个参考值比较。参考值可为，例如，来自正常受试者，即未患结核病的受试者的痰样品中存在的生物标志水平的预定测量。在一些实施方案中，参考值可从患有结核病之外的肺病例如肺炎的受试者(或受试者群)衍生。参考值可，例如，基于未显示结核病症状的对照受试者群，例如，5、10、100、1000或更多个受试者(可为与检验受试者年龄和/或性别匹配的或不匹配的)中生物标志的平均或中位数水平。优选地检验样品中的生物标志水平与对照值相比相差至少1%、5%、至少10%、至少20%、至少30%或至少50%。
对照值可使用测定检验样品中脂质水平的相应方法，例如使用从对照受试者群获取的一个或多个样品测定。例如，在一些实施方案中对照样品中的生物标志水平可与检验样品平行测定。在备选的实施方案中，对照值可预先测定，或可计算或推断，而无须关于获得的每一检验样品在对照样品上进行相应测定。
在侧流测定的情况下，样品中生物标志的存在或不存在可通常通过侧流装置上检验线处可见信号(例如颜色变化)的存在或不存在确定，即结果通常可肉眼测定。技术人员将认识到侧流装置还可用于确定特定生物标志的水平是高于还是低于特定截断值(其可与本文所述参考值对应)。截断和参考值一般可使用各种统计技术，包括接受者工作曲线分析确定，如下文实施例中所描述的。
例如，可选择测定排列和条件以及标记、固定和对照抗体的相对量以使检验线处可见信号的强度可与对照线处的可见信号比较以提供生物标志的水平是高于还是低于参考值的指示。或者，侧流检验可在来自受试者的样品上进行，平行地在来自已知未患结核病的受试者的样品上进行单独(对照)检验。对照还可为不从患者衍生但包含确定量的生物标志的样品。在任一情况下，将来自测试条的结果与对照条比较均可提供与参考值相比的来自受试者的痰样品中的生物标志水平的指示。
在另一个备选的实施方案中，可定量侧流装置上的信号以提供更准确的生物标志水平指示。例如，可测定检验线处的信号强度以定量样品中分析物的量。可使用手提式诊断装置例如侧流读数器，例如以照亮检验线并测量指示标记的特定波长的光。这样的读数器中可并入图像处理算法以关联信号与分析物浓度。
治疗肺病
在进一步的方面，本发明提供治疗疑似患有肺病或呼吸系统病症的受试者的方法。通常所述方法包括进行如上所述的检测方法的步骤，并基于其结果治疗受试者。具体地，若痰样品中的生物标志水平指示受试者中存在结核病，所述方法通常涉及给予受试者治疗有效量的抗-结核病治疗(例如包括一种或多种治疗剂)的步骤。通常针对TB的这种治疗持续很长一段时间，例如至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月。
在进一步的实施方案中，若痰样品中的生物标志水平指示受试者中不存在结核病，所述方法可涉及给予受试者替代的肺病治疗的步骤。所述替代治疗可为针对例如肺炎、哮喘或慢性阻塞性肺病的治疗。例如，在一些实施方案中，可给予受试者抗肺炎治疗剂。通常针对TB之外的肺病的所述治疗可比针对TB的治疗更短期。因此在这样的实施方案中，所述治疗可持续至多1周、至多2周、至多3周或至多1个月。
可用于治疗结核病的治疗剂和方案为技术人员周知的。例如，抗结核病治疗可包括给予选自异烟肼、利福平、乙胺丁醇和/或吡嗪酰胺的一种或多种剂。通常使用两种或更多种治疗剂组合治疗有活性的TB感染。所述治疗优选给予至少6个月，尽管这可分为开始的集中治疗期以及随后的延长持续期。因此针对有活性的TB感染的标准短疗程治疗为异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇持续两个月，接着仅异烟肼和利福平另外持续四个月。在该第一线治疗失败的情况下，在一些情况下可使用第二线治疗。第二线治疗可包括氨基糖苷类(例如阿米卡星、卡那霉素)、氟喹诺酮类(例如环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星)、硫代酰胺类(例如乙硫异烟胺、丙硫异烟胺)、环丝氨酸(例如，closerin)、特立齐酮、卷曲霉素、紫霉素或恩维霉素。
