预测一组克隆获得的生产细胞的相对补料分批生产效价的方法与流程

本发明涉及预测生产细胞的补料分批生产效价的方法。特别地，本发明涉及一组克隆获得的生产细胞的相对补料分批重组蛋白效价的方法。

背景技术：

CHO细胞克隆分离株作为生产细胞系的相对能力的早期预测是细胞系发展进程的一个关键的组成。在静态培养中明显多产的克隆在后续的补料分批培养性能上可大幅改变，两者都相对于细胞生长和产量来说。当前的最佳做法是在细胞系发育的早期，采用小规模的、可以比较50-100个克隆分离株的多平行生物反应器系统测定克隆性能。然而，这种方法仍然是昂贵和费时的。

本发明的目的是克服上面提到的至少一个问题。

技术实现要素：

申请人发现，生产细胞克隆在补料分批培养中的生产效价可以通过快速分析静态微孔板培养中对一种或多种功能不同的化学应激原(例如抑制剂和毒素)的克隆特异性重组蛋白生产响应而准确地预测。为了进行微孔板分析，将固定数量的克隆获得的细胞分配至含有分别放入分离的孔中的一种或多种化学细胞应激原的96-孔微孔板中。每种化学物质在细胞生长培养基中是可溶的，并通常在一浓度下被使用，该浓度经预先确定以使亲代CHO细胞在微孔板中的增殖抑制在LD₃₀至LD₈₀范围内。静态生长经过一生长期后(即3天)，采用HPLC蛋白A试验测定上清MAb的效价。对通过有限稀释克隆分离的表达IgG1MAb的12个CHO-S克隆进行微孔板分析，然后评价在锥形瓶(Ehrlenmayer flasks)中优化的补料分批培养性能(MAb效价[MAb]，整合活细胞浓度至50％细胞活力[IVCC₅₀])。使用多元线性模型证明，使用克隆特异性MAb效价微孔板特性(profile)，在微孔板中的克隆性能可以预测MAb效价(r²＝0.84)

在第一方面，本发明提供了预测查询生产细胞(query producer cell)在补料分批培养中的生产效价的计算机实施方法，所述方法包括以下步骤：

-采用一种或多种化学细胞应激原培养所述查询生产细胞；

-确定所述查询生产细胞在所述或每种化学细胞应激原存在下的生产效价响应，以得到查询细胞特异性生产效价响应特性；

-将所述查询细胞特异性生产效价响应特性输入一计算模型，其中所述计算模型从生产效价响应特性生成，所述生产效价响应特性从具有已知的补料分批生产效价的细胞的校正集获得，其中所述计算模型被配置成输出所述细胞的预测的补料分批生产效价。

在另一个方面，本发明提供了预测一组生产细胞在补料分批培养中的相对生产效价的计算机实施方法，所述方法包括以下步骤：

-采用一种或多种化学细胞应激原培养每种生产细胞；

-确定每种细胞在所述或每种化学细胞应激原存在下的生产效价响应，以得到该组生产细胞中的每种细胞的细胞特异性生产效价响应特性；

-将该一组生产细胞中的每种细胞的细胞特异性生产效价响应特性输入一计算模型，其中所述计算模型从生产效价响应特性生成，所述生产效价响应特性从具有已知的补料分批生产效价的细胞的校正集获得，其中所述计算模型被配置成输出该组生产细胞的预测的相对生产效价。

当一批新的克隆从亲代细胞系产生时，本发明的方法可以以快速和高产量的方式快速检测大量克隆的预测的补料分批(重组蛋白)生产效价，并据此进行排序，而不是对所有克隆或选择其中很少的克隆在生物反应器内进行昂贵、耗时的生长研究。这样就知道了将哪些克隆转至扩大/微生物反应器研究，例如，仅下面图X显示的优良克隆。

本发明的方法采用来自一组预验证克隆(生产效价已知的克隆)的数据(生产效价响应特性)和基于此数据的计算模型，理想地是多元线性计算模型，以根据新一组克隆的快速得到的化学指纹，对它们的相对补料分批重组生产效价进行预测。

优选地，所述方法包括根据预测的补料分批生产效价对所述克隆进行排序的附加步骤。

所述方法通常采用微量滴定板进行，其中每个检测在微量滴定板的一个孔内进行。适当地，每个克隆细胞的生长均在多孔板的孔内进行检测。当采用多种化学细胞应激原时，每个克隆将在单一的化学细胞应激原存在下进行检测。

