发明领域本发明涉及具有特异性结合血脑屏障受体(BBBR)的一种结合特异性并且就该结合特异性而言是单价的血脑屏障穿梭模块(shuttlemodule)；还涉及使用此构建体作为血脑屏障穿梭体和用于神经疾病治疗的方法。
背景技术：
神经疾病药物的脑透过，例如，具有低的脑穿透的大生物治疗药或小分子药，受到广泛的不能透过的血脑屏障(BBB)与神经血管单元(NUV)中的其他细胞组分的严格限制。已经测试了克服这种障碍的许多策略，并且其中之一是利用脑毛细血管内皮上表达的内源性受体(血脑屏障受体)介导的转胞吞途径。已经设计了重组蛋白，如单克隆抗体或肽，来对抗这些受体，使得生物治疗剂能够通过受体介导递送至脑。然而，最大化脑吸收、同时最小化脑内皮细胞(BEC)中的错分拣(miss-sorting)以及BEC中某些细胞器(尤其是导致生物治疗剂降解的细胞器)内的累积程度的策略，仍然未得以开发。单克隆抗体和其他生物治疗剂对于治疗中枢神经系统(CNS)中的病状具有巨大的治疗潜能。然而，它们进入脑的途径被BBB阻止。之前的研究已经说明，非常小百分比(大约0.1％)的注射在血流中的IgG能够穿透进入CNS区室中(Felgenhauer，Klin.Wschr.52(1974)1158-1164)。由于抗体在CNS内的低浓度，这当然会限制任何药理作用。因此，需要可以有效地将药物穿梭运送至脑中的神经疾病药物跨BBB递送系统。WO2014/033074报道了血脑屏障穿梭。Boado，R.J.等报道了小鼠8D3抗转铁蛋白抗体及其可变轻链结构域(VL)变体(L596V和L598I)(Biotechnol.Bioeng.102(2009)1251-1258)。发明概述本发明的一个方面是包括脑效应物实体、衔接物和一个结合血脑屏障受体的单价结合实体的血脑屏障穿梭模块，其中衔接物将效应物实体与结合血脑屏障受体的单价结合实体偶联，其中单价结合实体不包括抗转铁蛋白受体抗体8D3(SEQIDNO:01和SEQIDNO:02)或变体抗转铁蛋白受体抗体8D3v(SEQIDNO:01和SEQIDNO:03)的可变结构域。抗转铁蛋白受体抗体8D3具有以下氨基酸序列的重链可变结构域：EVQLVESGGGLVQPGNSLTLSCVASGFTFSNYGMHWIRQAPKKGLEWIAMIYYDSSKMNYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLEMNSLRSEDTAMYYCAVPTSHYVVDVWGQGVSVTVSS(SEQIDNO:01).抗转铁蛋白受体抗体8D3具有以下氨基酸序列的轻链可变结构域：DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLAWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSGSRSGTQFSLKISRVQVEDIGIYYCLQAYNTPWTFGGGTKLELK(SEQIDNO:02).变体抗转铁蛋白受体抗体8D3v具有与抗体8D3相同的重链可变结构域和具有以下氨基酸序列的带L104V和L106I突变的轻链可变结构域：DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLAWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSGSRSGTQFSLKISRVQVEDIGIYYCLQAYNTPWTFGGGTKVEIK(SEQIDNO:03).在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体是多肽。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体包括选自血脑屏障受体配体、全长抗体、scFv、Fv、scFab和VHH的分子。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，血脑屏障受体选自转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白8、低密度脂蛋白受体相关蛋白1和肝素结合表皮生长因子样生长因子。在一个实施方案中，血脑屏障受体是转铁蛋白受体。在一个实施方案中，单价结合实体特异性地结合人转铁蛋白受体和猕猴转铁蛋白受体。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体包括一个针对转铁蛋白受体的scFab，更特别地，特异性地结合包括在SEQID.NO:04、05或06的氨基酸序列内的转铁蛋白受体中的表位的scFab。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体包括一个针对转铁蛋白受体的scFv，更特别地，识别包括在SEQID.NO:04、05或06的氨基酸序列内的转铁蛋白受体中的表位的scFv。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，脑效应物实体选自神经疾病药物、神经营养因子、生长因子、酶、细胞毒性剂、针对脑靶标的抗体、针对脑靶标的单克隆抗体、针对脑靶标的肽。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，脑靶标选自β-分泌酶1、Aβ(Abeta)、表皮生长因子、表皮生长因子受体2、tau、磷酸化tau、磷酸化tau(pS422)、载脂蛋白(apolipoprotein)E4、α突触核蛋白(synuclein)、α突触核蛋白的寡聚片段、CD20、亨廷顿蛋白(huntingtin)、朊病毒蛋白(prionprotein)、富含亮氨酸重复的激酶2、帕金蛋白(parkin)、早老蛋白2(presenilin2)、γ分泌酶、死亡受体6、淀粉样蛋白前体蛋白、p75神经营养蛋白(neurotrophin)受体和胱天蛋白酶(caspase)6。在血脑屏障穿梭模块的一个特定实施方案中，脑效应物实体是多肽。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体是多肽，并且单价结合实体与脑效应物实体的C-末端直接或通过衔接物缀合。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，脑效应物实体包括针对脑靶标的全长抗体。在一个实施方案中，全长抗体是IgG。在血脑屏障穿梭模块的一个优选实施方案中，血脑屏障穿梭体包括作为脑效应物实体的全长IgG抗体、衔接物和作为单价结合实体结合血脑屏障受体的一个scFab，其中scFab通过衔接物与IgG抗体的重链之一的Fc区的C-末端缀合。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，针对脑靶标的血脑屏障穿梭体的抗体的第一重链包括第一二聚化模块，且针对脑靶标的血脑屏障穿梭体的抗体的第二重链包括第二二聚化模块，从而允许两条重链的异二聚化。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，根据杵进臼(knobs-into-holes)的策略，针对脑靶标的血脑屏障穿梭体的抗体的第一重链的第一二聚化模块包括杵(knob)，且针对脑靶标的血脑屏障穿梭体的抗体的第二重链的二聚化模块包括臼。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，衔接物是肽衔接物。在一个实施方案中，肽衔接物具有至少25个氨基酸长度的氨基酸序列。在一个实施方案中，肽衔接物具有30至50个氨基酸长度的氨基酸序列。在一个实施方案中，肽衔接物是(G4S)6G2(SEQIDNO:07)或(G4S)4(SEQIDNO:08)。以下三个实施方案针对血脑屏障穿梭模块，其中脑效应物实体是多肽，前提条件是，脑效应物实体不是全长抗体，特别不是全长IgG。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体包括CH2-CH3Ig实体和一个结合血脑屏障受体的scFab(包括第一衔接物)，其中scFab通过第二衔接物与CH2-CH3Ig实体的C-末端偶联。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，血脑屏障穿梭体包括脑效应物实体、衔接物、CH2-CH3Ig结构域、第二衔接物和一个结合血脑屏障受体的scFab，其中脑效应物实体通过第一衔接物与CH2-CH3Ig结构域的N-末端缀合，且scFab通过第二衔接物与CH2-CH3Ig结构域的C-末端缀合。在血脑屏障穿梭模块的一个实施方案中，CH2-CH3Ig实体是CH2-CH3IgG实体。本发明的其它方面是编码本文中所述的血脑屏障穿梭模块的(分离)核酸、包括编码血脑屏障穿梭模块的(分离)核酸的宿主细胞、和包括血脑屏障穿梭模块的药物制剂。本文中所述的血脑屏障穿梭模块可以用作药物，特别是可以用于治疗神经疾病，如，例如，阿尔茨海默氏病。本文中所述的血脑屏障穿梭模块可以用于将脑效应物实体运送穿过血脑屏障。在一个特定的实施方案中，本文中所述的血脑屏障穿梭模块的IgG抗体的重链在其Fc-区C-末端与作为单价结合实体的结合血脑屏障受体的scFab缀合，具有以下结构：-IgG重链，-衔接物，将IgG重链的Fc区的C-末端与scFab的VL结构域的N-末端缀合，-scFab的可变轻链结构域(VL)和C-κ轻链结构域，-衔接物，将scFab的C-κ轻链结构域的C-末端与scFab的VH结构域的N-末端缀合，-scFab抗体的可变重链结构域(VH)和IgGCH1重链结构域。本文中所述的一个方面是运送脑效应物实体穿过血脑屏障的融合多肽，其包括CH2-CH3Ig实体、衔接物和一个特异性结合血脑屏障受体的scFab，其中scFab通过衔接物与CH2-CH3Ig实体的C-末端缀合，其中scFab不包括抗转铁蛋白受体抗体8D3(SEQIDNO:01和SEQIDNO:02)或变体抗转铁蛋白受体抗体8D3v(SEQIDNO:01和SEQIDDNO:03)的可变结构域。本文中所述的一个方面是运送脑效应物实体穿过血脑屏障的融合多肽，其包括CH2-CH3Ig实体、衔接物和一个特异性结合血脑屏障受体的scFv，其中scFv通过衔接物与CH2-CH3Ig实体的C-末端缀合，其中scFv不包括抗转铁蛋白受体抗体8D3(SEQIDNO:01和SEQIDNO:02)或变体抗转铁蛋白受体抗体8D3v(SEQIDNO:01和SEQIDDNO:03)的可变结构域。在一个实施方案中，融合多肽还包括在CH2-CH3Ig实体的N-末端的衔接物，其将脑效应物实体与CH2-CH3Ig实体的N-末端汇合。在融合多肽的一个实施方案中，脑效应物实体选自神经疾病药物、神经营养因子、生长因子、酶、细胞毒性剂、选自scFv、Fv、scFab、Fab、VHH、F(ab’)2的针对脑靶标的抗体片段或肽。在融合多肽的一个实施方案中，特异性地结合血脑屏障受体的scFab或scFv特异性地结合转铁蛋白受体。在一个实施方案中，scFab或scFv特异性地结合包括在SEQIDNO:04、05或06的氨基酸序列内的转铁蛋白受体表位。在融合多肽的实施方案中，衔接物是肽衔接物。在一个实施方案中，肽衔接物具有至少15个氨基酸长度的氨基酸序列。在一个实施方案中，肽衔接物具有20至50个氨基酸长度。在一个实施方案中，肽衔接物具有氨基酸序列(G4S)6G2(SEQIDNO:07)或(G4S)4(SEQIDNO:08)。在融合多肽的一个实施方案中，CH2-CH3Ig实体是CH2-CH3IgG实体。本发明的其它方面是编码本文中所述的融合多肽的分离核酸和包含编码本文中所述的融合多肽的核酸的宿主细胞。本文中所述的一个方面是缀合物，其包括本文中所述的融合多肽和通过衔接物与本文中所述的融合多肽的CH2-CH3Ig实体的N-末端缀合的脑效应物实体。在缀合物的一个实施方案中，脑效应物实体是神经营养因子，而将神经营养因子与CH2-CH3Ig实体的N-末端缀合的衔接物是肽衔接物。本文中所述的其它方面是包括本文中所述的缀合物和药物载体的药物制剂，本文中所述的缀合物的用途，特别是缀合物用于神经退行性疾病治疗的用途，特别是阿尔茨海默氏病。特异性地结合血脑屏障受体的单价结合实体可以直接或通过肽衔接物与抗体的轻链或重链的任一个末端缀合。在一个实施方案中，单价结合实体与重链的C-末端缀合。抗体重链的C-末端可以是完整的C-末端，结束于氨基酸残基PGK。重链的C-末端可以是缩短的C-末端，其中C-末端氨基酸残基的一个或两个已经被除去。在一个实施方案中，重链的C-末端是缩短的C-末端，结束于氨基酸残基PG。单价结合实体可以直接或通过肽衔接物与相应抗体链缀合。在一个实施方案中，肽衔接物具有氨基酸序列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:09)。单价结合实体可以是抗体scFv片段。在一个实施方案中，单价结合实体是从N-至C-末端包括轻链可变结构域-轻链恒定结构域-肽衔接物-重链可变结构域-重链恒定结构域1的scFv。在一个实施方案中，单价结合实体是具有(G4S)6肽衔接物(SEQIDNO:10)的抗转铁蛋白受体-抗体的scFv片段。在一个实施方案中，血脑屏障受体选自转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白8、低密度脂蛋白受体相关蛋白1和肝素结合表皮生长因子样生长因子。在一个实施方案中，血脑屏障受体是人血脑屏障受体。在一个实施方案中，血脑屏障受体是转铁蛋白受体，并且抗体不抑制转铁蛋白受体与转铁蛋白的结合。在一个实施方案中，血脑屏障受体是人转铁蛋白受体。在一个实施方案中，将单价结合实体与脑效应物实体缀合的肽衔接物是具有至少15个氨基酸长度的氨基酸序列。在一个实施方案中，肽衔接物具有18至25个氨基酸的长度。在一个实施方案中，脑效应物实体是全长抗体。在一个实施方案中，脑效应物实体是IgG1或IgG4亚类的全长抗体。在一个实施方案中，单价结合实体是抗血脑屏障受体抗体或其血脑屏障受体结合片段。在一个实施方案中，抗血脑屏障受体抗体或其片段不损害血脑屏障受体与其天然配体中的一个或多个的结合。在另一个实施方案中，抗血脑屏障受体抗体以不抑制人转铁蛋白受体与人转铁蛋白结合的方式，特异性地结合人转铁蛋白受体。在一个实施方案中，血脑屏障穿梭模块是效应物沉默的。在一个实施方案中，脑效应物实体是包括Fc-区的全长抗体，其中在Fc-区是人IgG1亚类的情况中，Fc-区包括突变L234A、L235A和P239G(根据Kabat的EU索引编号)，或在Fc-区是人IgG4亚类的情况中，Fc-区包括突变S228P、L235E和P239G(根据Kabat的EU索引编号)。发明实施方案的详述I.定义对于本文的目的，“受体人构架”是包括源自以下定义的人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“源自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包括与其相同的氨基酸序列，或可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。“亲和力”指在分子(例如抗体)的单个结合位点及其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和强度。除非另外指出，否则如本文中所用，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对于其配偶体Y的亲和力一般可以通过解离常数(Kd)来表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法，包括本文描述的那些，来进行测量。以下描述了用于测量结合亲和力的特定的说明性和示例性实施方案。“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个超变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致抗体对抗原的亲和力的提高。术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们呈现出所需的抗原结合活性即可。“抗体片段”指非完整抗体的分子，其包括完整抗体中与完整抗体所结合的抗原结合的部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种。抗体的“类”指抗体重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要的抗体类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中几个可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。“效应物功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随着抗体类别而改变。抗体效应物功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。药剂，例如药物制剂，的“有效量”是指，以所需剂量和时间段，有效地实现期望的治疗或预防结果的量。术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，其含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat，E.A.等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(目标免疫蛋白的序列)，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication91-3242中描述的。“构架”或“FR”指除了超变区(HVR)残基外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般以下述顺序在VH(或VL)中出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链的抗体。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已引入其内的细胞，包括此细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和从其衍生的后代，不考虑传代数目。后代可以在核酸内容上与亲本细胞不完全等同，而是可以含有突变。在本文中涵盖具有针对原始转化细胞所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变体后代。“人共有构架”是代表在选择的一系列人免疫球蛋白VL或VH构架序列中最常出现的氨基酸残基的构架。通常，选择的人免疫球蛋白VL或VH序列来自可变结构域序列的亚组。通常，该序列亚组是如Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫目标蛋白的序列)，第5版，NIHPublication91-3242，BethesdaMD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等同上引文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等同上引文中的亚组III。“人源化”抗体是指包括来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在特定实施方案中，人源化抗体将包括至少一个和一般两个可变结构域的基本上全部，其中HVR(例如CDR)的全部或基本上全部对应于非人抗体的，而FR的全部或基本上全部对应于人抗体的。人源化抗体任选可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经经历了人源化的抗体。如本文使用的，术语“超变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中序列超变(“互补决定区”或“CDR”)和形成结构上限定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触者”)的各个区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的HVR包括：(a)出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)的超变环(Chothia，C.和Lesk，A.M.J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；(b)出现在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)的CDR(Kabat，E.A.等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(目标免疫蛋白的序列)，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication91-3242)；(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1),46-55(L2),89-96(L3),30-35b(H1),47-58(H2)和93-101(H3)的抗原接触者(MacCallum等J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2),47-56(L2),48-56(L2),49-56(L2),26-35(H1),26-35b(H1),49-65(H2),93-102(H3)和94-102(H3)。除非另有所指，HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等(见上引文)编号。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，如猴)、兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在特定实施方案中，个体或受试者是人。“分离的”抗体是已经与其天然环境中的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电点聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评价抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman，S.等，J.Chromatogr.B848(2007)79-87。“分离的”核酸指已经与其天然环境中的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。如本文使用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同质的一个抗体群体的抗体，即，除了一般以微小量存在的可能的变体抗体(例如含有天然产生的或在单克隆抗体制备物的生产过程中出现的突变)外，群体中的各抗体是相同的和/或结合相同的表位。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比，单克隆抗体制备物的所有单克隆抗体都针对抗原上的一个决定簇。因此，修饰词“单克隆”是指抗体获自基本上同质的抗体群体的特征，并不应解释为要求通过任何特定方法生产该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这些方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中描述。“天然抗体”指具有各种结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键连接的两条相同轻链和两条相同重链组成。从N到C末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。相似地，从N到C末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后为恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链，基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以分配至称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个类型之一。术语“包装说明书”用于指习惯上包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有与此治疗产品使用相关的如下信息：适应症、用法、剂量、给药、联合治疗、禁忌和/或警告。相对于参考多肽序列，“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为，在比对参考序列和候选序列且在需要时引入空位以实现最大序列同一性百分比后，不将任何保守置换考虑为序列同一的部分，在候选序列中与参考多肽序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域已知的多种方法实现，例如使用可公开获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括为在待比较的序列的全长上实现最大对齐所需的任何算法。