相比之下，用于治疗肺炎(特别是细菌性肺炎)的治疗剂通常为广谱抗生素。例如，合适的抗生剂包括阿莫西林、多西环素、克拉霉素、大环内酯类(例如阿奇霉素或红霉素)。在一些情况下也可使用头孢菌素类、碳青霉烯类和万古霉素，例如静脉内给予并且组合使用，特别是在医院获得的感染的情况下。通常所述治疗可给予例如3-5天、7-10天或至多2周。
治疗剂可使用多种技术给予受试者。例如，所述剂可全身性给予，这包括通过注射包括肌内或静脉内、口服、舌下、透皮、皮下或鼻间（internasally）。优选所述剂口服给予。待给予的治疗剂的浓度和量通常将根据疾病的性质、所给与剂的类型、给予方式以及受试者的年龄和健康而改变。
所述治疗剂可，例如与药学上可接受的稀释剂一起，配制在例如固体或片剂形式或液体形式的药物组合物中。组合物可常规包含药学上可接受量的稀释剂、赋形剂和其它合适的载体。适当的载体和制剂在，例如，雷明顿药物科学(Remington’sPharmaceuticalSciences)(Remington’sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton,Pa.,USA1985)中描述。
试剂盒
在进一步的实施方案中，本发明提供适于实施如上所述的方法的试剂盒。具体地，所述试剂盒可包含适于检测上述生物标志，例如一种或多种宿主免疫系统生物标志或如本文所定义的生物标志组合的试剂。通常所述试剂可包括与生物标志或如本文所定义的生物标志组合特异性结合的抗体。例如所述试剂盒可包含一种、两种、三种或四种不同的抗体，每一所述抗体与选自以上定义那些的不同生物标志结合。
这样的试剂盒可任选进一步包含一种或多种额外的组分，例如适于使用与生物标志结合的抗体进行ELISA测定的试剂。例如，所述试剂盒可包含每一生物标志的捕获和检测抗体、二抗、检测试剂、固相(例如反应板或小球)、标准品(例如已知浓度的重组蛋白形式的每一生物标志)以及适于进行ELISA方法的任何步骤的缓冲液。所述试剂盒可进一步包含小瓶、容器和用于储存上述试剂的其它包装材料，以及用于实施如本文所定义的方法的说明。
在特别优选的实施方案中，所述试剂盒为侧流免疫测定装置形式或包含侧流免疫测定装置。如本文所述，所述装置可包含与宿主免疫系统生物标志或生物标志组合特异性结合的一种或多种抗体。合适的抗体市售可得或可使用已知技术产生。
本发明现将通过仅示例的方式关于下列具体实施方案描述。
实施例
在本研究中分析了若干样品类型以测定用于诊断TB的最佳流体与生物标志组合。痰宿主生物标志明显高于抗原-刺激血液中的水平并导致TB的96%正确分类，无论涂片或HIV状态如何。因此本发明提供允许“无实验室”检测TB的检验。其益处显而易见：每年一千万例新诊断，但仅16%通过实验室确认，快速检测TB的能力会大大减少TB负担。
方法
受试者：
受试者从MedicalResearchCouncilUnit,Fajara,TheGambia的门诊诊所和病室连续招募。所有受试者均为呈现持续超过2周的咳嗽加上一种提示TB的其它临床症状(即体重减轻、发烧)的成年人(≥18岁)。淘汰标准包括早先的针对TB的治疗或并存病态例如疟疾。书面知情同意后对所有受试者进行完全的血液学、微生物学、生物化学和症状评估。进行HIV检验并收集痰、唾液、血清和肝素化血液样品用于免疫学评估。使用临床症状(问卷调查、体格检查)、胸部x-射线和微生物学(痰涂片和培养)将患者分为两组：具有培养-确认的TB的那些和具有其它呼吸系统疾病的那些(图1)。痰培养使用液体培养(BACTEC?,Becton-Dickinson,USA)进行并使用Capilia快速TB检验(TaunLaboratories,Japan)确认结核分枝杆菌复合体(MTBC)的存在。伦理批准获自冈比亚政府/MRC联合伦理委员会。
