整料的制作方法
本发明涉及用于处理流体样品的整料(monolith)、以及制造和使用这样的整料的方法。
背景技术：
大多数一次性护理点诊断设备利用色谱和/或侧流方法，以硝化纤维素膜、玻璃纤维缀合垫和纤维素吸收垫构成基本材料，如milliporerapidlateralflowteststrips：considerationsforproductdevelopment.lit.no.tb500en00，rev.b，05/08，diagnostics-08-00161，pages37-38，2008中和lateralflowimmunoassay.wongandtse，humanapress，2009：isbn978-1-58829-908-6；isbn978-1-59745-240-3；doi10.1007/978-1-59745-240-3中所述。在许多情况下，此类设备由全部三种材料构成，如milliporehi-flowplusmembranesandsurewickpadmembranes，lit.no.pb1267en00，rev.05/08，diagnostics-08-00087，2008中所述。
这些是用于确定生物样品中特定抗原如激素或药物存在的单步一次性设备。
侧流测试通常由一系列至少四个排列成线性系列的芯段构成。这些段中的每一个通常由特定的材料制成，所述材料具有定制为在总体分析中最佳地发挥特定作用的性质。
将应用于典型测试条带的样品首先拉伸成通常由非织造吸水纤维制成的样品垫。样品垫起到滤除固体、并且通过例如向样品基质中释放缓冲液来改变样品流体以与下游检测组分相容的作用。
样品垫后面的段通常含有一些检测试剂。在最常见的检测配置中，抗体涂布的有色珠粒被扫入经过的样品流体中。
样品然后被芯吸(wick)到硝化纤维素检测段中，在这里，至少一种其他抗体已被固定于捕获线中。通常包括对照线。当结合了分析物的缀合珠粒通过捕获线时，它们将被固定化的抗体所保留。如果足够数量的珠粒在给定的线处被捕获，则会发生可见的颜色。
在流体通过捕获线之后，其将被芯吸到最终的吸收垫中，吸收垫具有足以确保足够的量的样品被芯吸通过捕获线的流体容量。
最近，两种市售材料已被作为大多数侧流测试设备中各种构成材料的单一基质替代物出售。这些材料的显著特征在于，可使用任一者的单个单元作为整个测试条带而无需调适处理并且在区之间无机械接头。
fusion5(whatman)为由涂布了亲水聚合物的粘结玻璃纤维制成的材料。在结构上，这些膜与最常用于样品垫、缀合垫和槽的材料相似。fusion5与使用的典型材料的区别在于惰性的生物相容聚合物涂层，其消除了制造过程中对任何再润湿或阻断步骤的需要。另外，如果用涂布了捕获试剂的大珠粒浸渍，则该材料也可承担经典的硝化纤维素检测段的作用。在孔隙大小尺度上的珠粒不会迁移通过基质。
4castchip(johnsenandjohnsen)由以条带的形式布置于刚性塑料支承物上的微米尺度柱的规则阵列形成。所述柱通过注塑形成并且通过葡聚糖进行亲水化。这些柱阵列通过毛细力芯吸并可因此实现纤维和铸制硝化纤维素膜二者的功能。芯片在其与蛋白质上的氨基基团呈反应性的条件下递送，因此捕获抗体可通过简单地将抗体溶液点在基质上而共价地固定于柱结构上。
技术实现要素：
本发明基于以下的发明人见解：存在对改进的替代流体处理材料的需要，所述改进的替代流体处理材料满足易于使用、支持的化学品多样化、制造的经济性、高的灵敏度并且易于功能化的标准。
虽然是功能性并且可得到的，但硝化纤维素具有若干主要缺点。第一，市售硝化纤维素膜具有均一的组成和/或平均的孔隙尺寸，这将限制工艺的多样性和/或每一具体工艺可取得的化学性质。第二，高的光密度和高的光后向散射将限制进入到硝化纤维素膜中的可见深度(通常-10微米)，从而限制诊断设备的检测灵敏度。
已知其他更复杂的测试条带。然而，复杂的布置和多个部件意味着这些测试条带的制造可能昂贵。
在整个发达和发展中世界，迫切需要高度灵敏且特异性的可靠且可负担的使用点和/或护理点诊断和分析技术。然而，这样的诊断不是广泛可用的，主要是因为它们不是成本有效的和/或难以使用。此外，对于一些用途，非常需要提供一次性需求点诊断。对于任何一次性的测试设备，成本成为关键问题。