然而，对于本文的目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创作，并且源代码已与用户文档一起提交给美国版权局(U.S.CopyrightOffice)，WashingtonD.C.，20559，其注册为美国版权登记号TXU510087。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，SouthSanFrancisco，California公开获得，或可以由源代码编译。ALIGN-2程序应当编译以用于在UNIX操作系统(包括数字UNIXV4.0D)上使用。所有序列比较参数通过ALIGN-2程序设置并且不改变。在ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与或相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以可替代地表达为，与或相对于给定氨基酸序列B，具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：100乘以分数X/Y，其中X是在ALIGN-2程序的A和B比对中由序列比对程序ALIGN-2评为相同匹配的氨基酸残基的数目，其中Y是B中的氨基酸残基的总数目。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的％氨基酸序列同一性不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文使用的所有％氨基酸序列同一性值，如紧前面段落中所述，通过ALIGN-2计算机程序获得。术语“药物制剂”是指这样的制品，该制品的形式使得其中含有的活性成分的生物活性是有效的，并且不含有对制剂将施用于的受试者具有无法接受的毒性的另外组分。“药物学上可接受的载体”是指在药物制剂中除了活性成分外的对受试者无毒的成分。药物学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。如本文使用的，“治疗(treatment)”(及其语法变体，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指尝试改变所治疗个体的自然过程的临床干预，其可以执行用于预防或在临床病理学的过程中执行。治疗的期望效应包括但不限于，防止疾病的出现或复发、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态和缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明抗体用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)一般具有相似结构，其中每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个超变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等，KubyImmunology，第6版，W.H.FreemanandCo.，N.Y.(2007)第91页)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域，分别筛选互补VL或VH结构域文库，以分离结合该特定抗原的抗体。参见,例如，Portolano等，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson，T.等，Nature352(1991)624-628。如本文使用的，术语“载体”是指能够扩增与之连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够指导与之可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。“血脑屏障”(BBB)是指外周循环与脑和脊髓之间的生理屏障，其由脑毛细血管内皮质膜内的紧密连接形成，从而建立限制分子(甚至非常小的分子如尿素(60道尔顿))运输进脑中的紧密屏障。脑内的BBB、脊髓内的血液-脊髓屏障、和视网膜内的血液-视网膜屏障，是CNS内的连续毛细血管屏障，并且在本文中被统称为血脑屏障或BBB。BBB还包括血液-CSF屏障(脉络丛)，此屏障由室管膜细胞而不是毛细血管内皮细胞构成。“中枢神经系统”(CNS)指，控制身体功能的神经组织的复合体，并且包括脑和脊髓。“血脑屏障受体”(BBBR)是在脑内皮细胞上表达的细胞外膜连接的受体蛋白，其能够将分子运送通过BBB或者用于运送外源施用的分子。BBBR的实例包括但不限于转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体(IGF-R)、低密度脂蛋白受体(包括但不限于低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8))以及肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。示例性BBBR是转铁蛋白受体(TfR)。术语“脑效应物实体”是指，待跨BBB运输至脑的分子。效应物实体典型地具有希望递送至脑的特征性治疗活性。效应物实体包括神经疾病药物和细胞毒性剂，例如多肽和抗体，尤其是针对脑靶标的单克隆抗体或其片段。术语“单价结合实体”是指能够特异性地且以单价结合模式与BBBR结合的分子。本文中所述的血脑穿梭模块和/或缀合物的特征在于，存在单个单价结合实体单位，即本发明的血脑穿梭模块和/或缀合物包含正好一个单位的单价结合实体。单价结合实体包括但不限于多肽、全长抗体、抗体片段，包括Fab、Fab′、Fv片段、单链抗体分子，如例如单链Fab、scFv。单价结合实体可以是例如使用现有技术(如噬菌体展示或免疫)工程改造的支架蛋白。单价结合实体还可以是多肽。在某些实施方案中，单价结合实体包含CH2-CH3Ig结构域和针对血脑屏障受体的单链Fab(scFab)。所述scFab可以通过衔接物偶联至CH2-CH3Ig结构域的C-末端。在某些实施方案中，所述scFab针对转铁蛋白受体。术语“单价结合模式”是指与BBBR的特异性结合，其中单价结合实体和BBBR之间的相互作用通过一个单一表位而发生。由于单个表位相互作用点，单价结合模式可以阻断BBBR的任何二聚化/多聚化。单价结合模式可以阻止BBBR的胞内分选被变化。术语“表位”指，能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和或特定的电荷特性。表位是被抗体结合的抗原区域。“转铁蛋白受体”(TfR)是一种跨膜糖蛋白(具有约180,000Da的分子量)，其由两个二硫键键合的亚基(各自的表观分子量为约90,000Da)组成并参与脊椎动物中的铁摄取。在一个实施方案中，本文中的TfR是人TfR，其包含如在Schneider等(Nature311(1984)：675-678)中报道的氨基酸序列。术语“神经疾病”是指影响CNS和/或在CNS中具有病因的疾病或病症。示例性的CNS疾病或病症包括，但不限于，神经病、淀粉样变性、癌症、眼的疾病或病症、病毒或微生物感染、炎症、缺血、神经变性疾病、癫痫发作、行为疾病和溶酶体贮积病。为了本申请的目的，将理解CNS包括眼，其通常通过血液-视网膜屏障与身体的其它部分隔开。神经疾病的具体实例包括，但不限于，神经变性疾病(包括，但不限于，路易体病(Lewybodydisease)，脊髓灰质炎后综合征(postpoliomyelitissyndrome)，夏伊-德雷格综合征(Shy-Draegersyndrome)，橄榄体脑桥小脑萎缩(olivopontocerebellaratrophy)，帕金森病(Parkinson'sdisease)，多系统萎缩(multiplesystematrophy)，纹状体黑质变性(striatonigraldegeneration)，Tau蛋白病(tauopathies)(包括，但不限于，阿尔茨海默氏病(Alzheimerdisease)和核上性麻痹(supranuclearpalsy))，朊病毒病(priondiseases)(包括，但不限于，牛海绵状脑病(bovinespongiformencephalopathy)，痒病(scrapie)，克-雅综合征(Creutzfeldt-Jakobsyndrome)，库鲁病(kuru)，格-施-沙病(Gerstmann-Straussler-Scheinkerdisease)，慢性消耗性疾病(chronicwastingdisease)和致命性家族性失眠症(fatalfamilialinsomnia))，延髓性麻痹(bulbarpalsy)，运动神经元病(motorneurondisease)，和神经系统异变性疾病(nervoussystemheterodegenerativedisorders)(包括，但不限于，卡纳范病(Canavandisease)，亨廷顿病(Huntington'sdisease)，神经元蜡样脂褐素沉积症(neuronalceroid-lipofuscinosis)，亚历山大病(Alexander'sdisease)，图雷特综合征(Tourette'ssyndrome)，门克斯扭结发综合征(Menkeskinkyhairsyndrome)，科凯恩综合征(Cockaynesyndrome)，哈勒沃登-施帕茨综合征(Halervorden-Spatzsyndrome)，拉福拉病(laforadisease)，雷特综合征(Rettsyndrome)，肝豆状核变性(hepatolenticulardegeneration)，莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhansyndrome)，和翁-隆综合征(Unverricht-Lundborgsyndrome))，痴呆(dementia)(包括，但不限于，皮克病(Pick'sdisease)和脊髓小脑性共济失调(spinocerebellarataxia))，癌症(例如CNS和/或脑的癌症，包括源自身体其它位置的癌症的脑转移)。术语“神经疾病药物”是治疗一种或多种神经疾病的药物或治疗剂。神经疾病药物包括，但不限于，小分子化合物，抗体，肽，蛋白质，一种或多种CNS靶标的天然配体，一种或多种CNS靶标的天然配体的修饰形式，适体，抑制性核酸(即，小抑制性RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA))，核酶和小分子，或上述中任何一种的活性片段。示例性神经疾病药物描述于此并且包括，但不限于：抗体，适体，蛋白质，肽，抑制性核酸和小分子以及上任何一种的活性片段，它们本身是CNS抗原或靶标分子、或它们特异性识别和/或作用于(即，抑制，活化或检测)CNS抗原或靶标分子，如，但不限于，淀粉样蛋白前体蛋白或其部分，淀粉样蛋白β，β-分泌酶，γ-分泌酶，tau，α-突触核蛋白，帕金蛋白，亨廷顿蛋白，DR6，早老蛋白，ApoE，神经胶质瘤或其它CNS癌症标志物，以及神经营养蛋白。神经疾病药物以及可以使用它们治疗的对应疾病的非限制性实例：脑源神经营养因子(BDNF)，慢性脑损伤(神经发生)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，抗-表皮生长因子受体脑癌，(EGFR)-抗体，神经胶质细胞系衍生的神经因子，帕金森病，(GDNF)，脑衍生的神经营养因子(BDNF)，肌萎缩性侧索硬化，抑郁症，溶酶体酶，脑的溶酶体贮积疾病，睫状神经营养因子(CNTF)，肌萎缩性侧索硬化，神经调节蛋白-1，精神分裂症，抗-HER2抗体(例如曲妥珠单抗)，来自HER2-阳性癌症的脑转移。术语“成像剂”是具有一种或多种允许其的存在和/或位置被直接或间接检测到的性质的化合物。这样的成像剂的实例包括掺入允许检测的标记实体的蛋白和小分子化合物。术语“CNS抗原”或“脑靶标”是在CNS(包括脑)中表达的抗原和/或分子，其可以被抗体或小分子所靶向。这样的抗原和/或分子的实例包括，但不限于：β-分泌酶1(BACEl)、淀粉样蛋白β(Aβ)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)、Tau、载脂蛋白E4(ApoE4)、α-突触核蛋白、CD20、亨廷顿蛋白、朊病毒蛋白(PrP)、富含亮氨酸重复的激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、γ分泌酶、死亡受体6(DR6)、淀粉样蛋白前体蛋白(APP)、p75神经营养蛋白受体(p75NTR)和胱天蛋白酶6。在一个实施方案中，所述抗原是BACEl。术语“特异性地结合”表示抗体选择性地或优先地结合抗原。通常使用标准试验来测定结合亲和力，所述试验如Scatchard分析，或表面等离子体共振技术(例如，使用)。如本文中使用的术语“CH2-CH3Ig实体”是指从免疫球蛋白CH2或CH3结构域衍生出的蛋白实体。“CH2-CH3Ig实体”包含两个形成二聚体的“CH2-CH3”多肽。所述免疫球蛋白可以是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。在一个实施方案中，所述CH2-CH3Ig实体源自IgG免疫球蛋白，且在本文中被称作“CH2-CH3IgG实体”。该术语包括CH2-CH3结构域的天然序列和变体CH2-CH3结构域。在一个实施方案中，所述“CH2-CH3Ig实体”源自人重链CH2-CH3IgG结构域，所述结构域从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C-端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非在本文中另外说明，CH2-CH3结构域区域或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD，1991中所述。“缀合物”是与一个或多个异源分子缀合的本发明的融合蛋白，所述异源分子包括，但不限于，标记物、神经疾病药物或细胞毒性剂。本文中使用的“衔接物”是指化学衔接物或单链肽衔接物，其共价连接本文中所述的血脑屏障穿梭模块和/或融合蛋白和/缀合物的不同实体。例如，衔接物可以连接脑效应物实体与单价结合实体。例如，如果单价结合实体包含CH2-CH3Ig实体和针对血脑屏障受体的scFab，那么衔接物可以将scFab缀合至CH3-CH2Ig实体的C-末端。将脑效应物实体缀合至单价结合实体的衔接物(第一衔接物)和将scFab连接至CH2-CH3Ig结构域的C-末端的衔接物(第二衔接物)可以相同或不同。可以使用单链肽衔接物，其由一个至二十个通过肽键连接的氨基酸残基组成。在某些实施方案中，所述氨基酸选自二十种天然存在的氨基酸。在某些其它实施方案中，所述氨基酸中的一个或多个选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在其它实施方案中，所述衔接物是化学衔接物。在某些实施方案中，所述衔接物是单链肽衔接物，具有至少25个氨基酸残基长度的氨基酸序列，在一个优选实施方案中，具有32至50个氨基酸残基的长度。在一个实施方案中，肽衔接物是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝8、9或10)或(x＝4和n＝6、7或8)，在一个实施方案中，x＝4，n＝6或7，在一个优选实施方案中，x＝4，n＝7。在一个实施方案中，衔接物是(G4S)4(SEQIDNO:08)。在一个实施方案中，衔接物是(G4S)6G2(SEQIDNO:07)。可以使用多种化学衔接物进行缀合。例如，可以使用多种双官能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚胺酯的双官能衍生物(如，盐酸己二亚氨酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、二-重氮鎓衍生物(如二-(对重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性的氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，缀合单价结合实体或融合蛋白和脑效应物实体。衔接物可以是“可断裂的衔接物”，从而利于效应物实体在递送至脑后释放。例如，可以使用酸不稳定的衔接物、肽酶敏感的衔接物、光不稳定的衔接物、二甲基衔接物或含有二硫键的衔接物(Chari等，CancerRes.52(1992)127-131；美国专利号5,208,020)。共价缀合可以直接进行或通过衔接物进行。在某些实施方案中，直接缀合通过构建多肽融合物进行(即，通过编码针对BBBR的单价结合实体和效应物实体的两个基因的基因融合，和表达为单一多肽(链))。在某些实施方案中，直接缀合为，在针对BBBR的单价结合实体的两部分之一上的反应基团与脑效应物实体上的对应基团或受体之间形成共价键。在某些实施方案中，直接缀合为，将要缀合的两种分子之一进行修饰(即基因修饰)，以包括在适当条件下可以与要缀合的另一分子形成共价连接的反应基团(作为非限制性实例，巯基或羧基)。作为一个非限制性实例，可以将具有期望的反应基团(即，半胱氨酸残基)的分子(即，氨基酸)，引入到例如针对BBBR抗体的单价结合实体中，与神经药物形成二硫键。使核酸与蛋白共价缀合的方法也是本领域已知的(即，光交联，参见，例如，Zatsepin等，Russ.Chem.Rev.(俄罗斯化学综述)74(2005)77-95)。还可以使用多种衔接物进行缀合。例如，使用多种双官能蛋白偶联剂，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚胺酯的双官能衍生物(如盐酸己二亚氨酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、二-重氮鎓衍生物(如二-(对重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性的氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)，可以缀合单价结合实体和效应物实体。也可以使用包含通过肽键连接的一至二十个氨基酸残基的肽衔接物。在某些这样的实施方案中，氨基酸残基选自二十种天然存在的氨基酸。在某些其它这样的实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。衔接物可以是“可断裂的衔接物”，利于效应物实体在递送至脑后释放。例如，可以使用酸不稳定的衔接物、肽酶敏感的衔接物、光不稳定的衔接物、二甲基衔接物或含有二硫键的衔接物(Chari等，CancerRes.52(1992)127-131；美国专利号5,208,020)。II.组合物和方法在一个方面中，本发明部分基于如下发现：本文中所述的血脑屏障穿梭模块可以用于递送脑效应物实体穿过血脑屏障进入脑中。在某些实施方案中，血脑屏障穿梭模块包括特异性地结合血脑屏障受体(如转铁蛋白受体)的单价结合实体。本文中所述的血脑屏障穿梭模块例如可用于神经疾病的诊断或治疗，所述神经疾病如阿尔茨海默氏病、帕金森病、和具有帕金森病共病的阿尔茨海默氏病。A.示例性抗血脑屏障受体抗体特异性结合血脑屏障受体的单价结合实体可以就其结合和转胞吞特性来表征：-作为单价结合实体，对BBBR表达细胞的有效细胞结合，-作为单价结合实体，有效的体外转胞吞作用，-人-猕猴交叉反应性(例如，在BIAcore和FACS实验中)。在基于hCMEC/D3的试验中进行了转胞吞作用筛选。试验以脉冲追踪模式进行。用单价结合实体孵育hCMEC/D3脑内皮细胞1小时，此后洗涤并在洗涤后0小时和4小时测定以下参数：i)在加样阶段期间，吸收至细胞中的单价结合实体量，ii)加样和洗涤后4小时，基底外侧的单价结合实体量；iii)加样和洗涤后4小时，顶端的单价结合实体量；iv)加样和洗涤后0小时和4小时，细胞中的单价结合实体量(通过细胞裂解)；v)加样和洗涤后0小时和4小时，单价结合实体的总量。为了合适作为本文中所述的血脑屏障穿梭模块中的单价结合实体，单体结合实体必需i)被hCMEC/D3细胞吸收(胞吞作用)，ii)运送到hCMEC/D3细胞外(胞吐作用)，和iii)在hCMEC/D3细胞内是稳定的(没有向内体的运送降解或低的运送降解)。因此，在一个实施方案中，在基于hCMEC/D3的试验中单价结合实体可以表征为：i)在一个小时加样期中(实质性地)吸收至hCMEC/D3细胞中，ii)加样期和洗涤步骤后在洗涤后的4小时内，释放至顶端和/或基底外侧区室中，和iii)低(胞内)降解速率。在一个实施方案中，加样浓度为约2.67μg/mL单价结合实体，持续一小时。已经发现，为了合适作为本文中所述的血脑屏障穿梭模块的单价结合实体，单价结合实体必须在上述基于hCMEC/D3的试验中显示出以下阈值：i)加样期中吸收至细胞中的单价结合实体量为400pg或更高，ii)加样和洗涤后4小时基底外侧的单价结合实体量为100pg或更高，iii)加样和洗涤后4小时顶端的单价结合实体量为150pg或更高。小鼠抗人转铁蛋白受体抗体128.1(对于可变区序列，参见WO93/10819和SEQIDNO:11和12)可以作为参照。在这种情况中，为了合适作为本文中所述的血脑屏障穿梭模块的单价结合实体，单价结合实体必须在上述基于hCMEC/D3的试验中显示出以下阈值：i)在加样期中吸收至细胞中的单价结合实体量为抗体128.1加样的20％或更多，ii)加样和洗涤后4小时，单价结合实体的基底外侧量为抗体128.1的基底外侧量的15％或更多；和iii)加样和洗涤后4小时，单价结合实体的顶端量为抗体128.1的顶端量的15％或更多。如下进行基于hCMEC/D3的试验(这是本文描述的所有方面的一个实施方案)：用于hCMEC/D3的培养基和补充剂(参见WO2006/056879和Weksler，B.B.等，FASEBJ.19(2005)1872-1874)获自Lonza。在含有2.5％FBS、四分之一供应的生长因子、且完全补充了供应的氢化可的松、庆大霉素和抗坏血酸的EBM2培养基中，将/可以将hCMEC/D3细胞(23-29传代)在胶原蛋白包被的盖玻片上(显微镜)或在烧瓶中培养至汇合。对于所有转胞吞试验，将高密度孔(1×108孔/cm2)PET膜滤器插入物(0.4μm孔径，12mm直径)用于/可以用于12-孔细胞培养板中。对于顶端和基底外侧室，计算培养基体积，分别为400μL和1600μL。用/可以用大鼠尾胶原蛋白I(7.5μg/cm2)接着用纤连蛋白(5μg/mL)，包被滤器插入物的顶端室，每次孵育在RT下持续1h。在EBM2培养基中10-12天，将hCMEC/D3细胞生长/可以生长至汇合单层(～2×105细胞/cm2)。在试验前，空滤器在/可以在含有1％BSA的PBS中封闭1小时或过夜(o/n)，然后在EBM2中校准至少1小时。在无血清EBM2培养基(否则如本文其它地方描述进行重构)中进行试验(对于试验方案，参见图1)。在试验当天，对细胞实行血清饥饿60min，以耗尽所讨论的血脑屏障受体的天然配体。用所讨论的单克隆抗体(单价结合实体)在37℃在顶端孵育含有或不含细胞(但在完全培养基中封闭过夜)的滤器插入物1小时。在顶端(400μL)和基底外侧(1600μL)在无血清培养基中在室温(RT)洗涤单层三次，每次3-5min。将预先温热的培养基加入顶端室中，并且将滤器转移至含有1600μL预先温热的培养基的新12孔板(用含有1％BSA的PBS封闭过夜)中。在这点，将含有或不含细胞的滤器在500μLRIPA缓冲液中裂解，以测定特定抗体(单价结合实体)吸收。剩余的滤器在37℃或4℃孵育，并且在不同时间点收集样品以测定抗体(单价结合实体)的顶端和/或基底外侧释放。可以使用高灵敏IgGELISA来定量样品中的抗体含量(参见实施例10)。对于每个时间点，应当从两个空滤器和三个滤器细胞培养物产生数据。69种抗转铁蛋白受体抗体的结果显示于下表中。抗体128.1用作参照。抗体299显示出705pg的转胞吞加样，4小时后在基底外侧区室中可以看到170pg(＝加样的24％)，在顶端区室中可以看到294pg(＝加样的42％)。抗体494显示出3510pg的转胞吞加样，4小时后在基底外侧区室中可以看到748pg(＝加样的21％)，在顶端区室中可以看到1503pg(＝加样的43％)。满足如上所列标准的抗体是本发明的实施方案。