微生物学确认
痰样品通过Ziehl-Nielsen(ZN)染色使用LED显微镜分析。将等分试样净化并培养(BACTEC?,Becton-Dickinson,USA)。阳性培养物通过Capilia快速TB检验(Tauns,Japan)确认并在甘油中于-70℃储存。
间隔区寡核苷酸分型术（spoligotyping）
在具有OADC(油酸、白蛋白、右旋糖和过氧化氢酶)补充剂的Middlebrook7H9肉汤中生长储存的分离物用于提取DNA。使用10ngDNA用市售可得的膜(IsogenBiosciences,TheNetherlands)进行间隔区寡核苷酸分型术分析。扫描间隔区寡核苷酸分型术薄膜并使用Matlab(Mathworks,USA)中设计的软件分类，接着手动编辑和确认。将每一间隔区寡核苷酸分型术模式归类至二进制代码并将结果输入MicrosoftAccess数据库(Redmond,USA)。对于不能仅基于间隔区寡核苷酸分型术分析可靠地分类为结核分枝杆菌或非洲分枝杆菌的分离物，评估定义长序列多态性RD702和TbD1的谱系的存在或不存在，如先前所描述的。
多重细胞因子测定
样品制备
将血清和唾液等分并冷冻在-20℃直至需要。痰在具有0.1%二硫苏糖醇(DTT)的条件下室温消化15分钟。加入等体积的磷酸缓冲盐水(PBS)，将样品离心(600gmax,5min)，收集上清液并储存在-20℃。对于肝素化血液，我们使用450μl未稀释的血液/24孔板的孔。用纯化的蛋白衍生物(PPD)(10μg/mL;StatensSerumInstitute,Denmark)、ESAT-6/CFP-10(EC;10μg/mL)和两种休眠抗原，Rv0081和Rv2029(二者均为10μg/mL)刺激血液。孵育(37℃,5%CO2)24h后，收集上清液并在分析之前储存于-20℃。
细胞因子产生的多重分析
样品使用定制的13-plex(受刺激的血液)或27-plexBio-Plex(血清、唾液和痰)预混细胞因子/趋化因子试剂盒根据制造商的说明(Bio-Rad,Belgium)分析。在将滤板预湿后，向每一孔中加入50μl小球悬液并洗涤两次。然后加入50μl样品和标准品并于300rpm孵育1小时。将板洗涤3次然后加入50μl检测抗体并于300rpm孵育板30min。洗涤后，向每一孔中加入25μl链霉亲和素-PE并孵育10min。再次洗涤板并重悬在125μl测定缓冲液中，密封、混合并立即在Bio-plex分析仪上使用Bioplex管理软件(4.0版)读数。对于每个板使用质量控制以控制测定间变异。
统计分析
从抗原-特异性样品(仅全血测定)测量的分析物的值已扣除本底(未刺激的结果)。唾液、血清和痰值均衍生自未刺激的样品因此不需要本底扣除。使用Mann-WhitneyU-检验比较TB和非-TB受试者，进行Logistic回归和接受者工作曲线分析并针对年龄和性别调整。使用Friedman检验接着Dunn’s多重比较检验分析匹配的痰和抗原-刺激的培养物。使用GraphpadPrism6.0版(SoftwareMacKiev,USA)生成图，用SPSSv20(IBM,USA)进行统计分析。考虑到假发现率(FDR)P值≤0.035被认为显著。
结果
受试者人口统计数据（demographics）
我们总共分析了52名非-TB和27名确认的TB受试者(图1)。中位数年龄在TB与非-TB受试者之间无差异，但与非-TB组相比TB组具有显著更高的男性比例(81%相比49%)。这符合冈比亚的TB流行病学并且照此所有的结果针对性别和年龄进行调整。非-TB组的最终诊断基于临床评估和对治疗的响应，13/52的受试者诊断有慢性阻塞性肺病(COPD;n=5)、哮喘(n=2)、肺炎(n=6)，剩余的分组为一般呼吸道感染(RTI；未确诊)。因样品可用性所致对于每一样品类型受试者数目不同(图1)：对于全血抗原(WBA)-刺激分析使用20名TB和26名非-TB受试者；对于血清分析25名TB和52名非-TB受试者；对于唾液分析20名TB和42名非-TB受试者；对于痰分析23名TB和29名非-TB受试者。