在资源有限的环境中，基于简单浸棒/测试棒的测试的成本必须接近每个单元1美元。显然，该成本限制将排除复杂的制造方法和设置。
本发明人已发现，可将某些单体和单体的组合聚合以提供高效地自芯吸(self-wick)流体的聚合型整料，从而为护理点/现场诊断和分析提供方便的工具。这些自芯吸聚合型整料易于贮存和运输，其制造比较符合成本效益，允许分析物分子的良好检测并易于通过其他化学部分的浸渍和/或共价接枝到整个整料或区中而功能化。
在使用中，从测试过程的开始到结束，作为分离的流体或在载体流体中的分析物样品可流过自芯吸整料而不需要泵或其他动力设备。
本发明基于以下发明人见解：由包含具有至少一个-c(r)2o-基团的连接体的可聚合组合物形成的整料将为流体处理和流体诊断提供有用的工具。本发明因此涉及使用包含具有至少一个-c(r)2o-基团的连接体的单体制造整料的方法、包含具有至少一个-c(r)2o-基团的连接体的整料和使用这样的整料的方法。本发明人已发现，由具有至少一个-c(r)2o-基团的单体和亲水的单体形成的整料尤其适合于这些目的中的许多。
在第一个方面，本发明可提供一种制造用于处理流体样品的自芯吸整料的方法，所述方法包括：
-提供亲水单体和连接体单体，所述连接体单体具有由包含至少一个-c(r)2o-基团的连接体间隔开的两个可聚合基团；
任选地其中提供一种或多种另外的单体；
-通过在致孔溶剂中合并所述亲水单体和连接体单体来获得可聚合组合物；和
-聚合所述可聚合组合物以形成整料。
每一个r可为氢或可为任何有机基团。换句话说，连接体可包含烷基或被取代的烷基链-(c(r)2)n-，其中至少一个、优选地至少两个-c(r)2-基团被氧所代替。合适地，n为3至20，例如，5至15，例如，5至13。r基团可自身包含另外的可聚合基团。换句话讲，优选地连接体为聚醚，例如聚乙二醇或类似物。合适地，连接体包含聚乙二醇链，例如含1、2、3、4、5或更多个-oc(r)2c(r)2-基团，例如1、2或3个-oc(r)2c(r)2-基团。
聚合步骤形成聚合物基质，即单体聚合得到为基本连续的聚合物网络的整料。所述整料可因此宽泛地称为宏观尺度单分子。
在聚合步骤之后，可将整料与残余的未聚合材料分离开来。残余的未聚合材料可为未聚合的单体、未结合到聚合物基质的短低聚物链、引发剂副产物和/或残余的溶剂。
合适地，残余的未聚合材料可在洗涤步骤中移除(即，洗去)。此残余的未聚合材料可为固体和/或液体。例如，在洗涤步骤中，可用醇和/或水洗涤整料。洗涤步骤可包括通过施加压差迫使液体通过整料。
在一些优选的方法中，整料首先用醇(例如，甲醇、乙醇或异丙醇)洗涤，然后用水洗涤。例如，整料可用醇洗涤三次，然后用水洗涤三次。
合适地，整料然后被干燥直至恒重(即，不再有溶剂残留)。对于干燥步骤，可使用真空烘箱。
连接体单体的可聚合基团中的每一个可包含乙烯基部分。例如，连接体分子的每一个可聚合基团可独立地选自丙烯酰基或甲基丙烯酰基。
在一些实施方案中，连接体选自-o-ch2-ch2-o-；-(-o-ch2-ch2-)n-o-，其中n选自2、3、4或5；-o-ch2-ch(oh)-ch2-o-；和-o-ch2-ch(oh)-ch2-ch(oh)-ch2-ch(oh)-ch2-o-。
应理解，连接体单体可包含另外的可聚合基团，例如，连接体可为-och2-c(ch2o---)(ch2ch3)-ch2o-，其中，----表示与另外的可聚合基团的键。
合适的此类连接体单体包括乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、四(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、四(乙二醇)二丙烯酸酯和二(乙二醇)二甲基丙烯酸酯。