因此，本文的一个方面是抗转铁蛋白受体抗体或其转铁蛋白受体结合片段，其包含(1)具有SEQIDNO:13的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(2)具有SEQIDNO:15的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:16的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(3)具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:18的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(4)具有SEQIDNO:19的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:20的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(5)具有SEQIDNO:21的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:22的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(6)具有SEQIDNO:23的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:24的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(7)具有SEQIDNO:25的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:26的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(8)具有SEQIDNO:27的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:28的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(9)具有SEQIDNO:29的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:30的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(10)具有SEQIDNO:31的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:32的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(11)具有SEQIDNO:33的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:34的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(12)具有SEQIDNO:35的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:36的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(13)具有SEQIDNO:37的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:38的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(14)具有SEQIDNO:39的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:40的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(15)具有SEQIDNO:41的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:42的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(16)具有SEQIDNO:43的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:44的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(17)具有SEQIDNO:45的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:47的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(18)具有SEQIDNO:47的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:48的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(19)具有SEQIDNO:49的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:50的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(20)具有SEQIDNO:51的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:52的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(21)具有SEQIDNO:53的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:54的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(22)具有SEQIDNO:55的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:56的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(23)具有SEQIDNO:57的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:58的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(24)具有SEQIDNO:59的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:60的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(25)具有SEQIDNO:61的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:62的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(26)具有SEQIDNO:63的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:64的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(27)具有SEQIDNO:65的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:66的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(28)具有SEQIDNO:67的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:68的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(29)具有SEQIDNO:69的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:70的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(30)具有SEQIDNO:71的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:72的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(31)具有SEQIDNO:73的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:74的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(32)具有SEQIDNO:75的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:76的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(33)具有SEQIDNO:77的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:78的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(34)具有SEQIDNO:79的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:80的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(35)具有SEQIDNO:81的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:82的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(36)具有SEQIDNO:83的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:84的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(37)具有SEQIDNO:85的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:86的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(38)具有SEQIDNO:87的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:88的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(39)源自具有SEQIDNO:89的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和具有SEQIDNO:90的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(40)具有SEQIDNO:91的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:92的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(41)具有SEQIDNO:93的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:94的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(42)具有SEQIDNO:95的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:96的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(43)具有SEQIDNO:97的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:98的氨基酸序列的轻链可变结构域。本文的一个优选方面是包含具有SEQIDNO:23的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:24的氨基酸序列的轻链可变结构域的抗转铁蛋白受体抗体或其转铁蛋白受体结合片段。本文中所述的一个优选方面是包含具有SEQIDNO:91的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQIDNO:92的氨基酸序列的轻链可变结构域的抗转铁蛋白受体抗体或其转铁蛋白受体结合片段。代表性的氨基酸序列描述于下表中。本文中所述的一个方面是人源化抗转铁蛋白受体抗体或其转铁蛋白受体结合片段，其包含(1)源自具有SEQIDNO:13的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(2)源自具有SEQIDNO:15的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:16的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(3)源自具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:18的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(4)源自具有SEQIDNO:19的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:20的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(5)源自具有SEQIDNO:21的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:22的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(6)源自具有SEQIDNO:23的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:24的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(7)源自具有SEQIDNO:25的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:26的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(8)源自具有SEQIDNO:27的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:28的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(9)源自具有SEQIDNO:29的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:30的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(10)源自具有SEQIDNO:31的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:32的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(11)源自具有SEQIDNO:33的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:34的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(12)源自具有SEQIDNO:35的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:36的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(13)源自具有SEQIDNO:37的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:38的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(14)源自具有SEQIDNO:39的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:40的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(15)源自具有SEQIDNO:41的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:42的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(16)源自具有SEQIDNO:43的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:44的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(17)源自具有SEQIDNO:45的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:46的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(18)源自具有SEQIDNO:47的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:48的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(19)源自具有SEQIDNO:49的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:50的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(20)源自具有SEQIDNO:51的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:52的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(21)源自具有SEQIDNO:53的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:54的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(22)源自具有SEQIDNO:55的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:56的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(23)源自具有SEQIDNO:57的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:58的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(24)源自具有SEQIDNO:59的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:60的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(25)源自具有SEQIDNO:61的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:62的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(26)源自具有SEQIDNO:63的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:64的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(27)源自具有SEQIDNO:65的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:66的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(28)源自具有SEQIDNO:67的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:68的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(29)源自具有SEQIDNO:69的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:70的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(30)源自具有SEQIDNO:71的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:72的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(31)源自具有SEQIDNO:73的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:74的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(32)源自具有SEQIDNO:75的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:76的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(33)源自具有SEQIDNO:77的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:78的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(34)源自具有SEQIDNO:79的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:80的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(35)源自具有SEQIDNO:81的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:82的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(36)源自具有SEQIDNO:83的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:84的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(37)源自具有SEQIDNO:85的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:86的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(38)源自具有SEQIDNO:87的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:88的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(39)源自具有SEQIDNO:89的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:90的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(40)源自具有SEQIDNO:91的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:92的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(41)源自具有SEQIDNO:93的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:94的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(42)源自具有SEQIDNO:95的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:96的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，或(43)源自具有SEQIDNO:97的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:98的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域。本文中所述的一个优选方面是包含源自具有SEQIDNO:23的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:24的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域的人源化抗转铁蛋白受体抗体或其转铁蛋白受体结合片段。本文中所述的一个方面是人源化抗人转铁蛋白受体抗体，其包括(a)包含SEQIDNO:109的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:110的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:112的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包括(d)包含SEQIDNO:113的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:114的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:115的氨基酸序列的HVR-L3。