使用全血24-小时抗原-刺激的培养上清液分类TB
我们分析了用Nil(无抗原)、EC、PPD、Rv0081和Rv2029过夜刺激之后TB和非-TB受试者的细胞因子概况。比较抗原-刺激的(Ag)、Ag-Nil和Nil的每一细胞因子的概况。所有刺激之后两组中的IP10和MCP-1水平均较高(平均值分别为7522pg/mL和6547pg/mL)，同时TGF-α、EGF和VEGF低下(平均值分别为9pg/mL、26pg/mL和23pg/mL)。在Nil培养物中与非-TB相比许多分析物在确认TB的受试者中显著更高，所述分析物包括IP10、CD40L、TGF-α、TNF-α和IFN-γ(分别p=0.0005、p=0.0089、p=0.0020、p=0.0016和p=0.0313；图2)。抗原刺激之后，在本底扣除前观察到多数差异，无论使用何种抗原，与非-TB受试者相比CD40L和TGF-α水平在TB中显著更高。本底扣除之后，在PPD-刺激的培养物中观察到多数差异，与非-TB受试者相比TB中的CD40L、IL-10和TGF-α水平更高(分别p=0.0089、p=0.0034和p<0.0001)但IFN-γ、IL-2和MIP-1β水平更低(分别p=0.0313、p=0.0040和p=0.0351；图3)。我们进行了logistic回归分析以确定用于诊断TB的最佳抗原-生物标志组合：PPD刺激之后，最好的分类物为TGF-α，其具有0.86的AUC[95%CI0.73-1.0]、96.2%的灵敏度[95%CI80.4-99.9]、80.0%的特异性[95%CI56.3-94.3]和4.8的似然比。EC刺激之后，TGF-α的水平导致84.6%的灵敏度[95%CI65.1-95.6]和80%的特异性[95%CI56.3-94.3]。最好的分类在PPD刺激之后用CD40L、TGF-α和IL10的组合取得，给予TB或非-TB的89%正确分类(数据未示出)。重要地，用任何抗原刺激之后对于感染不同Mtb菌株(结核分枝杆菌或非洲分枝杆菌)的TB受试者而言宿主免疫概况无差异(数据未示出)。
离体唾液和血浆细胞因子水平分析：
对于发展中国家的有效诊断检验一个主要因素为诊断用时。因此我们想要评估体液的刚离体时细胞因子水平。唾液显示比血清高的细胞因子水平，但对于任何分析的细胞因子TB与非-TB受试者之间未见差异(图4A)。血清具有相对低水平的所有细胞因子，在TB受试者中MIP-1β以最高水平检测到(86pg/mL)。然而，与非-TB受试者相比来自TB的血清中存在显著更高的IL-6、IL7和G-CSF水平(分别p<0.0001、p=0.0014和p=0.0003；图4B)。
刚离体时痰显示高细胞因子水平：
我们分析了所消化痰的可溶部分的离体细胞因子水平并且意外发现了与唾液和血清二者相比的高水平而不需抗原刺激。我们对证实具有TB的受试者进行了离体细胞因子水平横断面分析(图5A)。与唾液和血清二者相比IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-7、IL-8、IL-12(p70)和MIP-1β的水平在痰中均显著更高(在图5A中通过IL-7和IL-8说明)而与血清相比IL-1β、IL-17、G-CSF、GM-CSF、MCP-1和TNF-α在唾液和痰二者中显著更高(在图5A中通过G-CSF和MCP-1说明)。IL-6为唯一与血清(p<0.01)和痰(p<0.0001)二者相比在唾液中更低并且在血清和痰之间无差异(数据未示出)的细胞因子，三个样品类型之间未见到IFN-γ水平的差异(图5A)。