合适地，亲水单体为丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯，例如，亲水单体可为甲基丙烯酸2-羟乙酯(hema)、丙烯酸2-羟基酯、丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟丙酯或丙烯酸2-羟丙酯。在一些优选的实施方案中，其为甲基丙烯酸2-羟乙酯。
当然，应理解，可使用不止一种连接体单体。因此，在一些实施方案中，将两种或更多种不同的连接体单体与亲水单体在致孔溶剂中合并。在一些实施方案中，仅使用一种连接体单体。在一些实施方案中，使用两种连接体单体。在一些实施方案中，使用三种连接体单体。连接体单体的组合可产生改善的整料物理性质。
连接体单体的一些优选组合包括：乙二醇二甲基丙烯酸酯和四乙二醇二甲基丙烯酸酯；乙二醇二甲基丙烯酸酯和四乙二醇二丙烯酸酯。例如，连接体单体的组合可为乙二醇二甲基丙烯酸酯和四乙二醇二丙烯酸酯，例如比率为4∶3至1∶3，例如比率为1∶1至1∶3，例如比率为2∶3至7∶10。例如，连接体单体的组合可为乙二醇二甲基丙烯酸酯和四乙二醇二甲基丙烯酸酯，例如比率为5∶1至1∶1，例如比率为约3∶1。
例如，四乙二醇二甲基丙烯酸酯对亲水单体如hema的比率可为5∶2至1∶3，例如2∶1至1∶1。在一些实施方案中，四乙二醇二甲基丙烯酸酯对亲水单体如hema的比率可为1∶1至7∶10。例如，四乙二醇二丙烯酸酯对亲水单体如hema的比率可为5∶2至1∶3，例如2∶1至1∶1。在一些实施方案中，四乙二醇二丙烯酸酯对亲水单体如hema的比率可为1∶1至7∶10。
可聚合组合物可还包含一种或多种另外的单体。相应地，在一些实施方案中，将一种或多种另外的单体与亲水单体在致孔溶剂中合并。包含所述另外的单体可改变整料的物理特性和/或可赋予整料以功能性。
例如，至少一种另外的单体可为官能化的单体。所述官能化的单体可具有选自以下的部分：适于与可接枝化合物的反应性基团反应以将化合物共价地接枝到整料的化学反应性基团；ph敏感基团；适于分析物的直接固定化的基团；染料、荧光团、发色团或猝灭剂；固定化的蛋白；和固定化的天然或人工核酸分子，例如，dna或rna分子。这些基团将在本说明书中于后文详细描述，但作为实例而非限制，另外的单体可包含以下侧链或基团中的至少之一：氨基、羧基、聚乙二醇、烷基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、酰基卤、巯基或叠氮化物。
所述或每一另外的单体(如果存在)可包含以下侧链或基团中的至少之一：氨基、羧基、聚乙二醇、烷基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、酰基卤、巯基或叠氮化物。例如，在一些实施方案中，另外的单体可选自甲基丙烯酸2-氨基乙酯、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯、甲基丙烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯、甲基丙烯酸n-羟基琥珀酰亚胺酯、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯、琥珀酸单-2-(甲基丙烯酰氧基)乙酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸烯丙酯。
例如，在一些实施方案中，另外的单体可选自甲基丙烯酸2-氨基乙酯、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸n-羟基琥珀酰亚胺酯、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯和甲基丙烯酸月桂酯。
应理解，所述另外的单体可根据预期的功能(例如，具有适于如本文所述的共价接枝反应的侧链)来选择。