本文中所述的一个方面是人源化抗人转铁蛋白受体抗体，其包括(a)包含SEQIDNO:109的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:111的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:112的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包括(d)包含SEQIDNO:113的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:114的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:115的氨基酸序列的HVR-L3。在一个方面中，本发明提供抗转铁蛋白受体抗体，其包括至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQIDNO:109的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:110的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:112的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:113的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:114的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:115的氨基酸序列的HVR-L3。在一个方面中，本发明提供包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列的抗体：(a)包括SEQIDNO:109的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包括SEQIDNO:110的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包括SEQIDNO:112的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包括包含SEQIDNO:112的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包括包含SEQIDNO:112的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:115的氨基酸序列的HVR-L3。在进一步的实施方案中，抗体包括包含SEQIDNO:112的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:115的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQIDNO:111的氨基酸序列的HVR-H2。在进一步的实施方案中，抗体包括(a)包含SEQIDNO:109的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:111的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:112的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个方面中，本发明提供包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列的抗体：(a)包含SEQIDNO:113的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:114的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:115的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包括(a)包含SEQIDNO:113的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:114的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:115的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个方面中，本发明的抗体包括(a)VH结构域，其包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列：(i)包含SEQIDNO:109的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQIDNO:110的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQIDNO:112的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，其包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列：(i)包含SEQIDNO:113的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQIDNO:114的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQIDNO:115的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个方面中，本发明提供抗体，其包括(a)包含SEQIDNO:109的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:110的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:112的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:113的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:114的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:115的氨基酸序列的HVR-L3。本文中所述的一个优选方面是包含源自具有SEQIDNO:91的氨基酸序列的重链可变结构域的人源化重链可变结构域和源自具有SEQIDNO:92的氨基酸序列的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域的人源化抗转铁蛋白受体抗体或其转铁蛋白受体结合片段。本文中所述的一个方面是人源化抗人转铁蛋白受体抗体，其包括(a)包含SEQIDNO:116的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:117的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:119的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包含(d)包含SEQIDNO:120的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:121的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:122的氨基酸序列的HVR-L3。本文中所述的一个方面是人源化抗人转铁蛋白受体抗体，其包括(a)包含SEQIDNO:116的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:118的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:119的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包含(d)包含SEQIDNO:120的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:121的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:122的氨基酸序列的HVR-L3。在一个方面中，本发明提供抗转铁蛋白受体抗体，其包括选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQIDNO:116的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:117的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:119的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:120的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:121的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:122的氨基酸序列的HVR-L3。在一个方面中，本发明提供包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列的抗体：(a)包含SEQIDNO:116的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:117的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:119的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包括包含SEQIDNO:119的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包括包含SEQIDNO:119的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQIDNO:122的氨基酸序列的HVR-L3。在进一步的实施方案中，抗体包括包含SEQIDNO:119的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:122的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQIDNO:118的氨基酸序列的HVR-H2。在进一步的实施方案中，抗体包括(a)包含SEQIDNO:116的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:118的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:119的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个方面中，本发明提供包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列的抗体：(a)包含SEQIDNO:120的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:121的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:122的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包括(a)包含SEQIDNO:120的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:121的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:122的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个方面中，本发明的抗体包括(a)VH结构域，其包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列：(i)包含SEQIDNO:116的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQIDNO:117的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQIDNO:119的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，其包括选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列：(i)包含SEQIDNO:120的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQIDNO:121的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQIDNO:122的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个方面中，本发明提供抗体，其包括(a)包含SEQIDNO:116的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:117的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:119的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:120的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:121的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:122的氨基酸序列的HVR-L3。本文中所述的一个方面是转铁蛋白穿梭模块，其包括作为脑效应物实体的全长IgG抗体、衔接物和一个作为单价结合实体的结合转铁蛋白受体的scFab，其中scFab通过衔接物与IgG抗体的重链之一的Fc-区的C-末端缀合。本文中所述的一个方面是转铁蛋白穿梭模块，其包括作为脑效应物实体的全长IgG抗体、衔接物和一个作为单价结合实体的结合转铁蛋白屏障受体的scFv，其中scFv通过衔接物与IgG抗体的重链之一的Fc-区的C-末端缀合。在一个优选的实施方案中，单价结合实体包括SEQIDNO:109、110、112、113、114和115，或SEQIDNO:116、117、119、120、121和122的HVR。在进一步的方面中，根据以上任一个实施方案的抗转铁蛋白受体抗体可以单独或组合地并入以下部分1-6中所述的任何特征。1.抗体亲和力在一个实施方案中，Kd通过放射性标记抗原结合测定法(RIA)进行测量。在一个实施方案中，RIA用目的抗体的Fab形式及其抗原进行。例如，Fab对于抗原的溶液结合亲和力通过下述进行测量：在滴定系列的未标记抗原的存在下用最低浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，随后用抗Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原(参见，例如Chen等，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。为了建立用于该测定法的条件，用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕获抗Fab抗体(CappelLabs)包被多孔板(ThermoScientific)过夜，并且随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)阻断二到五小时。在非吸附性平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与系列稀释的目的Fab混合(例如，与Presta等，CancerRes.57(1997)4593-4599中的抗VEGF抗体Fab-12的评价一致)。目的Fab随后孵育过夜；然而，孵育可以继续更长时间(例如约65小时)，以确保达到平衡。其后，将混合物转移至捕获平板，用于在室温下孵育(例如一小时)。随后去除溶液并且将平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20洗涤八次。平板干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将平板在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数十分钟。选择给出小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度，用于竞争结合测定法中。根据另一个实施方案，Kd使用表面等离子体共振测定法测量。例如，在25℃使用-2000或-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)，以～10反应单位(RU)使用固定化抗原CM5芯片进行测定。在一个实施方案中，根据供应商的说明书，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠，pH4.8稀释至5μg/ml(～0.2μM)，之后以5μl/分钟的流速注射，以获得约10反应单位(RU)的偶联蛋白质。在抗原注射后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注射在具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍系列稀释的Fab(0.78nM-500nM)。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(EvaluationSoftware版本3.2)，计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比值(参见，例如，Chen等,J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。如果通过以上表面等离子体共振测定法结合速率超过106M-1s-1，则结合速率可以通过使用荧光猝灭技术进行测定，所述荧光猝灭技术测量在递增浓度的抗原的存在下在25℃在PBS，pH7.2中20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或降低，其中测量可以使用例如分光光度计，例如配备停流的分光光度计(AvivInstruments)或具有搅拌比色杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)。2.抗体片段在特定实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括，但不限于，Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段及下文描述的其他片段。关于一些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等，Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见例如，Pluckthun,A.，见ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies(单克隆抗体的药理学)，113卷，Rosenburg和Moore(编辑)，Springer-Verlag，NewYork(1994)，pp.269-315；也参见WO93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见US5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如，EP404,097；WO1993/01161；Hudson,P.J.等，Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448。三抗体和四抗体也在Hudson,P.J.等，Nat.Med.9(2003)129-134中描述。单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或者轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在特定实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，US6,248,516)。抗体片段可以通过多种技术进行制备，包括但不限于，完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文描述的。3.嵌合和人源化抗体在特定实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。特定嵌合抗体例如在US4,816,567；和Morrison，S.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物，如猴的可变区)和人恒定区。在进一步的实例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中类或亚类已相对于亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。在特定实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化，以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还可以包含人恒定区的至少部分。在一些实施方案中，在人源化抗体中的一些FR残基被置换为来自非人抗体(例如从其产生HVR残基的抗体)的相应残基，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。人源化抗体及其制备方法例如在Almagro,J.C.和Fransson,J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633中综述，并且例如在下述文献中进一步描述：Riechmann,I.等，Nature332(1988)323-329；Queen,C.等，Proc.NatlAcad.Sci.USA86(1989)10029-10033；US5,821,337，US7,527,791，US6,982,321和US7,087,409；Kashmiri,S.V.等，Methods36(2005)25-34(描述特异性决定区(SDR)嫁接)；Padlan,E.A.，Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重建”(resurfacing))；Dall’Acqua,W.F.等，Methods36(2005)43-60(描述“FR改组”)；和Osbourn,J.等，Methods36(2005)61-68和Klimka,A.等，Br.J.Ccancer，83(2000)252-260(描述“引导选择”方法到FR改组)。可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”法选择的构架区(参见，例如，Sims,M.J.等J.Immumol.151:2296(1993))；源自特定亚组的轻或重链可变区的人抗体共有序列的构架区(参见，例如，Carter,P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285；和Presta，L.G.等，J.Immumol.，151(1993)2623)；人成熟(体细胞成熟的)构架区或人种系构架区(参见，例如，Almagro,J.C.和Fransson,J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和源自筛选FR文库的构架区(参见，例如，Baca,M.等，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等，J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。4.文库衍生的抗体本发明的抗体可以通过在组合文库中筛选具有一种或多种期望活性的抗体进行分离。例如，本领域已知多种方法可以用于生成噬菌体展示文库且在此类文库中筛选具有所需结合特征的抗体。此类方法综述于例如Hoogenboom,H.R.等，MethodsinMolecularBiology178(2001)1-37，并进一步描述于例如McCafferty,J.等，Nature348(1990)552-554；Clackson,T等，Nature352(1991)624-628；Marks,J.D.等，J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.和Bradbury,A.，MethodsinMolecularBiology248(2003)161-175；Sidhu,S.S.