通常，检测包括将克隆样品与化学细胞应激原混合，培养所述混合物1至4天，通常2至4天，优选是60-80小时，理想地大约3天，并检测细胞的生长水平。适当地，提供的克隆样品的浓度是0.1至1.0×10⁶个细胞/ml混合物。通常，提供的生物反应器相关化学细胞应激原的浓度是0.5至2×IC50，理想情况下是大约1×IC50。

适当地，在培养少于5天的时间后，检测每个克隆的生长。理想地，在培养1-4天的时间后，理想是2天和3天后，检测每个克隆的的生长。

优选地，同时检测每个克隆的生长。通常，所述培养步骤是在静态微孔板培养中进行。

在一优选的实施例中，本发明提供了预测一组克隆生产细胞在补料分批培养中的相对生产(即单克隆抗体)效价的快速的、高通量的计算机实施方法，所述方法包括以下步骤：

-采用多种单独的、功能不同的化学细胞应激原在静态微孔板培养中同时培养每种生产细胞少于4天的时间；其中所述化学细胞应激原选自氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、渗透应激源、氧化应激源、细胞凋亡的诱导剂、代谢效应物、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素中的至少两种；

-在培养期之后，确定每种细胞在单独的每种化学细胞应激原存在下的生产效价响应，以得到该组生产细胞中的每种生产细胞的细胞特异性生产效价响应特性；

-将该一组生产细胞中的每种生产细胞的细胞特异性生产效价响应特性输入一计算模型，其中所述计算模型从生产效价响应特性生成，所述生产效价响应特性从具有已知的补料分批生产效价的生产细胞的校正集获得，其中所述计算模型被配置成输出该组生产细胞的预测的相对补料分批生产效价。

所述化学细胞应激原是通过一种或多种细胞通路减少细胞生长的化学物质。适当地，该多种化学细胞应激原包括至少2、3、4、5或6种不同功能的化学细胞应激原，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24或25种不同的应激原。通常，所述多种化学细胞应激原选自由氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、渗透应激源、氧化应激源、细胞凋亡的诱导剂、代谢效应物、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素组成的组。这些是不同功能的化学细胞应激原的例子。通常，所述多种化学细胞应激原包括选自由氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、渗透应激源、氧化应激源、细胞凋亡的诱导剂、代谢效应物、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素组成的组中的至少4、5、6或7种的应激原。

在另一个方面，本发明提供了一种微量滴定板，其包括至少24、48或96个孔，多种化学细胞应激原分别置于至少一些孔内。通常，所述板包含至少6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24或25种化学细胞应激原。适当地，每种化学细胞应激原置于所述板的至少两个或三个孔内(即两个复份或三个复份)。

优选地，所述多种化学细胞应激原选自2-氨基双环-(2,2,1)-庚烷-羧酸(BCH)、D-苯丙氨酸、α-(甲基氨基)异丁酸(MeAIB)、丁酸钠(NaBu)、环己酰亚胺、氯化铵、二水乙酸镉、氯化钴(CoCl₂)、氯化钠(NaCl)、乳酸钠(Na Lac)、氨基三唑(AMT)、甲萘醌亚硫酸氢钠(MSB)、丁硫氨酸亚砜胺(BSO)、巯基琥珀酸(MS)、2,4二硝基苯酚(24DNP)、草氨酸钠、2-脱氧葡萄糖(2dg)、3-溴丙酮酸(3-BrPA)、二氯乙酸盐(DCA)、6-重氮-5-氧代-1-正亮氨酸(l-don)、丙戊酸(Val)、原矾酸钠(NaV)、柠檬酸、FK866、乳酸。

在另一个方面，本发明提供了一种微量滴定板，其包括至少24、48或96个孔，一种或一种以上(通常是多种)化学细胞应激原分别置于至少一些孔内，其中当采用多种不同化学细胞应激原时，所述化学细胞应激原包括选自由氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、渗透应激源、氧化应激源、细胞凋亡的诱导剂、代谢效应物、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素组成的每一组中的至少一种化学细胞应激原。