在一些优选的方法中，所述另外的单体为氨基甲基丙烯酸酯或氨基丙烯酸酯，例如，甲基丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯或丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯，例如，甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯或丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯。合适地，所述另外的单体(其为甲基丙烯酸氨基烷基酯或丙烯酸氨基烷基酯)是ph敏感的。
在一些实施方案中，另外的单体可为甲基丙烯酸2-氨基乙酯。
在一些优选的方法中，所述另外的单体包含游离的羧酸基团。例如，所述另外的单体可为丙烯酸或甲基丙烯酸。
合适地，另外的单体的总含量为可聚合组合物的总单体含量的1-3％，例如，其可为1-2.5％，优选地1-2％，更优选地1.25-1.75％。
合适地，总连接体单体对总亲水单体的比率可为1∶1至10∶1，优选地1∶1至7∶1，更优选地1∶1至5∶1，更优选地2∶1至4∶1。合适地，总连接体单体对总的其他单体含量(亲水单体加另外的单体)为1∶1至10∶1，优选地1∶1至7∶1，更优选地1∶1至4∶1。
致孔溶剂可选择为与所需的整料性质相符。
在一些优选的方法中，致孔溶剂能够溶解固体单体，和/或致孔溶剂可与液体单体混溶。
合适地，致孔溶剂可选择为使得连接体聚合物团簇在聚合的早期从致孔溶剂沉淀。例如，致孔溶剂可选择为使得已聚合连接体单体的团簇将在开始聚合的30-60秒内从溶剂-单体体系中沉淀。
可使用单一溶剂体系或混合溶剂体系。
例如，致孔溶剂可为纯醇。
例如，致孔溶剂可选自含烷烃和醇的二元混合物；含芳族溶剂和醇的二元混合物；含醇和二醇的二元混合物；含醇和水的二元混合物；含醇、二醇和水的三元混合物；和含至少10％(体积/体积)的表面活性剂的混合物。
例如，溶剂体系可包含c8-12单醇，例如，c8-10单醇，优选地辛醇。当然，c8-12单醇可自身为不止一种c8-12单醇的混合物(例如，辛醇和十二烷醇的混合物)。c8-12单醇可与一种或多种另外的溶剂混合。合适地，所述另外的溶剂为c1-4单醇或c2-6二醇。本发明人已发现，包含c1-4单醇将导致所得整料孔隙尺寸的增大，而包含c2-6二醇将增大机械强度。合适的c1-4单醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和丁醇；优选甲醇和正丙醇。在一些实施方案中，引入甲醇。在一些实施方案中，引入正丙醇。合适的c2-6二醇包括但不限于丙二醇、戊二醇和己二醇；优选戊二醇。
合适地，c8-12单醇对c1-4单醇的比率为10∶1至1∶1；例如，其可为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1或1∶1。优选地，c8-12单醇对c1-4单醇的比率为3∶2至3∶1。
合适地，c8-12单醇对c2-6二醇的比率为10∶1至2∶1；例如，其可为9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、2∶3、2∶1。优选地，c8-12单醇对c2-6二醇的比率为3∶2至3∶1。
所述c8-10单醇溶剂体系可还包含至多10％的总溶剂含量，优选地至多5％的水，前提条件是溶剂体系基本上是单相的。
溶剂体系可为水性溶剂体系，例如，水、c1-4单醇和/或乙酸的混合物。某些优选的水性溶剂体系可包含水和甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇。水对另外的组分的优选比率为3∶1。
任何上述溶剂体系可还包含表面活性剂，例如，泊洛沙姆。表面活性剂的存在可有助于所述混合溶剂体系的初始混溶性。合适地，表面活性剂含量至多为总溶剂含量的10％，优选至多5％。
或者，在一些方法中，致孔溶剂可为100％的泊洛沙姆。
某些优选的溶剂体系包括：辛醇和丁二醇的混合物；辛醇和戊二醇的混合物；辛醇和正丙醇的混合物；辛醇和水的混合物；乙醇和水的混合物；及一种或多种泊洛沙姆和水的混合物。
例如，溶剂体系可为：正-辛醇；19∶1的辛醇∶水；4∶1至2∶3的辛醇：c4-6-正二醇；4∶1至1∶1的正辛醇∶正丙醇。