我们接着比较了来自TB和非-TB受试者的痰中的细胞因子水平(图6和图5B)。有趣地，我们发现促炎细胞因子(即TNF-α、IFN-γ、IP-10；数据未示出)无显著差异，而与非-TB受试者相比在来自TB的痰中发现显著更低的IL-10(p=0.004)、IL-13(p=0.003)和IL-15(p=0.022)水平(图6和图5B)。另外，固有细胞因子IL-1Ra、G-CSF和VEGF均显著更低(分别p=0.005、p=0.004、p=0.030)，同时与非-TB受试者相比TB中的FGF显著更高(TB中中位数287pg/mL相比非-TB受试者中2.2pg/mL；p=0.007；图6和图5B)。仅FGF水平给出TB的74%正确分类(灵敏度78%[95%CI56-93]和特异性67%[95%CI47-83])。Logistic回归显示IL-13、FGF和IFN-γ的组合给出TB的96%正确分类和非-TB的85%正确分类(总体90%)。重要地，在具有HIV共感染的受试者中未观察到如先前用胸膜液分析所见到的差异[5]。
TB的微生物学确认在2-3样品/患者上进行，其中样品在收集时间方面不同(在MRC24h内的3个样品为标准的)。不同样品的涂片结果存在差异，因此我们想要测定从同一人获得的多个痰样品(n=15)中的细胞因子水平。我们发现分析的任何细胞因子的水平均无差异(图5C)。
讨论
与高灵敏度和特异性并列，开发基于侧流的护理点TB检验的一个重要标准为结果用时。跟进缺失（losstofollow-up）或不履行护理(defaultingfromcare)为资源匮乏环境中医疗递送（healthcaredelivery）的主要问题；因此当务之急是患者可在经受TB检验的数小时内诊断和接受适当护理[2]。当前基于血液-衍生宿主免疫因子的诊断检验需要至少24小时的样品处理并且即使那样对于进一步开发快速检验水平也常常太低。据我们所知，我们是将在痰中检查细胞因子水平作为TB诊断的新工具的第一个团队。我们发现离体痰中极其高的细胞因子水平，并且样品制备需求最小；FGF、IL-13和IFN-γ的组合导致在呈现相似症状(即咳嗽持续时间>2周)的受试者中TB的96%正确分类。这些发现使得开发TB的快速护理点检验成为可能。
我们先前证明与血液相比通过分析来自感染部位的样品显著增加TB的灵敏度和特异性[5]。这是因为TB疾病期间效应子CD4+T细胞从血液迁移至肺，这导致这些细胞在血液中实质缺失但在肺中为占优势的和高度活化的群体[5]。这些细胞负责产生IFN-γ和对抗感染所需的其它细胞因子，并因此与在肺-衍生样品中存在的与血液相比增加的可溶因子水平直接相关。痰常规用于Mtb的微生物学检测。其可容易获得并且细胞因子水平似乎不受HIV共感染影响，这使其成为用于开发TB侧流检验的理想样品类型。另外，不存在感染菌株的影响并且用来自同一受试者的不同痰样品重现性高。
与唾液和血清二者相比IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-7、IL-8和MIP-1b的水平在痰中显著更高，而与唾液和痰相比IL-1b、IL-17、G-CSF、GM-CSF、MCP-1和TNF-α在血清中显著更低，唾液和痰之间无差异。这些发现说明了与外周相比将局部响应的免疫亚群中的差异。例如，与血液相比，在唾液和痰中观察到增加的固有和Th17细胞因子水平，这表明在这些部位粘膜-相关免疫增加。有趣地，离体样品类型之间观察到Th1细胞因子水平没有差异，并且与具有其它呼吸系统病症的受试者相比来自TB的离体痰中IFN-γ、IP-10和TNF-α水平也没有显著差异。