在一个实施例中，本发明提供包括至少96个孔的微量滴定板，至少23种化学细胞应激原分别置于所述板的孔内，其中所述化学细胞应激原基本上由2-氨基双环-(2,2,1)-庚烷-羧酸(BCH)、D-苯丙氨酸、α-(甲基氨基)异丁酸(MeAIB)、丁酸钠(NaBu)、环己酰亚胺、氯化铵、二水乙酸镉、氯化钴(CoCl₂)、氯化钠(NaCl)、乳酸钠(Na Lac)、氨基三唑(AMT)、甲萘醌亚硫酸氢钠(MSB)、丁硫氨酸亚砜胺(BSO)、巯基琥珀酸(MS)、2,4二硝基苯酚(24DNP)、草氨酸钠、2-脱氧葡萄糖(2dg)、3-溴丙酮酸(3-BrPA)、二氯乙酸盐(DCA)、6-重氮-5-氧代-1-正亮氨酸(l-don)、丙戊酸(Val)、原矾酸钠(NaV)、柠檬酸、FK866、乳酸组成。

在另一方面，本发明提供了一种适合执行本发明方法的套装(kit)，包括(a)本发明的微量滴定板，(b)微量滴定板读数器，及(c)计算机程序，所述计算机程序包括用于以下的程序指令：(i)从确定系统(例如，HPLC)接收每个克隆在每种化学细胞应激原存在和不存在下的生产效价值，(ii)计算每个克隆在所述或每种化学细胞应激原存在下的归一化生产效价值，(ii)将克隆特异性生产效价响应特性输入一计算模型中，所述克隆特异性生产效价响应特性包括每个克隆在所述或每种化学应激原存在下的归一化生产效价值，其中所述计算模型从生产效价响应特性生成，所述生产效价响应特性从具有已知的生产效价值的克隆的校正集获得，其中所述计算模型被配置成输出每个克隆的预测的补料分批生产效价值(及可选地预测一组克隆细胞的相对补料分批生产效价值)，及(iii)输出每个克隆的所述预测的补料分批生产效价值(及可选地预测一组克隆细胞的相对补料分批生产效价值)。

在另一方面，本发明提供了一种适合执行预测一组克隆生产细胞的相对补料分批生产效价的方法的套装，所述克隆生产细胞获自单一亲代宿主细胞群，所述套装包括(a)本发明的微量滴定板，(b)微量滴定板读数器，及(c)计算机程序，所述计算机程序包括用于以下的程序指令：(i)从一合适的机器接收在一种或多种化学细胞应激原存在和不存在下生长的每个克隆的生产效价值，(ii)计算每个克隆在所述或每种化学应激原存在下的归一化生产效价值，(ii)将克隆特异性生产效价响应特性输入一计算机模型中，所述克隆特异性生产效价响应特性包括每个克隆在所述或每种化学应激原存在下的归一化生产效价值，其中所述计算模型从生产效价响应特性生成，所述生产效价响应特性从具有已知的生产效价值的克隆的校正集获得，其中所述计算模型被配置成输出每个克隆的预测的补料分批生产效价值和预测一组克隆细胞的相对补料分批生产效价值，及(iii)输出该组克隆细胞的预测的相对补料分批生产效价值。

用于确定克隆的生产效价的确定系统可以是任何合适的机器，例如适于定量检测目标重组蛋白的HPLC或质谱仪。

本发明还提供了用于执行预测获自单一细胞系的克隆生产细胞的补料分批生产效价的方法的计算机实施系统，所述系统包括：

-确定系统，用于检测所述克隆在一种或多种单独的化学细胞应激原存在和不存在(通常是多种单独的化学应激原)下的生产效价，以提供所述克隆在一种或多种应激微环境中的归一化生产效价响应值；

-计算模型，适于处理克隆特异性生产效价响应特性，所述克隆特异性生产效价响应特性包括所述克隆在所述或每种应激微环境中的归一化生产效价响应值，其中所述计算模型从生产效价响应特性生成，所述生产效价响应特性从已知补料分批生产效价响应特性的克隆的校正集获得，其中所述计算模型被配置成输出所述克隆的预测的补料分批生产效价值，及

-装置，用于输出所述克隆生产细胞的预测的补料分批生产效价。

本发明还提供了用于执行预测一组获自单一细胞系的克隆生产细胞的相对补料分批生产效价的方法的计算机实施系统，所述系统包括：

-确定系统，用于检测每个克隆在多种单独的化学细胞应激原存在和不存在下的生产效价，以提供每个克隆在多种应激微环境中的归一化生产效价响应值；

-计算模型，适于处理克隆特异性生产效价响应特性，所述克隆特异性效价响应特性包括每个克隆在每种应激微环境中的归一化生产效价响应值，其中所述计算模型从生产效价响应特性生成，所述生产效价响应特性从已知补料分批生产效价响应特性的克隆的校正集获得，其中所述计算模型被配置成输出每个克隆的预测的补料分批生产效价值和/或该组克隆细胞的预测的相对补料分批生产效价，及