本发明还提供了自包含如本文所述具有至少一个-c(r)2o-基团的连接体的连接体单体制造整料的方法、包含如本文所述具有至少一个-c(r)2o-基团的连接体的整料和使用这样的整料的方法。应理解，本文描述的一些整料可自不一定需要亲水单体的可聚合组合物制造。本发明因此还提供了制造这样的整料的方法，所述方法包括提供连接体单体，所述连接体单体具有由包含至少一个-c(r)2o-基团的连接体间隔开的两个可聚合基团，任选地其中还提供一种或多种另外的单体；通过在致孔溶剂中合并连接体单体与任选的另外的单体来获得可聚合组合物；和聚合所述可聚合组合物以形成整料。
本发明还提供了制造整料的方法，其中所述方法包括在聚合步骤之后进一步衍生化。例如，所述方法可如本文所述在聚合步骤之后包括水解步骤。除此之外或作为另外一种选择，所述进一步衍生化可包括可接枝化合物的共价接枝和/或整料内化合物的浸渍。
本发明提供了如本文所述具有一个或多个区的整料。所述区可因聚合步骤或因聚合步骤之后的处理和/或衍生化而在聚合物基质的组成上不同。
在一些实施方案中，所述方法是一种制造方法，其中提供不止一种在致孔溶剂中含一种或多种单体和一种或多种连接体单体的组合物，其中所述组合物中的两者在以下中的至少一个方面不同：
-亲水单体和/或连接体单体种类；
-总的非连接体单体对连接体单体的比率；
-致孔溶剂；
-溶液中亲水单体、连接体单体和另外的单体(如果存在)的浓度；
-一种或多种另外的单体的存在和种类；和
-引发剂的存在和种类；
所述方法包括于聚合之前在模具内不同的位置处提供这些组合物的步骤，以便整料包含多个区，其中不同的区具有不同的芯吸性质和/或化学性质。
优选地，所述另外的单体为如本文所述的官能化单体。
合适地，所述区沿着整料的预期芯吸方向顺序排列。然而，应理解，所述区也可沿着芯吸方向平行地提供。例如，可并排提供两个区，以允许沿着整料与样品并排地运行对照样。
也可通过在聚合步骤之后整料的进一步衍生化来提供区，例如通过可接枝化合物的共价接枝和/或整料内化合物的浸渍。衍生化也可以是如本文所述聚合物基质内例如酯基团的水解的结果。
整料的区可为如本文所述的区。应理解，可根据所需的用途选择不同的此类区。某些优选组合的其他细节将在本说明书中于后文进一步详细描述。
在一些实施方案中，所述进一步衍生化包括可接枝化合物向整料的共价接枝。可接枝化合物可为酶。可接枝化合物可为抗体。可接枝化合物可为两亲物。可接枝化合物可为dna探针。
应理解，可在单个区内和同一整料的不同区处使用不止一种可接枝化合物。除此之外或作为另外一种选择，其中所述进一步衍生化可包括整料内一种或多种组分的浸渍。
所述区中的至少之一可为扩增区，其配置为促进流体样品中靶核酸序列的扩增。所述区中的至少之一可为扩增区，其配置为促进流体样品中的全基因组扩增。所述区中的至少之一可为清洁区，其配置为促进流体样品中细胞的裂解。所述区中的至少之一可为清洁区，其配置为促进流体样品中病毒的裂解。所述区中的至少之一可为逆转录区，其配置为促进rna向cdna的转录。所述区中的至少之一可为指示区，其配置为促进分析物分子的检测，任选地其中所述区包含染料荧光团、发色团和猝灭剂中的至少之一，任选地其中所述分析物分子为dna。所述区中的至少之一可配置为阻滞或保留样品的一种或多种组分以便分析物与样品中的其他组分分离开来。所述区中的至少之一可配置为促进样品的一种或多种组分的化学转化。应理解，可提供这些区中的一者或不止一者。
合适地，整料以测试棒的形式提供。在这些实施方案中，整料可具有单个预期芯吸方向。在一些优选的实施方案中，整料具有如下外部尺寸：长度介于1和10cm之间；宽度介于2和25mm之间；深度介于1和10mm之间。
或者，整料可成形为使得其提供一个或多个分支，所述分支分割和合并流过整料的流体。
整料可沿着预期的芯吸方向具有固定的宽度和/或深度，或者其可包含一个或多个颈区域(这些为横截面积减小的区域)。例如，在整料的至少一个部分中，小于5mm、优选小于4mm、更优选小于3mm、最优选小于2mm的深度可能是理想的以允许透照从而便于检测。相应地，聚合步骤可在成形为提供具有一个或多个颈区域的整料的模具中进行。