等，J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.等，J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(2004)12467-12472和LEE,C.V.等，J.Immumol.Methods284(2004)119-132中。在特定噬菌体展示方法中，VH和VL基因库通过聚合酶链反应(PCR)分开克隆，且随机重组在噬菌体文库中，随后可以如Winter,G.等，Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中所述在所述噬菌体文库中筛选抗原结合性噬菌体。噬菌体一般以单链Fv(scFv)片段的形式或以Fab片段的形式展示抗体片段。来自免疫源的文库提供了针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。可替代地，可以不经任何免疫接种，克隆(例如从人中)幼稚库(naiverepertoire)，以提供针对广泛的非自身以及自身抗原的单个抗体来源，如Griffiths,A.D.等，EMBOJ.12(1993)725-734描述的。最后，幼稚文库还可以通过下述方式合成制备：从干细胞中克隆未重排的V基因区段，且使用含有随机序列的PCR引物以编码高可变CDR3区，在体外实现重排，如通过Hoogenboom,H.R.和Winter,G.，J.Mol.Biol.,227(1992)381-388描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括，例如：US5,750,373和US2005/0079574，US2005/0119455，US2005/0266000，US2007/0117126，US2007/0160598，US2007/0237764，US2007/0292936和US2009/0002360。5.多特异性抗体在特定实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是具有针对至少两个不同位点的结合特异性的单克隆抗体。在特定实施方案中，结合特异性之一针对转铁蛋白受体，并且另一个针对任何其他抗原。双特异性抗体还可以用于将细胞毒素剂定位至表达转铁蛋白受体的细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共同表达(参见Milstein,C和Cuello,A.C.，Nature305(1983)537-540，WO93/08829和Traunecker,A.等，EMBOJ.10(1991)3655-3659和“杵进臼”工程(参见，例如，US5,731,168)。多特异性抗体还可以通过下述进行制备：工程化静电转向效应(electrostaticsteeringeffects)，用于制备抗体Fc-异二聚体分子(WO2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，US4,676,980和Brennan,M.等，Science，229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等,S.A.等，J.Immunol.148(1992)1547-1553；使用“双抗体”技术用于制备双特异性抗体片段(参见，例如，Holliger,P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448)；使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber,M等，J.Immumol.152(1994)5368-5374)；和制备三特异性抗体，如例如Tutt,A.等J.Immumol.147(1991)60-69中所述的。具有三个或更多个功能性抗原结合位点的改造抗体，包括章鱼抗体(“Octopusantibodies”)，也包括在本文中(参见，例如US2006/0025576A1)。本文中的抗体或片段还包括“双重作用Fab”或“DAF”，其包含与转铁蛋白受体以及另一个不同抗原结合的抗原结合位点(参见，例如US2008/0069820)。本文中的抗体或片段还包括WO2009/080251，WO2009/080252，WO2009/080253，WO2009/080254，WO2010/112193，WO2010/115589，WO2010/136172，WO2010/145792和WO2010/145793中所述的多特异性抗体。在本文中所述所有方面的一个实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体是双特异性抗体。本文中所述的一个方面是二价、双特异性抗体，其包括a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此替代，其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。a)的抗体不含b)所述的修饰，且a)的重链和轻链是分离的链。在b)的抗体中在轻链内可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替代，和在重链内可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替代。在一个实施方案中，i)在a)的第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被带正电荷的氨基酸置换，并且其中在a)的第一重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸(根据Kabat编号)被带负电荷的氨基酸置换，或ii)在b)的第二轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被带正电荷的氨基酸置换，并且其中在b)的第二重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸(根据KabatEU索引编号)被带负电荷的氨基酸置换。在一个优选的实施方案中i)在a)的第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)置换(在一个优选的实施方案中，独立地被赖氨酸(K)或精氨酸(R)置换)，并且其中在a)的第一重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸(根据KabatEU索引编号)独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)置换，或ii)在b)的第二轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)置换(在一个优选的实施方案中，独立地被赖氨酸(K)或精氨酸(R)置换)，并且其中在b)的第二重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸(根据KabatEU索引编号)独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)置换。在一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据KabatEU索引编号)被K置换。在一个实施方案中，在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据KabatEU索引编号)被E置换。在一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸被K置换，并且在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸被E置换(根据KabatEU索引编号)。在一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中位置124和123的氨基酸被K置换，并且其中在第二轻链的恒定结构域CH1中位置147和213的氨基酸被E置换，并且在第一轻链的可变结构域VL中位置38的氨基酸被K置换，在第一重链的可变结构域VH中位置39的氨基酸被E置换，在第二重链的可变结构域VL中位置38的氨基酸被K置换，且在第二轻链的可变结构域VH中位置39的氨基酸被E置换(根据KabatEU索引编号)。本文中所述的一个方面是二价、双特异性抗体，其包括a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此替代，并且其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替代，其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。a)的抗体不含b)所述的修饰，且a)的重链和轻链是分离的链。在b)的抗体中在轻链内可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替代，并且恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替代；和在重链内可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替代，并且恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替代。本文中所述的一个方面是二价、双特异性抗体，其包括a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替代，其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。a)的抗体不含b)所述的修饰，且a)的重链和轻链是分离的链。在b)的抗体中在轻链内恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替代；和在重链内恒定重链结构域CH1被所述抗体的轻链结构域CL替代。本文中所述的一个方面是多特异性抗体，其包括a)特异性结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，和b)特异性结合一个至四个其它抗原(即，第二和/或第三和/或第四和/或第五抗原，优选特异性结合一个其它抗原，即第二抗原)的、一个，两个，三个或四个单链Fab片段，其中所述b)的单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的重链或轻链的C-或N-端与所述a)的全长抗体融合，其中第一抗原或其它抗原之一是人转铁蛋白受体。在一个实施方案中，一个或两个结合第二抗原的相同单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的重或轻链的C-端与所述全长抗体融合。在一个实施方案中，一个或两个结合第二抗原的相同单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的重链的C-端与所述全长抗体融合。在一个实施方案中，一个或两个结合第二抗原的相同单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的轻链的C-端与所述全长抗体融合。在一个实施方案中，两个结合第二抗原的相同单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的每条重链或轻链的C-端与所述全长抗体融合。在一个实施方案中，两个结合第二抗原的相同单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的每条重链的C-端与所述全长抗体融合。在一个实施方案中，两个结合第二抗原的相同单链Fab片段通过肽衔接物在所述全长抗体的每条轻链的C-端与所述全长抗体融合。本文中所述的一个方面是三价、双特异性抗体，其包括a)特异性结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，b)第一多肽，由以下组成ba)抗体重链可变结构域(VH)或bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，其中所述第一多肽用其VH结构域的N-端通过肽衔接物与所述全长抗体的两条重链之一的C-端融合，c)第二多肽，由以下组成ca)抗体轻链可变结构域(VL)或cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)其中所述第二多肽用其VL结构域的N-端通过肽衔接物与所述全长抗体的两条重链的另一条的C-端融合，且其中第一多肽的抗体重链可变结构域(VH)和第二多肽的抗体轻链可变结构域(VL)一起形成特异性结合第二抗原的抗原结合位点，且其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。在一个实施方案中，通过在以下位置之间引入二硫键，使得b)的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和c)的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过链间二硫桥连接和稳定：i)重链可变结构域位置44至轻链可变结构域位置100，或ii)重链可变结构域位置105至轻链可变结构域位置43，或iii)重链可变结构域位置101至轻链可变结构域位置100(总是根据KabatEU索引编号)。引入非天然的二硫桥用于稳定的技术描述于例如WO94/029350，Rajagopal,V.等，Prot.Eng.(1997)1453-59；Kobayashi,H.等，NuclearMedicine&Biology,Vol.25,(1998)387-393；或Schmidt,M.等，Oncogene(1999)181711-1721中。在一个实施方案中，b)和c)的多肽的可变结构域之间的任选二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，b)和c)的多肽的可变结构域之间的任选二硫键在重链可变结构域位置105和轻链可变结构域位置43之间(编号总是根据KabatEU索引)。在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间不具有所述任选二硫化物稳定的三价、双特异性抗体。本文中所述的一个方面是三特异性或四特异性抗体，其包括a)特异性结合第一抗原的全长抗体的第一轻链和第一重链，和b)特异性结合第二抗原的全长抗体的第二(修饰)轻链和第二(修饰)重链，其中可变结构域VL和VH彼此替代，和/或其中恒定结构域CL和CH1彼此替代，和c)其中特异性结合一个或两个其它抗原(即，结合第三和/或第四抗原)的一个至四个抗原结合肽通过肽衔接物与a)和/或b)的轻链或重链的C-或N-末端融合，其中第一抗原或第二抗原或其它抗原之一是人转铁蛋白受体。a)的抗体不含b)所述的修饰，且a)的重链和轻链是分离的链。在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)下包括特异性结合一个或两个其它抗原的一个或两个抗原结合肽。在一个实施方案中，抗原结合肽选自scFv片段和scFab片段。在一个实施方案中，抗原结合肽是scFv片段。在一个实施方案中，抗原结合肽是scFab片段。在一个实施方案中，抗原结合肽与a)和/或b)的重链的C-端融合。在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)下包括特异性结合一个其它抗原的一个或两个抗原结合肽。在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)下包括特异性结合第三抗原的两个相同的抗原结合肽。在一个优选的实施方案中，这两个相同的抗原结合肽通过相同的肽衔接物与a)和b)的重链的C-端融合。在一个优选的实施方案中，这两个相同的抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)下包括特异性结合第三和第四抗原的两个抗原结合肽。在一个实施方案中，所述两个抗原结合肽通过相同的肽衔接物与a)和b)的重链的C-端融合。在一个实施方案中，所述两个抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。本文中所述的一个方面是双特异性、四价抗体，其包括a)特异性地结合第一抗原的抗体的两条轻链和两条重链(并且包括两个Fab片段)，b)特异性地结合第二抗原的另外两个抗体Fab片段，其中所述另外的Fab片段通过肽衔接物与a)的重链的C-或N-端融合，且其中在Fab片段中，进行以下修饰i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，和/或恒定结构域CL和CH1彼此替代，或ii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，且恒定结构域CL和CH1彼此替代，且在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，或恒定结构域CL和CH1彼此替代，或iii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，或恒定结构域CL和CH1彼此替代，且在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，且恒定结构域CL和CH1彼此替代，或iv)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，且在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替代，或v)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替代，且在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。在一个实施方案中，所述另外的Fab片段通过肽衔接物与a)的重链的C-端，或与a)的重链的N-端融合。在一个实施方案中，所述另外的Fab片段通过肽衔接物与a)的重链的C-端融合。在一个实施方案中，所述另外的Fab片段通过肽衔接物与a)的重链的N-端融合。在一个实施方案中，在Fab片段中，进行以下修饰：i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，和/或恒定结构域CL和CH1彼此替代。在一个实施方案中，在Fab片段中，进行以下修饰：i)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，和/或恒定结构域CL和CH1彼此替代。在一个实施方案中，在Fab片段中，进行以下修饰：i)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替代。在一个实施方案中，在Fab片段中，进行以下修饰：i)在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替代，和/或恒定结构域CL和CH1彼此替代。在一个实施方案中，在Fab片段中，进行以下修饰：i)在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替代。本文中所述的一个方面是双特异性、四价抗体，其包括：a)第一抗体的(修饰)重链，其特异性地结合第一抗原并且包括第一VH-CH1结构域对，其中所述第一抗体的第二VH-CH1结构域对的N端通过肽衔接物与所述重链的C-端融合，b)a)的所述第一抗体的两条轻链，c)第二抗体的(修饰)重链，其特异性地结合第二抗原并且包括第一VH-CL结构域对，其中所述第二抗体的第二VH-CL结构域对的N端通过肽衔接物与所述重链的C-端融合，和d)c)的所述第二抗体的两条(修饰)轻链，每条包含CL-CH1结构域对，其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。本文中所述的一个方面是双特异性抗体，其包括a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链，和b)特异性结合第二抗原的第二全长抗体的重链和轻链，其中重链的N-端通过肽衔接物连接轻链的C-端，其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。a)的抗体不含b)所述的修饰，并且重链和轻链是分离的链。本文中所述的一个方面是双特异性抗体，其包括a)特异性地结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，和b)特异性地结合第二抗原的Fv片段，其包括VH2结构域和VL2结构域，其中两个结构域通过二硫桥彼此连接，其中只有VH2结构域或VL2结构域通过肽衔接物与特异性地结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链融合，其中第一抗原或第二抗原是人转铁蛋白受体。在双特异性中，a)的重链和轻链是分离的链。在一个实施方案中，VH2结构域或VL2结构域中的另一个不通过肽衔接物与特异性地结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链融合。在本文中所述的所有方面中，第一轻链包括VL结构域和CL结构域，而第一重链包括VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在所有方面的一个实施方案中，本文中所述的抗体是多特异性抗体，其需要至少两条重链多肽的异二聚化，并且其中抗体特异性地结合人转铁蛋白受体和第二非人转铁蛋白受体抗原。为了支持异二聚化而用于CH3修饰的几种方法已经描述于例如WO96/27011，WO98/050431，EP1870459，WO2007/110205，WO2007/147901，WO2009/089004，WO2010/129304，WO2011/90754，WO2011/143545，WO2012/058768，WO2013/157954，WO2013/096291中，将其引用包括在本文中。典型地，在本领域已知的方法中，以互补的方式，将第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域进行工程化，使得包括一个工程化CH3结构域的重链不再能与相同结构的另一重链发生同二聚化(例如，CH3工程化的第一重链不再与另一CH3工程化的第一重链同二聚化；和CH3工程化的第二重链不再与另一CH3工程化的第二重链同二聚化)。由此迫使包括一个工程化CH3结构域的重链与包括以互补方式工程化的CH3结构域的另一重链异二聚化。对于本发明的该实施方案，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域以互补方式通过氨基酸置换进行工程化，从而迫使第一重链和第二重链异二聚化，而第一重链和第二重链不再能发生同二聚化(例如，出于空间原因)。考虑以上引用和包括的本领域已知的用于支持重链异二聚化的不同方法，作为不同替换方案用于根据本发明的多特异性抗体，其中所述抗体包括源自特异性地结合第一抗原的第一抗体的“非交叉Fab区”(non-crossedFabregion)、和源自特异性地结合第二抗原的第二抗体的“交叉Fab区”(crossedFabregion)，结合以上针对本发明描述的特定氨基酸置换。本文中所述的多特异性抗体的CH3结构域可以通过“杵进臼”技术来改变，所述技术详细描述于例如，WO96/027011，Ridgway,J.B.等，ProteinEng.9(1996)617-621；和Merchant,A.M.等，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681的几个实例中。在这种方法中，两个CH3结构域的相互作用表面被改变，以提高含有这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域的每一个都可以是“杵”，而另一个是“臼”。二硫桥的引入可以进一步稳定该异二聚体(Merchant,A.M.等，NatureBiotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并提高产量。在一个优选的实施方案中，本文中所述的多特异性抗体在“杵链”的CH3结构域中包括T366W突变，在“臼链”的CH3结构域中包括T366S、L368A、Y407V突变(编号根据KabatEU索引)。还可以使用在CH3结构域之间的另外链间二硫桥(Merchant,A.M.等，NatureBiotech.16(1998)677-681)，例如，通过将Y349C突变引入“杵链”的CH3结构域中，并将E356C突变或S354C突变引入“臼链”的CH3结构域中。因此，在另一个优选的实施方案中，本文中所述的多特异性抗体在两个CH3结构域之一中包括Y349C和T366W突变，而在两个CH3结构域的另一个中包括E356C、T366S、L368A和Y407V突变，或本文中所述的多特异性抗体在两个CH3结构域之一中包括Y349C和T366W突变，而在两个CH3结构域的另一个中包括S354C、T366S、L368A和Y407V突变(一个CH3结构域中的该额外Y349C突变和另一个CH3结构域中的该额外E356C或S354C突变形成链间二硫桥)(编号根据KabatEU索引)。