-装置，用于输出(i)所述组中的一个或多个克隆的预测的补料分批生产效价，或(ii)所述组的克隆细胞的预测的相对补料分批性能，或(iii)兼具(i)和(ii)两者。

通常，所述确定系统包括HPLC，尽管可以采用适于定量检测靶蛋白的其它系统，例如，定量ELISA。

适当地，所述计算模型是多元线性计算模型。理想地，所述多元线性计算模型适当地采用最小二乘解以将参数(即细胞特异性生产效价响应水平)拟合至观察到的补料分批生产效价。

本发明也提供了一种计算机程序，当其在计算机上执行时，引起所述计算机执行本发明预测一组获自单一细胞系的克隆细胞的相对补料分批生产效价的方法。

本发明也涉及到储存本发明的计算机程序的计算机程序记录介质。

附图说明

图1：在补料分批培养中，从来自共同的亲代细胞系的一组12个克隆细胞系获得的最大单克隆抗体效价。

图2：一组12个克隆细胞系在特异性化学应激原存在下获得的产品效价的范围。

图3：采用化学特异性MAb响应预测最大MAb效价的多元线性模型拟合优度的可视化表示。

图4：模型预测新数据的能力的图解。这里，使用所指出的模型参数，使用“留一法”交叉验证函数用新数据预测最大MAb效价。

具体实施方式

在一方面，本发明涉及筛选一组获自单一细胞系的生产细胞克隆的方法，以根据补料分批生产效价将所述克隆分层(stratify)。所述方法包括采用和不采用一种以及通常是多种的单独的化学细胞应激原培养每个克隆样品一段时间，通常是至少24小时和不大于4或5天，以获得所述克隆的多个归一化生产效价响应值。这些生产效价响应值提供了形成克隆特异性生长响应特性的克隆特异性生产效价响应的特异性模式。采用多元线性计算模型以将所述生产效价响应特性与来自已知补料分批生产效价的克隆的校正集的多个生产效价响应特性关联起来，并预测该组克隆中的一个或多个克隆的补料分批生产效价。然后将来自所述组的克隆根据预测的补料分批生产效价进行排序，这能够选择出生产克隆用于进一步的开发。

在此说明书中，术语“快速的、高通量的”应该理解为指该方法可以在四天或更短时间内进行，以及其中在培养周期期间的细胞的培养可以在微量滴定板的孔中进行。

应用于特异性生产细胞克隆的术语“生产效价”或“生产效价响应”指所述特异性生产细胞克隆在限定的时间段内产生的特异性蛋白质(通常是重组蛋白，以及理想的是重组单克隆抗体)的量。所述效价可以以绝对的或相对的术语量化。通常，效价被称为每体积培养物的产品的重量——克每升(g/L)是一种常见的度量标准(最大效价)。通常，将所述克隆培养一特定的时间段，例如2-4天，在培养时期后，通常取上层清液样品并检测生产效价。用于测定生产效价的各种方法对本领域技术人员来说是显而易见的，包括HPLC和定量ELISA。

在许多情况下，用于本发明方法的生产效价将会是归一化生产效价响应，意思是当在所述化学细胞应激原存在和不存在下测定时，所述细胞的生产效价响应间的差别。

术语“生产细胞”是指被用来产生特异性的所需要的蛋白质的细胞。一般来说，所述细胞经基因修饰以包含编码所需的蛋白质的转基因的一个或多个拷贝，所述所需的蛋白质通常处于特异性启动子的控制下。因此，特异性蛋白质通常是重组蛋白。生产细胞在本领域中是熟知的，包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仑鼠肾(BHK)细胞。理想地，生产细胞是CHO细胞。通常，所述生产细胞是单克隆抗体生产细胞。