在一些实施方案中，总的连接体单体对总的非连接体单体的比率为1∶3至20∶1，更优选1∶1至5∶1，更优选2∶1至4∶1。优选的比率为3∶1。
在一些实施方案中，整料包含一个或多个孔隙率为50-85％的区域。
在第二个方面，本发明可提供一种根据第一个方面的任何方法制造的自芯吸整料。
在第三个方面，本发明可提供一种用于处理流体样品的自芯吸整料，所述整料包含由可聚合组合物形成的聚合物网络，所述可聚合组合物包含至少一种亲水单体和至少一种连接体单体，所述连接体单体具有由包含至少一个-c(r)2o-基团的连接体间隔开的两个可聚合基团。
整料可包含多个区，所述区沿着整料的预期芯吸方向顺序排列和/或沿着整料的预期芯吸方向平行地排列，其中不同的区具有不同的芯吸性质和/或化学性质。
在第四个方面，本发明可提供一种包含连续聚合物网络的整料，所述整料包含多个区，所述区沿着整料的预期芯吸方向顺序排列和/或沿着整料的预期芯吸方向平行地排列，其中不同的区具有不同的芯吸性质和/或化学性质。
整料的区可为如本文所述的区。应理解，可根据所需的用途选择不同的此类区。某些优选组合的其他细节将在本说明书中于后文进一步详细描述。
在一些实施方案中，整料以测试棒的形式提供。在这些实施方案中，整料可具有单个预期芯吸方向。在一些优选的实施方案中，整料具有如下外部尺寸：长度介于1和10cm之间；宽度介于2和25mm之间；深度介于1和10mm之间。
或者，整料可成形为使得其提供一个或多个分支，所述分支分割和合并流过整料的流体。
整料可沿着预期的芯吸方向具有固定的宽度和/或深度，或者其可包含一个或多个颈区域(这些为横截面积减小的区域)。例如，在整料的至少一个部分中，小于5mm、优选小于4mm、更优选小于3mm、最优选小于2mm的深度可能是理想的以允许透照从而便于检测。
在一些实施方案中，整料的体积密度介于0.15和0.50g/cc之间，例如0.20和0.40g/cc之间。整料可包含一个或多个孔隙率为50-85％、例如60-85％的区域。
当然，应理解，在如本文所述的多区化整料中以及在如本文所述的多区化整料制造方法中，不同的区可具有不同的体积密度和/或孔隙率。例如，多区整料可包含具有第一体积密度值的第一区和具有不同于第一体积密度的第二体积密度的第二区(在预期芯吸方向上、在第一区之前或之后)。
例如，多区整料可包含孔隙率介于50-85％之间的第一区和孔隙率介于50-85％之间的第二区(在预期芯吸方向上、在第一区之前或之后)，其中第一区的孔隙率不同于第二区的孔隙率。
在使用过程中控制整料或整料的一部分(例如，一个区)的温度可能是有用的。相应地，在一些实施方案中，整料可具有热耦合至整料的温度传感器和/或热耦合到整料的加热元件。还可提供耦合至温度传感器和/或加热元件的控制器，该控制器配置为调节整料的至少一部分的温度。
对于一些应用，出于操作目的，可能优选整料是柔性和/或易弯曲的(换句话说，不脆)。例如，具有12×1.5mm横截面的、30mm长跨距的整料可具有小于2psi、例如小于1psi的杨氏模量。在一些实施方案中，整料可具有小于0.5psi、例如小于0.3psi的杨氏模量。在一些实施方案中，整料可具有小于0.1psi、例如小于0.05psi的杨氏模量。
如本文所述的整料可与适于照射整料的一部分例如指示区的装置一起使用以便于分析物的检测。相应地，在第五个方面，本发明涉及一种装置，其包含如本文所述的整料和配置为用光照射整料的一部分的光源。
合适地，所述装置还包含光学传感器，其配置为接收从整料反射或透射通过整料的光。可提供控制器，所述控制器耦合到光源和光学传感器，并配置为控制光源和从光学传感器接收光学数据。
相应地，在第六个方面，本发明可提供一种装置，其包含如本文所述的整料，其还包含：
配置为用光照射整料的一部分的光源；
配置为接收从整料反射或透射通过整料的光的光学传感器；和
耦合到光源和光学传感器的控制器，其中所述控制器配置为控制光源和从光学传感器接收光学数据。
所述控制器也可配置为确定分析物是否存在。
所述装置可还包含耦合到配置为从光学传感器接收数据的控制器的接口、以及经由无线或有线连接耦合到所述接口的通信设备，所述通信设备配置为经由控制器的接口从光学传感器接收数据。通过这些数据的处理，可进行测定，从而确定是否已在流体样品中检测到靶分析物。靶分析物可例如为靶dna序列。