备选地或额外地，可以使用描述于EP187459A1中的其他杵进臼技术。在一个实施方案中，本文中所述的多特异性抗体在“杵链”的CH3结构域中包括R409D和E370K突变，而在“臼链”的CH3结构域中包括D399K和E357K突变(编号根据KabatEU索引)。在一个实施方案中，本文中所述的多特异性抗体在“杵链”的CH3结构域中包括T366W突变，而在“臼链”的CH3结构域中包括T366S、L368A和Y407V突变，且额外地“杵链”的CH3结构域中还包括R409D和K370E突变，“臼链”的CH3结构域中还包括D399K和E357K突变(编号根据KabatEU索引)。在一个实施方案中，本文中所述的多特异性抗体在两个CH3结构域之一中包括Y349C和T366W突变，而在两个CH3结构域的另一个中包括S354C、T366S、L368A和Y407V突变，或本文中所述的多特异性抗体在两个CH3结构域之一中包括Y349C和T366W突变，而在两个CH3结构域的另一个中包括S354C、T366S、L368A和Y407V突变，且额外地“杵链”的CH3结构域中还包括R409D和K370E突变，“臼链”的CH3结构域中还包括D399K和E357K突变(编号根据KabatEU索引)。除了“杵进臼技术”，用于修饰多特异性抗体重链的CH3结构域以迫使异二聚化的其他技术是本领域已知的。这些技术，尤其是描述于WO96/27011，WO98/050431，EP1870459，WO2007/110205，WO2007/147901，WO2009/089004，WO2010/129304，WO2011/90754，WO2011/143545，WO2012/058768，WO2013/157954和WO2013/096291中的那些，在本文中被考虑作为“杵进臼技术”的替换方案，与本文中所述的多特异性抗体组合。在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将EP1870459中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。这种方法基于：在第一和第二重链两者之间的CH3/CH3结构域界面中的特定位置引入具有相反电荷的带电荷氨基酸。因此，该实施方案涉及本文中所述的多特异性抗体，其中在抗体的三级结构中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成界面，该界面位于相应抗体CH3结构域之间，其中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域各自的氨基酸序列分别包含一组在所述抗体三级结构中位于所述界面中的氨基酸，其中，来自位于一条重链的CH3结构域界面中的该组氨基酸的第一氨基酸被带正电荷的氨基酸置换，而来自位于另一条重链的CH3结构域界面中的该组氨基酸的第二氨基酸被带负电荷的氨基酸置换。根据该实施方案的多特异性抗体在本文中也被称为“CH3(+/-)工程化多特异性抗体”(其中缩写“+/-”表示在相应CH3结构域中引入的带相反电荷的氨基酸)。在本文所述的CH3(+/-)工程化多特异性抗体的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K、R和H，而带负电荷的氨基酸选自E或D。在本文所述的CH3(+/-)工程化多特异性抗体的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K和R，而带负电荷的氨基酸选自E或D。在本文所述的CH3(+/-)工程化多特异性抗体的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸是K，而带负电荷的氨基酸是E。在本文所述的CH3(+/-)工程化多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中位置409的氨基酸R被D置换，且位置的氨基酸K被E置换，而在另一条重链的CH3结构域中位置399的氨基酸D被K置换，且位置357的氨基酸E被K置换(编号根据KabatEU索引)。在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO2013/157953中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文所述的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中位置366的氨基酸T被K置换，而在另一条重链的CH3结构域中位置351的氨基酸L被D置换(编号根据KabatEU索引)。在本文所述的多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被K置换且位置351的氨基酸L被K置换，而在另一条重链的CH3结构域中位置351的氨基酸L被D置换(编号根据KabatEU索引)。在本文所述的多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中位置366的氨基酸T被K置换且位置351的氨基酸L被K置换，而在另一条重链的CH3结构域中位置351的氨基酸L被D置换(编号根据KabatEU索引)。另外，至少一个以下置换包含在另一条重链的CH3结构域中：位置349的氨基酸Y被E置换，位置349的氨基酸Y被D置换和位置368的氨基酸L被E置换(编号根据KabatEU索引)。在一个实施方案中，位置368的氨基酸L被E置换(编号根据KabatEU索引)。在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO2012/058768中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文所述的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被Y置换和位置407的氨基酸Y被A置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被A置换和位置409的氨基酸K被F置换(编号根据KabatEU索引)。在另一个实施方案中，除了上述置换，在另一条重链的CH3结构域中，位置411(最初为T)，399(最初为D)，400(最初为S)，405(最初为F)，390(最初为N)和392(最初为K)的氨基酸中的至少一个被置换(编号根据KabatEU索引)。优选的置换为：-位置411的氨基酸T被选自N、R、Q、K、D、E和W的氨基酸置换(编号根据KabatEU索引)，-位置399的氨基酸D被选自R、W、Y和K的氨基酸置换(编号根据KabatEU索引)，-位置400的氨基酸S被选自E、D、R和K的氨基酸置换(编号根据KabatEU索引)，-位置405的氨基酸F被选自I、M、T、S、V和W的氨基酸置换(编号根据KabatEU索引)，-位置390的氨基酸N被选自R、K和D的氨基酸置换(编号根据KabatEU索引)，和-位置392的氨基酸K被选自V、M、R、L、F和E的氨基酸置换(编号根据KabatEU索引)。在本文所述的多特异性抗体的另一个实施方案中(根据WO2012/058768工程化的)，在一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被Y置换和位置407的氨基酸Y被A置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被V置换和位置409的氨基酸K被F置换(编号根据KabatEU索引)。在本文所述的多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y被A置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被A置换和位置409的氨基酸K被F置换(编号根据KabatEU索引)。在上述最后一个实施方案中，在所述另一条重链的CH3结构域中，位置392的氨基酸K被E置换，位置411的氨基酸T被E置换，位置399的氨基酸D被R置换和位置400的氨基酸S被R置换(编号根据KabatEU索引)。在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO20111/143545中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文所述的多特异性抗体的一个实施方案中，两条重链的CH3结构域中的氨基酸置换在位置368和/或409引入(编号根据KabatEU索引)。在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO2011/090762中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。WO2011/090762涉及根据“杵进臼”技术的氨基酸修饰。在本文所述的CH3(KiH)-工程化多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被W置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y被A置换(编号根据KabatEU索引)。在本文所述的CH3(KiH)-工程化多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被Y置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y被T置换(编号根据KabatEU索引)。在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，其是IgG2同种型，将WO2011/090762中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO2009/089004中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文所述的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置392的氨基酸K或N被带负电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被E或D，在一个优选的实施方案中，被D)置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置399的氨基酸D、位置356的氨基酸E或D、或位置357的氨基酸E被带正电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，K或R，在一个优选的实施方案中，K，在一个优选的实施方案中，位置399或356的氨基酸被K置换)置换(编号根据KabatEU索引)。在一个进一步的实施方案中，除了上述置换，在一条重链的CH3结构域中，位置409的氨基酸K或R被带负电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被E或D，在一个优选的实施方案中，被D)置换(编号根据KabatEU索引)。在一个更进一步的实施方案中，除了上述置换额外地、或作为上述置换的替代，在一条重链的CH3结构域中，位置439的氨基酸K和/或位置370的氨基酸K彼此独立地被带负电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被E或D，在一个优选的实施方案中，被D)置换(编号根据KabatEU索引)。在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO2007/147901中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文所述的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置253的氨基酸K被E置换，位置282的氨基酸D被K置换和位置322的氨基酸K被D置换，而在另一条重链的CH3结构域中，位置239的氨基酸D被K置换，位置240的氨基酸E被K置换和位置292的氨基酸K被D置换(编号根据KabatEU索引)。在本文中所述的多特异性抗体的一个实施方案中，将WO2007/110205中所述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在本文的所有方面和实施方案的一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。在本发明的一个优选实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。在本文的所有方面的一个实施方案中，抗体是二价抗体或三价抗体。在一个实施方案中，抗体是二价抗体。在本文的所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构。在本文中所述的所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG1亚类、或具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG2亚类的。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG3亚类的。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG4亚类，或具有另外的突变S228P的人IgG4亚类。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG1亚类或人IgG4亚类的。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变L234A和L235A突变的人IgG1亚类的(编号根据KabatEU索引)。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变L234A、L235A和P329G突变的人IgG1亚类的(编号根据KabatEU索引)。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变S228P和L235E突变的人IgG4亚类的(编号根据KabatEU索引)。在本文所有方面的一个进一步的实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变S228P、L235E和P239G突变的人IgG4亚类的(编号根据KabatEU索引)。在本文所有方面的一个实施方案中，本文中所述包含包括CH3结构域的重链的抗体，包括额外的C-端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，编号根据KabatEU索引)。在本文所有方面的一个实施方案中，本文所述的包含包括CH3结构域的重链的抗体，包括额外的C-端甘氨酸残基(G446，编号根据KabatEU索引)。6.抗体变体在特定实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望提高抗体的结合亲和力和/或其他生物性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过将合适修饰引入编码抗体的核苷酸序列内，或通过肽合成，进行制备。此类修饰包括例如在抗体的氨基酸序列内的残基的缺失、和/或插入和/或置换。可以进行缺失、插入和置换的任何组合以获得最终构建体，只要最终构建体具有所需特征，例如抗原结合即可。a)置换、插入和缺失变体在特定实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVR和FR。保守置换显示于表1中标题“保守性置换”下。更实质性的变化在表1中标题“示例性置换”下提供，并且在下文参考氨基酸侧链种类进一步描述。可以将氨基酸置换引入目的抗体内且就所需活性，例如保留/提高的抗原结合、减少的免疫原性或提高的ADCC或CDC，筛选产物。表1原始残基示例性置换保守性置换Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Asp,Lys；ArgGlnAsp(D)Glu；AsnGluCys(C)Ser；AlaSerGln(Q)Asn；GluAsnGlu(E)Asp；GlnAspGly(G)AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸LeuLeu(L)正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Trp；Leu；Val；Ile；Ala；TyrTyrPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)Val；SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸Leu氨基酸可以根据共同侧链性质进行分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守性置换需要这些类型之一的成员交换为另一类型的成员。一类置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个超变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在特定生物性质(例如增加的亲和力、减少的免疫原性)上具有修饰(例如改善)，和/或基本上保留了亲本抗体的特定生物性质。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文描述的，方便地生成。简而言之，使一个或多个HVR残基突变，并且将变体抗体展示在噬菌体上且筛选特定生物活性(例如结合亲和力)。可以在HVR中作出改变(例如置换)，例如以改善抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点”(即，由在体细胞成熟过程中高频率经历突变的密码子编码的残基)(参见，例如Chowdhury,P.S.，MethodsMol.Biol.207(2008)179-196)，和/或接触抗原的残基中作出，测试所得到的变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库且从中再选择而进行的亲和力成熟，例如描述于Hoogenboom,H.R.等，MethodsinMolecularBiology178(2002)1-37中。在亲和力成熟的一些实施方案中，可以通过多种方法中的任一种(例如易错PCR、链改组、或寡核苷酸定向诱变)，将多样性引入选择用于成熟的可变基因内。随后制备二级文库。随后筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向的方法，其中几个HVR残基(例如一次4-6个残基)被随机化。可以具体地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别地，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。在特定实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个HVR内发生，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文提供的保守性置换)。此类改变可以例如在HVR中抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的特定实施方案中，每个HVR可以是未改变的，或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。用于鉴定可以作为诱变靶标的抗体残基或区域的一个有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如通过Cunningham,B.C.和Wells,J.A.，Science244(1989)1081-1085描述的。在此方法中，鉴定一个残基或一组靶标残基(例如荷电残基例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并且替换为中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)，以确定抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对该最初置换显示出功能性敏感的氨基酸位置上引入进一步的置换。可替代地或另外地，可以利用抗原-抗体复合物的晶体结构，鉴定在抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可以作为用于置换的候选物被靶向或消除。可以筛选变体，以确定它们是否含有所需性质。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合(长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽)，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N或C末端与酶(例如对于ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽的融合。b)糖基化变体在特定实施方案中，改变本文提供的抗体，以提高或降低抗体糖基化的程度。对抗体添加或缺失糖基化位点，可以通过改变氨基酸序列从而形成或去除一个或多个糖基化位点而方便地完成。当抗体包含Fc区时，可以改变与之连接的碳水化合物。通过哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分支的、二天线寡糖，其一般通过N键连接Fc区的CH2结构域的Asn297(参见，例如，Wright,A和Morrison,S.L.，TIBTECH15(1997)26-32)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接至二天线寡糖结构的“茎”中的GlcNAc上的岩藻糖。在一些实施方案中，可以在本文提供的抗体中进行寡糖的修饰，以便产生具有特定改良性质的抗体变体。在一些实施方案中，提供具有缺乏(直接或间接)连接至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％、或20％至40％。可以按照例如WO2008/077546中所述的，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，相对于连接至Asn297的所有糖结构(例如复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算在Asn297位的糖链中的岩藻糖的平均量，以确定岩藻糖的量。Asn297指位于Fc区的大约位置297上的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可以位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸处，即位置294和300之间。此类岩藻糖基化变体可以具有提高的ADCC功能。参见，例如，US2003/0157108；US2004/0093621。与“去岩藻糖化的”或“岩藻糖缺陷的”抗体变体有关的出版物实例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A。等，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等Biotech.Bioeng.87(2004)614。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系实例包括具有蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.等，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US2003/0157108；和WO2004/056312A1，尤其是实施例11)，和敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohunki,N.等，Biotech.Bioeng.87(2004)614-612；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.，94(2006)680-688和WO2003/085107)。进一步提供了具有平分型寡糖(bisectedoligosaccharide)的抗体变体，例如其中与抗体的Fc区附着的二天线寡糖通过GlcNAc平分。此类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或提高的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO2003/011878；US6,602,684；和US2005/0123546中。