术语“生产效价响应特性”是指给定的克隆对一种或多种化学细胞应激原的生产效价响应。在一个实施例中，所述特性可包括给定的克隆的单一生产效价响应(在一种化学细胞应激原存在和通常不存在下，所述细胞的生产效价响应)。在其它实施例中，所述生产效价响应特性包括多个生产效价响应或给定的克隆(在多种单独的化学细胞应激原存在和可选地不存在下，所述细胞的生产效价响应)。一般来说，所述特性使用归一化的生产效价响应生成(应激原不存在下的生产效价减去应激原存在下的生产效价)，以便获得归一化的生产效价响应特性。然而，在所述特性使用超过一种应激原生成的情况下，可以使用仅来自应激微环境(即不控制生产效价)的生产效价生成的特性。

本发明的方法采用生产细胞的快速分析以预测补料分批培养时所述细胞的生产效价。在本说明书中，术语“补料分批”或“补料分批培养”应理解为指细胞的扩展培养，其中接种所述细胞后，以大团(bolus)的形式添加额外的营养物至少一次。

术语“克隆的校正集”指的是多个克隆，每个克隆都有生产效价响应指纹和已知的补料分批性能。一般来说，所述克隆的校正集包括显示一系列补料分批性能能力的克隆，从终端用户认为“良好”的表现者到终端用户认为“差”的表现者。适当地，所述克隆的校正集包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24或26个克隆。

术语“应激微环境”应理解为包括化学细胞应激原的环境。一般来说，这意味着检测克隆在所述化学细胞应激原存在下在微量滴定板孔中的生长。

在本说明书中，术语“快速”应理解为指预测补料分批性能的方法耗时少于5天，理想是少于4或3天。

在本说明书中，术语“高通量”应理解为指一种可以同时检测大量样品例如20-500个样品的方法。在一个实施例中，这涉及检测多孔板(例如48、96或192孔板)中所述克隆的生长。

在本说明书中，应用于克隆生产细胞的术语“预测的补料分批生产效价”应理解为指所述克隆在补料分批培养中的预测的补料分批生产效价。所述预测的生产效价可以用绝对术语定量，或可以用相对术语定量，即相对于具有已知的良好或差的生产效价的克隆或相对于一组克隆。

在本说明书中，术语“预测相对生产效价”应理解为指预测该组中的克隆相对彼此的补料分批生产效价。因此，在一个实施例中，所述克隆根据它们的预测的补料分批生产效价分层。同样地，术语“一组克隆细胞的预测的相对补料分批生产效价”应理解为指在所述组中的克隆相对彼此的预测的补料分批生产效价。因此，在一个实施例中，所述克隆根据它们的预测的补料分批生产效价分层。在另一个实施例中，所述克隆被分层以选出一个或多个显示出最好的预测的补料分批生产效价克隆的克隆、一个或多个显示出最差的预测的补料分批生产效价克隆的克隆，或两者。

在本说明书中，术语“克隆生产细胞的组”应理解为指获自单一细胞系的一组克隆生产细胞群，包括2个至500个或更多克隆生产细胞群。产生克隆生产细胞的组的方法是本领域技术人员熟知的，且在Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells(2004),Wurm,Florian M,New York,NY,Nature Biotechnology 22(2004),S.1393-1398中有描述。通常，所述克隆生产细胞群的组包括10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500或100-500个克隆细胞群。通常，所述克隆生产细胞群的组包括100-500、100-400、150-400、150-350个克隆细胞群。

在本说明书中，术语“计算模型”通常是指多元线性计算模型。理想地，多元线性计算模型采用最小二乘解以将参数(即细胞特异性生产效价响应水平)拟合至观察到的补料分批生产效价。

在本说明书中，术语“化学细胞应激原”应该被理解为指能够在细胞培养基中与细胞一起培养并能够通过一种或多种细胞通路减少细胞生长的化学物质。优选地，所述化学细胞应激原在细胞培养基中是可溶的。化学细胞应激原(细胞应激原类型)的实例包括细胞通路抑制剂、细胞毒素(对细胞尤其是哺乳动物细胞有毒的化学物质)、代谢效应物和使所述细胞应激的化学物质。抑制剂的实例包括氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂和糖酵解抑制剂。使细胞应激的化学物质的实例是渗透或氧化应激源。通常，化学细胞应激原在抑制细胞繁殖的数量为LD₃₀至LD₈₀范围内使用。适当地，所述化学细胞应激原在浓度为0.5至2×IC₅₀下使用。通常，每种细胞样品(即每个克隆的样品)采用至少三种不同的细胞应激原分别培养。优选地，每种细胞样品(即每个克隆的样品)采用至少三种不同类型的细胞应激原(例如，氨基酸转运抑制剂、糖酵解抑制剂和渗透应激源)分别培养。适当地，该多种化学细胞应激原包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24或25种应激原。通常，所述多种化学细胞应激原选自由氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、渗透应激源、氧化应激源、细胞凋亡的诱导剂、代谢效应物、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素组成的组。通常，所述多种化学细胞应激原包括选自由氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、渗透应激源、pH调节剂、氧化应激源、细胞凋亡的诱导剂、代谢效应物、糖酵解抑制剂和毒素组成的组中的至少4、5、6或7种。化学细胞应激原的实例包括：