相反，与非-TB相比Th2细胞因子，IL-10和IL-13二者在TB中均显著更低；这指示具有TB的受试者中对Th1应答的偏倚，这可导致增加的免疫病理学。G-CSF为中性粒细胞招募所需并且发现与非-TB受试者相比其在来自TB的痰中显著更低。这很有趣，因为中性粒细胞为对TB的保护性免疫反应中的主要组分[8]并且给予G-CSF已经显示增加对TB治疗的响应[9]。尽管与非-TB相比多数因子在TB中更低，FGF显著更高。成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导途径对许多呼吸道疾病的发病机制和在正常肺的生长和发育中是必须的[10]。有趣的是，Mtb感染的成纤维细胞丧失其抗原呈递能力，提示Mtb可通过感染成纤维细胞逃避T辅助细胞免疫监督，从而导致细菌存留[11]。
FIND(创新诊断基金会)建议确定的诊断开发需求包括至少75%并且理想地>95%的灵敏度(包括100%培养阳性样品)。我们仅分析了具有培养-确认的TB的受试者并且其中，仅3名涂片阴性(14%)因此在此阶段难以确定在涂片阴性受试者中的灵敏度。然而，使用来自痰的FGF、IL-13和IFN-γ的组合的TB的96%正确分类显著高于从当前基于血液、呼吸和尿的检验所报告的结果。我们将我们的分析限定于27种细胞因子/趋化因子但随着检测可用的分析物增加，允许>95%的特异性和灵敏度的标志将有可能被确定。总之，我们已经证明使用痰而不是血液显著增加基于免疫的TB检验的诊断准确度并减少结果用时。这些发现具有未来开发适用于资源有限的环境的快速的基于侧流TB诊断检验的前景。
总结
结核病(TB)在发展中国家是一个显著的公共健康问题，每年有900万新病例和140万死亡。减少TB负荷的主要障碍为缺乏在具有最低基础设施的卫生诊所中使用的快速和准确的诊断检验。我们分析了来自呈现提示TB的症状但在确认之前的患者的样品。根据临床和微生物学评估其随后被诊断患有TB或其它呼吸系统疾病(非-TB)。我们评估了痰、唾液、血清和全血抗原-刺激培养物中的宿主生物标志以确定用于诊断TB的最佳的样品类型与生物标志组合。用ESAT-6/CFP-10(EC)或PPD过夜刺激全血产生高水平的细胞因子；PPD刺激之后，最好的分类物为TGF-α，其具有0.86的AUC[95%CI0.73-1.0]、96.2%的灵敏度[95%CI80.4-99.9]、80.0%的特异性[95%CI56.3-94.3]和4.8的似然比。EC刺激之后，TGF-α的水平导致84.6%的灵敏度[95%CI65.1-95.6]和80%的特异性[95%CI56.3-94.3]。最好的分类在PPD刺激之后用CD40L、TGF-α和IL10的组合取得，给予TB或非-TB的89%正确分类。然而，对于“快速”诊断检验24小时的刺激是不理想的。与离体血清相比离体唾液具有显著更高的细胞因子水平，但不能区分患者组。与非-TB受试者相比IL7、IL-8和G-CSF的血清水平在TB中均显著更高(分别p<0.0001、p=0.0014和p=0.0003)。我们还分析了痰的可溶部分中的细胞因子水平；所述痰用于常规微生物学并且可从多数成年肺TB患者获得。与非-TB受试者相比在来自TB的痰中未观察促炎细胞因子(IFN-γ、IP-10、TNF-α)水平中有显著差异，但观察到显著更低的Th2细胞因子(IL-10(p=0.0004)、IL-13(p=0.0003)和IL-15(p=0.0221))和固有细胞因子(IL-1ra(p=0.0005)、VEGF(0.0301)和G-CSF(p=0.0041))水平和更高的FGF(p=0.007)。IL-13、FGF和IFN-γ的组合导致TB的96%正确分类和非-TB的85%正确分类(总体90%)，无论HIV状态如何。本发明因此提供TB的快速护理点检验。
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