还提供了在与Fc区附着的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有提高的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO1997/30087；WO1998/58964；和WO1999/22764。c)Fc-区变体在特定实施方案中，一个或多个氨基酸修饰可以引入本文提供的抗体的Fc区内，从而生成Fc区变体。Fc区变体可以包括包含在一个或多个氨基酸位置上的氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。在特定实施方案中，本发明考虑具有一些但并非所有效应物功能的抗体变体，这使得其成为用于如下应用的期望候选物，在所述应用中抗体在体内的半衰期是重要的，而一些效应物功能(例如补体和ADCC)是不需要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以证实CDC和/或ADCC活性的降低/耗竭。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定试验，以确保抗体缺乏FcγR结合(从而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞即NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在造血细胞上的FcR表达概括在Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定试验的非限制性实例描述于US5,500,362中(参见，例如Hellstrom,I.等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82(1985)1499-1502；US5,821,337(参见Bruggemann,M.等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。可替代地，可以采用非放射性测定试验方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定试验(CellTechnology，Inc.MountainView，CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定试验(Promega，Madison，WI)。可以用于此类测定试验的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，目的分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在动物模型中，例如公开于Clynes,R.等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95(1988)652-656中的。还可以进行C1q结合测定试验，以证实抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO2006/029879和WO2005/100402中C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定试验(参见，例如，Gazzano-Santoro,H.等，J.Immunol.Methods202(1996)163-171；Cragg,M.S.等，Blood101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie，Blood103(2004)2738-2743)。FcRn结合和体内清除率/半衰期确定还可以使用本领域已知的方法进行(参见，例如，Petkova,S.B.等，Int’l.Immunol.18(2006)1759-1769)。具有降低的效应物功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的置换的那些(US6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个上具有置换的Fc突变体，包括具有残基265和297的丙氨酸置换的所谓“DANA”Fc突变体(US7,332,581)。描述了具有提高或降低的FcRs结合的特定抗体变体。(参见，例如，US6,737,056；WO2004/056312和Shields,R.L.等，J.Biol.Chem.276(2011)6591-6604)。在特定实施方案中，抗体变体包含具有提高ADCC的一个或多个氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334上的置换(残基的EU编号)。在一些实施方案中，在Fc区中作出改变，以导致改变的(例如提高或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如US6,194,551，WO99/51642，和Idusogie,E.E.等,J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述的。在US2005/0014934A1中描述了具有增加的半衰期和提高的新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体，所述新生儿Fc受体负责母源IgGs至胎儿的转移(Guyer,R.L.等，J.Immunol.117(1976)587和Kim,J.K.等，J.Immunol.24(1994)249)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，所述一个或多个置换改善Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在如下Fc区残基的一个或多个上具有置换的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的置换(US7,371,826)。.关于Fc区变体的其他实例，还参见Duncan,A.R.&Winter,G.，Nature322(1988)738-40；US5,648,260；US5,624,821；和WO94/29351。d)半胱氨酸工程化抗体变体在特定实施方案中，可能期望制备半胱氨酸工程化抗体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基由半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，被置换的残基位于抗体的可接近位点上。通过用半胱氨酸置换这些残基，从而将反应性巯基基团置于抗体的可接近位点上，这些巯基基团可以用于使抗体缀合至其他部分例如药物部分或衔接物-药物部分，以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在特定实施方案中，下述残基中的任何一个或多个可以由半胱氨酸残基置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以如例如US7,521,541中所述的，产生半胱氨酸工程化抗体。e)抗体衍生物在特定实施方案中，本文提供的抗体可以进一步被修饰，以含有本领域已知的且可容易获得的另外非蛋白质性部分。适于衍生抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、前丙二醇(propropyleneglycol)同聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛，由于其在水中的稳定性，可以在制造中具有优点。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支或未分支的。连接至抗体的聚合物数目可以改变，并且如果连接超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同分子。通常，用衍生的聚合物的数目和/或类型可以基于如下考虑进行确定，所述考虑包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能，抗体衍生物是否用于在限定条件下的治疗中等。在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射线而被选择性加热的非蛋白质性部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性部分是碳纳米管(Kam,N.W.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102(2005)11600-11605)。辐射可以是任何波长，并且包括但不限于，不伤害普通细胞，但可以将非蛋白质性部分加热至能杀死抗体-非蛋白质性部分附近的细胞的温度的波长。B.重组方法和组合物抗体可以使用重组方法和组合物进行生产，例如如US4,816,567中所述的。在一个实施方案中，提供了编码本文中所述的抗转铁蛋白受体抗体的分离核酸。此核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在进一步的实施方案中，提供了包含此核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在进一步的实施方案中，提供了包含此核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如已经用以下载体转化)：(1)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列和含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗转铁蛋白受体抗体的方法，其中所述方法包括在适于抗体表达的条件下培养如上文提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，且任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。对于抗转铁蛋白受体抗体的重组生产，分离编码抗体的核酸，例如如上所述的，并且插入一个或多个载体内用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。此核酸可以使用常规程序(例如通过使用能够与编码抗体重和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。用于抗体编码载体的克隆或表达的合适宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，特别是当不需要糖基化和Fc效应物功能时，抗体可以在细菌中生产。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如US5,648,237，US5,789,199，和US5,840,523。(还参见Charlton,K.A.，MethodsinMolecularBiology，第248卷，Lo,B.K.C.(编辑)，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，pp.245-254，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以在可溶级分中从细菌细胞糊分离且可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是用于抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，这导致具有部分或全人糖基化模式的抗体生产。参见Gerngross，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等，Nat.Biotech(2006)24:210-215。用于糖基化抗体表达的合适宿主细胞也可以源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了众多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞结合使用，特别用于草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的转染。植物细胞培养物也可以用作宿主。参见，例如，US5,959,177，US6,040,498，US6,420,548，US7,125,978和US6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，悬浮生长适应化的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如293或例如Graham,F.L.等，J.GenVirol.36(1997)59中所述的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(如例如Mather,J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-251中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；Buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如例如Mather,J.P.等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述的；MRC5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。对于适合于抗体生产的一些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki,P.和Wu,A.M.，MethodsinMolecularBiology，Vol.248，Lo.B.K.C.(编辑)，HumanaPress，Totowa，NJ(2004)pp.255-268。C.测定试验可以通过本领域已知的各种测定试验，针对其物理/化学特性和/或生物活性，鉴定、筛选或表征本文中提供的抗转铁蛋白受体抗体。1.结合测定试验在一个方面中，可以就其抗原结合活性，例如通过已知方法，如ELISA、αLISA、蛋白质印迹、抗体或反相阵列等，测试本发明的抗体。在示例性ELISA或αLISA测定中，溶液(细胞上清液、细胞或组织裂解液、体液等)中的转铁蛋白受体结合捕获抗体(所述捕获抗体特异性地结合转铁蛋白受体上的第一表位或特定构象的转铁蛋白受体)以及与检测实体偶联的检测抗体(所述检测实体特异性地结合转铁蛋白的第二表位或构象)。基于检测实体(化学发光、荧光、能量转移诱发的发光等)获得读出。在抗体阵列的情况中，将抗体点在玻璃或硝基纤维素芯片上。用含有转铁蛋白受体的溶液阻断并孵育载玻片，洗涤以除去未结合的抗体，并用荧光标记的相应的二抗检测结合的抗体。通过荧光载玻片扫描仪测量荧光信号。相似地，对于反相阵列，将重组转铁蛋白受体、细胞上清液、细胞或组织裂解液、体液等，点在玻璃或硝基纤维素芯片上。将载玻片阻断并用对抗转铁蛋白受体上的特异性表位的抗体孵育单独的阵列。洗掉未结合的抗体，并用荧光标记的相应二抗检测结合的抗体。荧光信号通过荧光载玻片扫描仪来测量(Dernick,G.等，J.LipidRes.，52(2011)2323-2331)。D.用于诊断和检测的方法和组合物在特定的实施方案中，将本文中提供的任一种抗转铁蛋白受体抗体用于检测生物样品中人转铁蛋白受体的存在。本文中使用的术语“检测”包括定量或定性检测。在特定实施方案中，生物样品包括细胞或组织，如脑组织。在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法中的抗转铁蛋白受体抗体。在进一步的方面中，提供了检测生物样品中转铁蛋白受体存在的方法。在特定实施方案中，该方法包括将生物样品在允许抗转铁蛋白受体抗体与转铁蛋白受体结合的条件下接触本文中所述的抗转铁蛋白受体抗体，并且检测抗转铁蛋白受体抗体和转铁蛋白受体之间是否形成了复合物。这样的方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，将抗转铁蛋白受体抗体用于选择适宜使用抗转铁蛋白受体抗体治疗的受试者，例如，当转铁蛋白受体是用于患者选择的生物标志物时。可以使用本发明的抗体诊断的示例性病症包括具有1型脑内铁沉积性神经变性(neurodegenerationwithbrainironaccumulationtype1,NBIA1)、单纯性自主神经衰竭(pureautonomicfailure)、唐氏综合征(Down’ssyndrome)、关岛复合征(complexofGuam)和严重的路易体病(severalLewybodydisorders)，如弥漫性路易体病(diffuseLewybodydisease(DLBD))、阿尔茨海默氏病路易体变异型(LewybodyvariantofAlzheimer’sdisease(LBVAD))、高歇氏病(Gaucher’sdisease)的特定形式和帕金森病痴呆(Parkinson’sDiseasedementia(PDD))。在特定实施方案中，提供了标记的抗转铁蛋白受体抗体。标记包括，但不限于，可以直接检测的标记或部分(例如荧光、生色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及可以间接(例如通过酶促反应或分子相互作用)检测的部分，如酶或配体。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团，如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹磺酰，伞形酮，萤光素酶，如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶，杂环氧化酶，如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与采用过氧化氢以氧化染料前体的酶偶联，如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定自由基等。E.药物制剂可以制备如本文所述的抗转铁蛋白受体抗体的药物制剂，例如通过使具有所需纯度的抗体与一种或多种任选的药学可接受的载体(Remington’sPharmaceuticalScience，第16版，Osol，A.(编辑)(1980))混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备。药学可接受的载体在采用的剂量和浓度下对接受者一般是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。示例性药学可接受的载体在本文中进一步包括间质(insterstitial)药物分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(BaxterInternational，Inc.)。US2005/0260186和US2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP及其使用方法，包括rhuPH20。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的葡糖胺聚糖酶(如软骨素酶)组合。示例性冻干抗体制剂描述于US6,267,958。水性抗体制剂包括US6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后面的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。本文中的制剂还可以针对所治疗的特定适应症按照需要含有一种以上的活性成分，优选具有互补活性且不会不利地彼此影响的那些。此类活性成分适于以对于预期目的有效的量组合存在。活性成分可以截留在例如通过凝聚技术(coacervation)或通过界面聚合制备的微囊中(例如分别地羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)、在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒和纳米囊)中，或在粗乳液中。此类技术公开于Remington’sPharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A(编辑)(1980)。可以制备持续释放的制剂。持续释放的制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质可以为成形物品例如薄膜或微胶囊的形式。待用于体内施用的制剂一般是无菌的。无菌性可以通过例如经由无菌过滤膜过滤而容易地达到。III.制造品在本发明另一方面，提供含有可以用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制造品。制造品可以包含容器和在容器上或与容器结合的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成。容器容纳组合物(单独地或与对于治疗、预防和/或诊断所述状况有效的另外组合物组合的方式)，且可以具有无菌进入口(例如容器可以是具有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装说明书指示组合物用于治疗所选择的状况。此外，制造品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其它的细胞毒性剂或另外的治疗剂。在本发明的该实施方案中，制造品可以进一步包含指示组合物可以用于治疗特定状况的包装说明书。可替代地或另外地，制造品可以进一步包括包含药学可接受的缓冲液的第二(或第三)容器，所述药学可接受的缓冲液例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户观点来看希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。应当理解，任何上述制成品可以，作为抗转铁蛋白受体抗体的替代，或在抗转铁蛋白受体抗体之外额外地，包括本发明的免疫缀合物。VI.实施例以下是本发明方法和组合物的实例。应当理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施多种其他实施方案。材料和方法重组DNA技术按照Sambrook，J.等，Molecularcloning:Alaboratorymanual(分子克隆：实验室手册)；ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989中所述的，使用标准方法操纵DNA。分子生物试剂根据制造商的说明使用。基因和寡核苷酸合成在GeneartGmbH(Regensburg，德国)，通过化学合成制备了所需的基因片段。将合成的基因片段克隆至大肠杆菌质粒中，用于繁殖/扩增。通过DNA测序验证了亚克隆的基因片段的DNA序列。或者，经由PCR或通过退火化学合成的寡核苷酸，装配短的合成DNA片段。通过metabionGmbH(Planegg-Martinsried，德国)制得了相应的寡核苷酸。试剂如果没有另外指出，按照制造商的实验方案，使用所有商业化学品、抗体和试剂盒。实施例1兔和小鼠的免疫小鼠的免疫通过经皮施用100μg载体DNA，接着电穿孔(1000V/cm的2个矩形脉冲(squarepulses)，持续时间0.1ms，间隔0.125s；接着287.5V/cm的4个矩形脉冲，持续时间10ms，间隔0.125s)，使用编码全长人或猕猴TfR的质粒表达载体，遗传免疫NMRI小鼠。小鼠在第0、14、28、42、56、70和84天，接受了6或7次连续免疫。第四和第六次免疫使用编码猕猴TfR的载体进行；编码人TfR的载体用于所有其他免疫。在第36、78和92天采血，并制得血清，将其用于通过ELISA的滴定测定(参见下文)。选择具有最高滴定的动物，在第96天进行加强：静脉内注射106个人TF-1细胞或50μg缺乏螺旋结构域的重组人可溶性TfR(在Leu122开始并在Asn608结束的人TfR胞外结构域，作为与人Fc-区的N-端融合物在HEK239F细胞中表达，并且通过蛋白A亲和性色谱和大小排阻色谱纯化)，并且通过杂交瘤技术，基于其结合稳定转染的CHO-K1细胞表面表达的人和猕猴转铁蛋白受体的能力，分离单克隆抗体(参见实施例4)。兔的免疫通过经皮施用400μg载体DNA，接着电穿孔(750V/cm的5个矩形脉冲，持续时间10ms，间隔1s)，使用编码全长人或猕猴TfR的质粒表达载体，对新西兰白兔或表达人源化抗体库的转基因兔，实施了遗传免疫。兔子在第0、14、28、56、84和112天，接受6次连续免疫。第四和第六次免疫使用编码猕猴TfR的载体进行；编码人TfR的载体用于所有其他免疫。在第35、63、91和119天采血(估算的总血液体积的10％)。制得血清，将其用于通过ELISA的滴定测定(参见下文)，并且分离外周单个核细胞，将其用作B细胞克隆过程中抗原特异性B细胞的来源(参见实施例2)。