BCH(AA转运抑制剂)

D-苯丙氨酸(AA转运抑制剂)

MeAIB(AA转运抑制剂)

丁酸钠(细胞周期抑制剂)

环己酰亚胺(毒素)

氯化铵(毒素)

氯化钴(细胞凋亡的诱导剂)

NaCL(渗透应激源)

乳酸钠(代谢效应物)

氨基三唑(氧化应激源)

甲萘醌亚硫酸氢钠(氧化应激源)

巯基琥珀酸(氧化应激源)

2,4二硝基苯酚(代谢效应物)

草氨酸钠(糖酵解抑制剂)

2脱氧葡萄糖(糖酵解抑制剂)

3溴丙酮酸(糖酵解抑制剂)

二氯乙酸盐(糖酵解抑制剂)

L-don(AA合成抑制剂)

丙戊酸(细胞周期抑制剂)

原矾酸钠(细胞周期抑制剂)

FK866(细胞凋亡诱导剂)

柠檬酸/乳酸(pH调节剂)

“IC50”：为了建立抑制浓度，将“内部的(in house)亲代CHO”细胞在96孔板中在一系列浓度的目标化学物质存在下培养三天(72小时)。采用化学活细胞数量试验(来自Life Technologies,UK的"Presto Blue")确定生长。将在所述化学浓度存在下的生长与对照细胞生长(即在0mM抑制性化学物质存在下)进行比较，以产生化学浓度与相对于对照的生长百分比的曲线。使用该曲线建立IC“X％”浓度。

实验

细胞培养：

采用的克隆是CHO-S衍生克隆，所述CHO-S衍生克隆是来自由Cobra biologics(Keele，UK)提供的产生单克隆抗体的亲代克隆(克隆38)。这些此后称为“PM-CHO”。将PM-CHO细胞在CD-CHO培养基(Invitrogen，Paisley，UK)、8mML-谷氨酰胺(Invitrogen，Paisley，UK)、1％HT补充物(Invitrogen，Paisley，UK)12.5μg/ml嘌呤霉素(Invitrogen，Paisley，UK)中培养。按照交替3/4天方案，将细胞常规传代培养。

补料分批研究：

补料分批研究使用市场上可购买的进料和培养基在60ml体积的摇瓶中进行。在第4、6、8和10天，添加6毫升大团的进料。每天采集样品，分析细胞生长和单克隆抗体效价。

单克隆抗体效价的确定：

采用HPLC方法，该方法采用“Biomonolith”蛋白质A柱(Aglient，Workingham，UK)。单克隆抗体根据洗脱液中UV吸收峰下的面积量化。这被证明是与样品中的抗体浓度成线性比例。

执行本发明的方法：

从详细的文献调查，鉴定了多种被预期给出补料分批性能信息的化学物质。这些是：

2-氨基双环-(2,2,1)-庚烷-羧酸(BCH)

D-苯丙氨酸-(D-Phe)

α-(甲基氨基)异丁酸(MeAIB)

丁酸钠(NaBu)

环己酰亚胺

氯化铵

二水乙酸镉

氯化钴(CoCl₂)

氯化钠(NaCl)

乳酸钠(NaLac)

氨基三唑(AMT)

甲萘醌亚硫酸氢钠(MSB)

丁硫氨酸亚砜胺(BSO)

巯基琥珀酸(MS)

2,4二硝基苯酚(24DNP)

草氨酸钠

2-脱氧葡萄糖(2dg)

3-溴丙酮酸(3-BrPA)

二氯乙酸盐(DCA)

6-重氮-5-氧代-1-正亮氨酸(l-don)

丙戊酸(Val)

原矾酸钠(NaV)

柠檬酸

FK866

乳酸

采用“内部的”亲代细胞系，通过生长的研究，鉴定了上述化学物质的抑制剂量50(IC₅₀)浓度。此处IC₅₀被定义为3天内抑制50％正常细胞生长的考虑中的所述化学物质的浓度。一旦建立了IC₅₀，即可在96孔板中加入IC₅₀浓度的上面选择的化学物质，对照孔内仅含细胞生长培养基。

一组数量为12的单克隆抗体生产克隆细胞系在内部通过有限稀释克隆方法使用PM亲代细胞系生成。将这些克隆经补料分批研究以评估它们的补料分批产品生产能力。此处，这被定义为在补料分批运行期间得到的最大容积产品效价。克隆组在补料分批期间获得的最大效价的范围在图1中说明。

每个克隆细胞系在含有上文所提到的化学物质的96孔板中培养3天。在这个期间之后，采用上文所描述的“HPLC”试验测定板中的化学特异性产品效价的水平(即在如上文所提到的化学物质存在和不存下的MAb效价——归一化生产效价)。这能够使每个克隆细胞系的化学特异性产品生产指纹被鉴定(上文称为克隆特异性生产效价响应特性)。此处，产品生产指纹被定义为在每种化学微环境中的多个产品生产水平。

所述组的克隆的化学特异性生产力的范围在图2中说明。

使用来自这些化学特异性产品生产指纹的信息，使用对单独的化学物质的响应作为参数，建立多元线性模型。

多元线性模型被定义为满足以下方程的模型。

$\widehat{\mathrm{\β}}={\left(X^{T}X\right)}^{-1}{X}^{T}y={\left(\frac{1}{n}{\mathrm{\Σx}}_i{x}_i^T\right)}^{-1}(\frac{1}{n}\Σx_i{y}_i).$

其中，X代表包含来自解释变量的合适数据的矩阵，及Y是因变量(或响应变量)的向量。这是从本质上发现最小二乘解以将参数(即化学特异性产品生产的水平)拟合至观察到的分批补料性能(此处定义为最大MAb效价)。

从多个克隆微环境建立的多元线性模型的实例是

最大MAb效价＝37.78*(对照板效价)-22.4150*(MeIAB板效价)+0.4711

其中最大Mab效价是在补料分批培养中获得的最大单克隆抗体效价。说明使用上述参数的模型拟合优度的图如图3所示。这个模型的R²值是0.84。这可以理解为84％的数据的行为可以通过所述模型解释。

通过采用自助交叉验证技术可表明，按照上面方式建立的模型可预测未来的数据，即模型中未使用的数据。图4说明了建模方法建立预测模型的预测能力。采用这个模型，获得了多个R²为0.68，用于预测新数据。

这种模型建立在具有已知的补料分批性能的一组克隆的基础上，它可以使用新克隆的“指纹”，并能够预测它们的相对补料分批性能。首先，使用一组具有已知的补料分批性能的克隆生成模型(在上面的实例中使用了12个，但没有限制可以使用多少个——然而，模型建立的复杂性受到使用的克隆数量的限制)。随后，当在细胞系发育过程得到一大组的克隆时，这些克隆将在多种微环境平板中进行“筛选”，并且利用从具有已知的性能特点的克隆生成的所述模型，可以预测最大Mab效价，将所述克隆排序或至少给出有关它们的未来补料分批性能能力的可能性的信息，从而帮助选择将哪些克隆转到克隆筛选的下一阶段(即小规模的补料分批研究)。

在本发明中描述的实施例可选地包括计算机设备和/或在计算机设备中执行的过程。然而，本发明也延伸至计算机程序，尤其是储存在或在载体中的计算机程序，其适合实施本发明。所述程序可以是以下形式：源代码、对象代码、或代码中间源和目标代码，比如部分编译的形式或适合在根据本发明的实现方法中使用的任何其它形式。所述载体可包括存储介质，比如ROM，例如CD ROM，或磁记录介质，如记忆棒或硬盘。所述载体可以是电或光信号，所述电或光信号可通过电力或光学电缆或通过无线电或其它方式传输。

在本说明书中，术语“包含(comprise)、包含(comprises)、包含(comprised)和包含(comprising)”或任何其变形被认为是完全地可互换的，它们全部应该被提供最广泛的可能解释，反之亦然。

本发明并不限于在上文中描述的实施例，可以对这些实施例的实施和细节进行更改，但并不能背离本发明的精神。