血清滴度的测定(ELISA)将人重组可溶性TfR(R&DSystemsCat.No.2474-TR)在PBS中以3μg/mL，100μL/孔固定于96-孔NUNCMaxisorb板上，接着：用PBS中的2％CroteinC阻断平板，200μL/孔；施加PBS中0.5％CroteinC中的抗血清连续稀释物，一式两份，100μL/孔；用以下进行检测：(1)HRP缀合的山羊抗小鼠抗体(JacksonImmunoresearch/Dianova115-036-071；1/16000)，用于所有小鼠血清，(2)HRP缀合的驴抗兔IgG抗体(JacksonImmunoresearch/Dianova711-036-152；1/16000)，用于所有兔血清，(3)兔抗人IgG抗体(Pierce/ThermoScientific31423；1/5000)，只用于来自转基因兔的血清，(4)生物素化山羊抗人κ抗体(SouthernBiotech/Biozol2063-08，1/5000)和链霉亲和素-HRP，只用于来自转基因兔的血清；在PBS中0.5％CroteinC中稀释，100μL/孔。对于所有步骤，平板在37℃孵育1h。在所有步骤之间，用PBS中的0.05％Tween20洗涤平板3次。通过添加BMBluePODSubstratesoluble(Roche)，100μL/孔，来产生信号；并且通过添加1MHCl，100μL/孔来停止。相对作为参照的690nm，在450nm读出吸光度。滴度定义为导致半最大信号的抗血清稀释度。实施例2来自兔的B-细胞克隆兔外周血单个核细胞(PBMC)的分离总共获取了6只动物(2只野生型(wt)兔和4只转基因(tg)兔)的血样。这些兔子源自2轮不同的免疫：第一轮免疫使用2只wt和2只tg兔子，而第二轮免疫使用2只tg兔子(还参见实施例“兔的免疫”)。用1×PBS(PAA，Pasching，奥地利)将含有EDTA的全血稀释两倍，接着根据制造商的说明，使用哺乳动物淋巴细胞分离液(lympholytemammal)(CedarlaneLaboratories，Burlington，Ontario，加拿大)进行密度离心。用1×PBS将PBMC洗涤两次。EL-4B5培养基补充了10％FCS(Hyclone，Logan，UT，USA)，2mM谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素溶液(PAA，Pasching，奥地利)，2mM丙酮酸钠，10mMHEPES(PANBiotech，Aidenbach，德国)和0.05mMβ-巯基乙醇(Gibco，Paisley，苏格兰)的RPMI1640(PanBiotech，Aidenbach，德国)。细胞的耗竭第一轮免疫：通过非特异性粘附以及非特异性结合淋巴细胞，使用包被了汇合单层CHO细胞的无菌6-孔板(细胞培养级)，耗竭巨噬细胞/单核细胞。第二轮免疫：省略了使用覆盖了CHO细胞的孔的耗竭步骤，因为我们不能排除产生与仓鼠转铁蛋白受体抗体交叉反应的抗体的那些B-细胞被耗竭。因此，使用空白无菌6-孔板(细胞培养级)，通过非特异性粘附来耗竭巨噬细胞和单核细胞，使得产生仓鼠交叉反应性(和可能地小鼠交叉反应性)表面抗体的潜在B-淋巴细胞可以到达工作流的下一个步骤。对于每轮免疫：每个孔最大装4mL培养基和高达6×106个来自免疫兔子的PBMC，并允许其在温箱中在37℃结合1h。将上清液中的细胞(外周血淋巴细胞(PBL))用于抗原淘选步骤。在人转铁蛋白受体上富集B-细胞向覆盖了单层人转铁蛋白受体阳性CHO细胞的6-孔组织培养板，接种高达6×106个PBL/4mL培养基，并使其在温箱中在37℃结合1h。通过用1×PBS小心洗涤孔1-2次，除去未粘附的细胞。通过胰蛋白酶在温箱中37℃处理10min，使剩余粘着的细胞脱壁。用EL-4B5培养基停止胰蛋白酶作用。将细胞保持在冰上，直至免疫荧光染色。免疫荧光染色和流式细胞术将抗-IgGFITC(AbDSerotec，Düsseldorf，德国)用于单细胞分选。对于表面染色，用PBS中的抗-IgGFITC抗体孵育来自耗竭和富集步骤的细胞，并在4℃在黑暗中孵育45min。染色后，用冰冷PBS将PBMC洗涤两次。最后，将PBMC重悬浮于冰冷PBS中并立即接受FACS分析。在FACS分析之前，加入5μg/mL浓度的碘化丙啶(BDPharmingen，SanDiego，CA，USA)，以区分死细胞和活细胞。将配备有计算机和FACSDiva软件(BDBiosciences，USA)的BectonDickinsonFACSAria用于单细胞分选。B-细胞培养通过与Zubler等(1985)所述相似的方法，准备兔B-细胞的培养。简而言之，将分选的单个兔B-细胞，在含有200μL/孔EL-4B5培养基的96-孔板中，在培养箱中在5％CO2气氛中在37℃孵育7天，其中所述培养基含有PansorbinCell(1:100000)(Calbiochem(Merck)，Darmstadt，德国)，5％兔胸腺细胞上清液(chargeTSN-M13(10242)，MicroCoat，Bernried，德国)和γ-辐射的鼠EL-4-B5胸腺瘤细胞(2.5×104/孔)。收集B细胞培养的上清液用于筛选，并且立即收集剩余的细胞并在100μLRLT缓冲液(Qiagen，Hilden，德国)中冷冻在-80℃。实施例3噬菌体展示用于单价抗-TfRIgG的选择和生产通过噬菌体展示进行选择使用标准实验方案(Silacci等，Proteomics，5(2005)2340-2350)，通过噬菌体展示，产生结合人和猕猴TfR的抗体。将hTfRECD与携带C-端Avi-标签(SEQIDNO:99)的人臼Fc-区的N-端铰链连接，并连接入哺乳动物表达载体，以克隆编码hTfR-Fc(KiH)-Avi(KiH＝杵进臼，Avi＝AviTag)抗原的合成基因。我们的所有哺乳动物表达载体都携带MPSV启动子用于转录和翻译的启动，其中转录通过位于该ORF下游的合成polyA信号序列来终止。此外，载体含有EBVoriP序列用于在EBV-ENBA表达细胞系中的自主复制。测序验证了正确的ORF。通过与空的杵-Fc-区和BirA蛋白共表达，该载体用于在HEK293EBNA悬浮细胞中表达，将1mM生物素加入培养基中。通过蛋白A亲和色谱，接着通过大小排阻色谱，纯化所得到的生物素化蛋白。分别产生cyTfR-Fc(KiH)-Avi抗原(SEQIDNO:100)。所用的文库是使用VH1，3，4，5家族以及V-κ1，-2和-3和V-λ3的人构架的完全合成的文库。随机化的氨基酸在CDR-H3和CDR-L3中。使用每条重链VH与所有不同的轻链文库一起，产生了文库集合。根据以下程序，在溶液中进行了选择：1.每个文库大约1012个噬菌粒在1mL的总体积中与100nM生物素化TfR-avi-his结合0.5h，2.通过加入5.4×107个链霉亲和素-包被的磁珠10min，捕获生物素化的TfR-avi-his和特异性结合的噬菌体颗粒，3.使用5-10×1mLPBS/Tween20和5-10×1mLPBS洗涤珠子，4.通过加入1mL100mMTEA(三乙胺)10min，洗脱噬菌体颗粒，并通过加入500μL1MTris/HClpH7.4中和，和5.重新感染指数生长的大肠杆菌TG1细菌，用辅助噬菌体VCSM13感染，随后PEG/NaCl沉淀噬菌粒，以用于随后的选择轮中。使用恒定的或递减(从10-7M至2×10-9M)抗原浓度，将选择进行3-5轮。在第2轮中，使用中性亲和素(neutravidin)板替代链霉亲和素珠子，进行抗原/噬菌体复合物的捕获。因为相对重组可溶性抗原产生的结合剂常常在细胞上只显示出弱结合，故我们在第二轮或第三轮在重组抗原上的富集后，引入了使用展示天然抗原的细胞的另外两个选择步骤。在此，使用了两个细胞系TF-1和NCI-H460(都获自ATCC)。简而言之，用大约1012个噬菌体颗粒在冰上孵育1*106个细胞1h，以避免受体介导的内化。使用PBST缓冲液(含有1％Tween-20的PBS)通过5-10个离心步骤进行洗涤。将完整细胞用于感染TG1细菌，用于噬菌体拯救。如下通过ELISA鉴定特异结合剂：将100μL10nM生物素化TfR-avi-his/孔包被在中性亲和素板上。加入含有Fab的细菌上清液，并且通过使用抗-FLAG/HRP二抗，通过其FLAG-标签来检测结合性Fab。以96-孔格式，将ELISA-阳性克隆通过细菌表达为可溶性Fab片段，并且使用ProteOnXPR36(BioRad)，通过SPR分析，对上清液进行动力学筛选实验。鉴定了表达具有最高亲和力常数的Fab的克隆，将相应的噬菌粒测序。Fab抗体的纯化用所有细胞ELISA阳性克隆的噬菌粒质粒，单独转染Top10细胞。将细胞生长于培养基中并且诱导Fab抗体的产生。通过周质制备来分离Fab抗体，并使用IMAC纯化。FACS分析将纯化的Fab抗体以各种浓度施用于TF-1细胞。使用荧光标记的抗-Fab抗体检测结合Fab抗体的细胞，并通过FACS测量。计算EC50值。所选克隆的产生和表征转化成IgG形式选择了具有6至20分钟的复合半衰期(t1/2)或10nM至500nM的细胞上EC50、具有在FACS或细胞ELISA上的独特细胞结合信号、以及相对hTfR-Fc(KiH)-Avi和cyTfR-Fc(KiH)-Avi抗原的交叉反应性结合的所选克隆，将其转化成IgG形式。因此，通过PCR扩增VL结构域并克隆至如上所述的哺乳动物表达载体中，直接在CL结构域的上游。此外，通过PCR扩增VH结构域并且直接克隆在CH-Fc结构域的上游。测定了两个表达载体的序列。IgG抗体的产生用编码LC和HC的两个质粒转染HEK293EBNA悬浮细胞并培养7天。通过无菌过滤澄清上清液。通过蛋白A色谱测定IgG浓度。使用TagLite技术测定EC50将包括跨膜结构域的hTfR或cyTfR的ECD的基因，在SNAP-标签的下游连接至哺乳动物表达载体中。将这个载体用于转染HEK293EBNA悬浮细胞，导致具有C-端SNAP标签融合的TfR的展示(SEQIDNO:101，SEQIDNO:102)。用SNAP-Lumi4Tb(Cisbio)特异性地标记SNAP标签。通过测量615nm处的铽的发射，测定了标记效率。将标记的细胞储存于-80℃。在抗人Fc-d2IgG抗体的存在下，用各种稀释度的IgG上清液孵育标记的细胞并且在4小时后测量FRET信号(供体染料Lumi4Tb的发射：615nm，而受体染料d2：665nm)。计算EC50值，获得25个结合hTfR和cyTfR两者的IgG。通过FACS测定细胞结合将全长TfR或cyTfR的基因分别克隆至哺乳动物表达载体中。将这个载体用于CHOEBNA悬浮细胞的转染。将IgG上清液直接用于TfR展示细胞。用PBST洗涤后，使用抗-huFcIgG-HRP抗体缀合物，接着用3,3’-5,5’-四甲基联苯胺显色，来检测抗原-抗体复合物。使用商业上可购得的抗-TfR抗体来验证功能性展示。所有25个TagLite阳性克隆都呈现了强烈的结合信号。单价IgG样分子的产生和纯化将VH结构域克隆至编码人杵IgG1HC的哺乳动物表达载体中，所述人杵IgG1HC携带L234A、L235A和P329G突变。将这个载体用于在HEK293EBNA悬浮细胞中的表达，共同表达LC(上述载体)和携带L234A、L235A、P329G、H435R和Y436F突变的空臼-Fc结构域。通过蛋白A亲和性色谱纯化所得到的蛋白质。在通过分析性大小排阻色谱测定单体蛋白>95％的情况中，通过大小排阻色谱进一步纯化蛋白质。实施例4通过细胞ELISA鉴定人和猕猴TfR-结合抗体为了就识别人和猕猴TfR的抗体筛选兔B-细胞或小鼠杂交瘤上清液，利用了使用稳定转染的CHO-K1细胞的细胞ELISA。通过用表达质粒转染CHO-K1细胞获得了稳定的转染体，所述表达质粒含有用于人或猕猴TfR以及用于新霉素-磷酸转移酶的表达盒。转染后，将细胞在含有500μg/mLG418(LifeTechnologies)的生长培养基中稀释。生长克隆出现后，分离细胞，用MEM-75(Abcam)或13E4(LifeTechnologies)以及PE标记的二抗用于人或猕猴TfR的染色，并且将高荧光细胞分选为单细胞至96-孔平板孔中(FACSAria)。7天生长后，再次检查克隆的TfR表达，并选择最佳表达克隆用于细胞ELISA实验。简而言之，向384-孔板的每个孔接种15,000个细胞，并且在37℃，5％CO2下孵育18h。使用自动化洗涤器(BIOTEK)除去上清液，并将30μL含有抗体的上清液加入每个孔中，接着加入24μL生长培养基。2小时孵育后，排空孔并在RT下加入30μLPBS中的0.05％戊二醛45min。用PBS/0.025％Tween20(PBST)洗涤3次，加入阻断缓冲液中1:5000稀释的30μL抗-兔-HRP或抗-小鼠-HRP(SouthernBiotech)并将平板在RT下孵育1小时。用PBST洗涤孔6次并使用30μLTMB/孔产生了信号，并且在450nm下测量吸光度。实施例5抗-TfR抗体的克隆和表达重组DNA技术按照Sambrook,J等，Molecularcloning:ALaboratorymanual(分子克隆：实验室手册)；ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989，使用标准方法来操纵DNA。根据制造商的说明使用分子生物试剂。基因和寡核苷酸合成通过在GeneartGmbH(Regensburg，德国)化学合成制备了所需的基因区段。将合成的基因片段克隆至用于繁殖/扩增的大肠杆菌质粒中。通过DNA测序验证了亚克隆的基因片段的DNA序列。或者，通过使化学合成的寡核苷酸退火或经由PCR来装配短的DNA片段。通过metabionGmbH(Planegg-Martinsried，德国)制备了相应的寡核苷酸。V-结构域的PCR扩增根据制造商的实验方案，使用NucleoSpin8/96RNA试剂盒(Macherey&Nagel；740709.4，740698)，从B-细胞裂解物制得了总RNA。用60μL无RNAse水稀释RNA。根据制造商的说明，使用SuperscriptIII第一链合成SuperMix(Invitrogen18080-400)和寡-dT-引物，通过逆转录酶反应，使用6μLRNA来产生cDNA。所有步骤在HamiltonMLStar系统上进行。使用引物rbHC.up和rbHC.do用于重链，rbLC.up和rbLC.do用于野生型兔B细胞的轻链，以及BcPCR_FHLC_leader.fw和BcPCR_huCkappa.rev用于转基因兔B-细胞的轻链(参见下表)，在50μL最终体积中使用AccuPrimeSuperMix(Invitrogen12344-040)和4μLcDNA来扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)。所有正向引物是(VH或VL的)信号肽特异性的，而反向引物是(VH或VL的)恒定区特异性的。用于RbVH+RbVL的PCR条件如下：94℃热启动5min；94℃20sec，70℃20sec，68℃45sec，35个循环，以及在68℃最终延伸7min。用于HuVL的PCR条件如下：94℃热启动5min；94℃20sec，52℃20sec，68℃45sec，40个循环，以及在68℃最终延伸7min。将50μLPCR溶液中的8μL加载于2％的48E-凝胶(InvitrogenG8008-02)上。根据制造商的实验方案，使用NucleoSpinExtractII试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)，清洁阳性PCR反应，并在50μL洗脱缓冲液中洗脱。所有清洁步骤在HamiltonMLStarlet系统上进行。兔单克隆二价抗体的重组表达为了兔单克隆二价抗体的重组表达，通过突出端克隆方法(RSHaun等，BioTechniques(1992)13，515-518；MZLi等，NatureMethods(2007)4，251-256)，将编码VH或VL的PCR产物作为cDNA克隆至表达载体中。表达载体含有由包括内含子A的5’CMV启动子和3’BGH多腺苷酸化序列组成的表达盒。除了表达盒，质粒含有pUC18-衍生的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，用于在大肠杆菌中扩增质粒。使用了基础质粒的三个变体：一个质粒含有设计来接受VH区的兔IgG恒定区，另外两个质粒含有兔或人κLC恒定区以接受VL区。使用重叠引物，通过PCR扩增了编码κ或γ恒定区和VL/VH插入片段的线性化表达质粒。用T4DNA-聚合酶孵育纯化的PCR产物，产生单链突出端。通过添加dCTP停止反应。在下一个步骤中，将质粒和插入片段混合并且与recA孵育，其诱导位点特异性重组。将重组的质粒转化至大肠杆菌中。第二天，挑选生长的集落，并且通过质粒制备、限制性分析和DNA-测序，检查了正确的重组质粒。对于抗体表达，将分离的HC和LC质粒瞬时共转染至HEK293细胞中并且在1周后收获上清液。用于兔单克隆单价抗体表达的载体的产生为了将选择的候选物重组表达为单克隆单价抗体，将所有VH链的兔恒定区转化成在CH3区段中包括杵突变的人恒定区。对于源自兔野生型B-细胞的VL链，将兔Cκ恒定区转化成人的。将4μL选定的候选物的cDNA在50μL最终体积中用于扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区，其中使用AccuPrimeSuperMix(Invitrogen12344-040)，使用信号肽特异性的正向引物、和CDR3-J区特异性的反向引物(其具有(在3’端)与(VH或VL的)人恒定区同源的重叠序列(20bp))。用于VH和VL链扩增的PCR条件如下：94℃热启动5min；94℃20sec，68℃20sec，68℃45sec，35个循环，并且在68℃最终延伸7min。通过突出端克隆方法(RSHaun等，BioTechniques(1992)13，515-518；MZLi等，NatureMethods(2007)4，251-256)，将编码VH或VL的PCR产物作为cDNA克隆至表达载体中。表达载体含有由包括内含子A的5’CMV启动子和3’BGH多腺苷酸化序列组成的表达盒。除了表达盒，质粒含有pUC18-衍生的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，用于在大肠杆菌中质粒扩增。使用了基础质粒的两个变体：一个质粒含有设计来接受新扩增的VH链的人IgG恒定区，第二质粒含有人κLC恒定区以接受VL链。使用重叠引物，通过PCR扩增了编码κ或γ恒定区和VL/VH插入片段的线性化表达质粒。用T4DNA-聚合酶孵育纯化的PCR产物，产生单链突出端。通过添加dCTP停止反应。在下一个步骤中，将质粒和插入片段混合并且与recA孵育，其诱导位点特异性重组。将重组的质粒转化至大肠杆菌中。第二天，挑选生长的集落，并且通过质粒制备、限制性分析和DNA-测序，检查了正确的重组质粒。实施例6单价抗-TfR抗体的瞬时表达在F17培养基(InvitrogenCorp.)中培养的瞬时转染的HEK293细胞(人胚肾细胞系293衍生的)中，体内产生抗体。对于转染，使用“293-Free”转染试剂(Novagen)。从各单独的表达质粒表达如上所述的抗体和基于抗体的修饰分子。按照制造商说明书中说明，进行转染。在转染后三至七天，收集含有重组蛋白的细胞培养物上清液。将上清液储存在降低的温度下(例如，-80℃)，直至纯化。关于例如HEK293细胞中的人免疫球蛋白的重组表达的一般信息在：Meissner，P.等，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出。实施例7单臂转铁蛋白受体抗体的高通量纯化将96深孔平板中的50mL含有单臂抗体的澄清上清液加载于200μLMabSelectSuRe柱上。用pH7.4的PBS洗涤步骤后，使用Tecan/Atoll-系统，用2.5mMHCl洗脱蛋白质，获得0.5mL洗脱液。通过2MpH8的Tris中和洗脱液。使用Nanodrop分光光度计定量纯化的蛋白质并在变性和还原条件通过CE-SDS以及分析性SEC进行分析。为了获得具有高纯度(>95％)的蛋白质，大量抗体必须在大小排阻色谱上进一步纯化，以与半抗体、杵-杵抗体和较大聚集物分离。在下文中，使用DionexUltiMate3000，将500μL样品在含有140mMNaClpH6.0的20mM组氨酸中注射至Superdex20010/300GL上。此方法允许分级分离25-30个样品/天，并且因此可以以单臂模式整理(polishing)大量筛选命中物。将级分合并并再次按照上述进行分析。实施例8用于转胞吞试验的hCMEC/D3细胞培养物用于hCMEC/D3(Weksler,B.B.等，FASEBJ.19(2005),1872-1874)的培养基和补充剂获自Lonza。将hCMEC/D3细胞(传代26-29次)在胶原蛋白包被的盖玻片上(显微镜检查)或烧瓶中，在含有2.5％FBS，四分之一提供的生长因子和完全补充了提供的氢化可的松、庆大霉素和抗坏血酸的EBM2培养基中，培养至汇合。对于所有转胞吞试验，在12-孔细胞培养平板中使用了高密度孔(1×108孔/cm2)PET膜滤器插入物(0.4μm，12mm直径)。对于顶端和基底外侧室，计算的最佳培养基体积分别为400μL和1600μL。滤器插入物的顶端室用大鼠尾胶原蛋白I(7.5μg/cm2)，接着用纤连蛋白(5μg/mL)包被，每次孵育在RT下持续1小时。将hCMEC/D3细胞在EMB2培养基中生长10-12天至汇合单层(大约2×105细胞/cm2)。实施例9单价抗体的转胞吞试验整个试验在无血清EBM2培养基中进行(否则按照实施例1中所述的重构)。用单价抗体(浓度：2.67μg/mL)在顶端与具有细胞的滤器插入物在37℃孵育1小时，此后收集整个顶端和基底外侧培养基。从这些值，计算细胞旁侧流(paracellularflux)。将单层在RT在无血清培养基中在顶端(400μL)和基底外侧(1600μL)各自洗涤3×3-5min。搜集所有洗涤液以监控未结合抗体的除去效率。将预先温热的培养基加入顶端室中并且将滤器转移至含有1600μL预先温热的培养基的新12孔板中(用含有1％BSA的PBS阻断过夜)。在这点上，将滤器上的细胞在500μLRIPA缓冲液中裂解，以测定特异性抗体吸收。将剩余的滤器在37℃孵育并在不同的时间点收集样品，以测定抗体的顶端和/或基底外侧释放。使用高灵敏度IgGELISA定量样品中的抗体量(参见实施例3)。对于每个时间点，从三个滤器细胞培养物产生数据。实施例10转胞吞试验后灵敏的IgGELISA整个程序在RT下进行，使用自动化洗涤器用于洗涤步骤。384-孔平板用30μL/孔的PBS中的1μg/mL抗人/鼠-IgG(Fcγ特异性的)包被2小时，接着在含有1％BSA或1％CroteinC的阻断缓冲液PBS中孵育1小时(分别用于人和鼠IgG试验)。将来自转胞吞试验的连续稀释的样品和转胞吞试验中使用的标准浓度的抗体加入平板中并孵育2小时。四次洗涤后，加入30μL/孔的阻断缓冲液中的50ng/mL抗人/鼠-F(ab)2-生物素，并再孵育2小时。6次洗涤后，加入30μL/孔的50ng/mL(huIgG试验)或100ng/mL(mIgG试验)poly-HRP40-链霉亲和素(Fitzgerald；在含有1％BSA和0.05％Tween-20的PBS中)，并孵育30min。4次洗涤后，通过加入30μL/孔的BM化学发光底物(Roche)来检测免疫复合物。使用发光平板阅读器来测量发光信号，并且使用拟合的标准曲线来计算浓度。试验的灵敏度范围为10pg/mL至10ng/mL。实施例11通过用hTfR突变体转染的CHO细胞的细胞ELISA进行表位作图为了能够确定人转铁蛋白受体(hTfR)上的表位区，遵循如下依据，在表面暴露的氨基酸簇在比对的小鼠TfR序列中具有不同氨基酸的位置(参见下表)，将突变引入hTfR序列中：尽管人和鼠TfR之间显著的同源性(77％同一性)，但已知没有针对胞外部分的抗体在两个直系同源物之间显示出良好交叉反应性。以上描述了具有相应突变的质粒的克隆。为了作图人TfR结合剂与表位的结合，用所述的质粒瞬时转染CHO-K1细胞，并且在细胞ELISA中测量抗体结合。简而言之，在实验前一天，将104个细胞接种于96-孔板每孔的正常生长培养基(RPMI/10％FCS)中。另一天，将培养基换成OPTI-MEM血清减少培养基(Gibco)，并在30分钟预孵育后，将1200μLOPTI-MEM，12μg质粒DNA和12μLXtremeGENE转染试剂(Roche)的混合物的10μL加入孔中。将细胞在37℃/7.5％CO2下孵育2天，然后除去培养基并加入在生长培养基中1nM至100nM浓度的TfR抗体，接着在4℃孵育2h。此后，以PBS中的0.05％戊二醛替代抗体溶液，并且将细胞在RT下固定15min，然后用PBS洗涤两次，并用HRP-缀合的抗-人-Fc二抗(BioRad；ELISA阻断试剂(Roche)中1:2000)在RT下孵育1.5小时。用PBS洗涤3次后，使用50μLTMB/孔产生信号，并在450nm测量吸光度。实施例12用于人TfR抗体相互作用的基于表面等离子体共振的结合试验在配备有C1传感器芯片(GEHealthcare，目录编号BR1005-35)的BIAcoreB4000(GEHealthcare)上进行结合实验，其中根据供应商的手册，使用标准胺偶联化学程序，预先用抗人Fab抗体(GEHealthcare，目录编号28-9583-25)处理所述芯片。对于动力学测量，在25℃，在pH7.4，0.05％Tween20的磷酸盐缓冲盐水中，使用60秒的接触时间和10μL/min的流速，固定样品抗体。以递增浓度施加重组His6-标签的人转铁蛋白受体(R&Dsystems，目录编号2474-TR-050)，并且随着时间监控信号。记录30μL/min流速下150秒结合时间和600秒解离时间的平均时间跨度。使用1:1结合模型(Langmuirisotherm)来拟合数据。