通信设备可被耦合至电信网络或耦合至与互联网耦合的网路服务。这在处理数据、存储结果和/或将结果中继到有关方时可能是有利的。
例如，通信设备可处理数据并作出决定，或者其可将数据中继到另外的设备或基于云的信息系统以进行处理。数据处理的结果(例如，是否存在分析物的测定)可被中继回用于使用点测定的装置。
在另一个方面，本发明提供了一种装置，其包含如本文所述的整料，并还包含：
光学传感器，其配置为接收从在整料中或在整料上的化合物发射的光，所述光发射指示分析物的存在；和
耦合到光学传感器的控制器，其中所述控制器配置为处理接收到的数据，并且确定在指示区中于流体样品中是否已检测到、或是尚未检测到分析物；和
耦合到控制器的视觉指示器或显示器，所述视觉指示器或显示器接收来自控制器的信号以提供分析物已经被检测到或尚未被检测到的视觉提示或消息。
所述装置可还包含配置为照射整料的至少一部分例如指示区的光源。
所述装置可还包含耦合到控制器的视觉指示器或显示器，其中所述控制器配置为确定流体样品中分析物存在或不存在，并且在视觉指示器或显示器处生成指示分析物存在或不存在的视觉提示或消息。
所述装置可还包含耦合到控制器并配置为接收来自控制器的数据的接口；和经由有线或无线连接耦合到所述接口的通信设备，所述通信设备包括视觉显示器，所述通信设备经由所述接口接收来自控制器的数据，所述通信设备处理所述数据以确定在指示区中于流体样品中是否已检测到、或是尚未检测到分析物，并且所述通信设备提供分析物已经被检测到或尚未被检测到的视觉提示或消息。所述通信设备可被耦合至电信网络或耦合至与互联网耦合的网路服务。
如本文所述，可能期望在使用过程中控制整料的温度。所述装置可因此包含一个或多个热耦合到所述多个区中的一个或多个的温度传感器；一个或多个热耦合到所述多个区中的一个或多个的加热元件；和耦合到所述一个或多个温度传感器和所述一个或多个加热元件的控制器，其中所述控制器配置为调节所述多个区中的一个或多个的温度。
本发明还提供了根据本发明的任何其他方面的整料在诊断方法和环境监测方法中的用途。
相应地，在第七个方面，本发明可提供如本文所述的整料在诊断方法中的用途，所述方法包括：
-提供包含一种或多种分析物分子的流体样品；
-任选地预处理所述流体样品；
-任选地在载体流体中稀释所述流体样品；
-向整料的样品施加部施加所述流体样品；
-任选地向整料施加另外的载体流体；
-在整料的指示部处检测分析物分子，所述指示部与所述样品施加部间隔开。
在第八个方面，本发明可提供如本文所述的整料在环境监测方法中的用途，所述方法包括：
-提供疑似包含一种或多种分析物分子的环境样品；
-任选地预处理所述环境样品(例如，通过浓缩样品)；
-任选地在载体流体中稀释所述环境样品；
-任选地用载体流体提取所述环境样品并弃去不溶物；
-向整料的样品施加部施加所述环境样品；
-任选地向整料施加另外的载体流体；
-在整料的指示部处检测分析物分子，所述指示部与所述样品施加部间隔开。
在第九个方面，本发明涉及一种装置，其包含第一和第二整料以及用于容纳彼此流体连通的所述第一和第二整料的外壳；其中通过将所述第一和第二整料的表面抵接(abut)形成接合部，以便施加到第一整料的样品芯吸到第二整料中。
所述第一和第二整料中的任一者或二者可为如本文所述的整料。任选地，整料中之一可为不同类型的芯吸材料，例如，如本领域中已知的硝化纤维素块。合适地，第一和第二整料二者均为本发明的整料。
相应地，在另一个方面，本发明可提供一种装置，其包含：
如本文所述的第一整料和如本文所述的第二整料；和
用于容纳彼此流体连通的所述第一和第二整料的外壳；其中通过将所述第一和第二整料的表面抵接形成接合部，以便施加到第一整料的样品芯吸到第二整料中。
应理解，上述方面的装置可任选地还包含关于本文中的其他装置所描述的特征。例如，所述装置可包含配置为用光照射整料中的至少之一的一部分的光源；配置为接收从所述整料反射或透射通过所述整料的光的光学传感器；和耦合到光源和光学传感器的控制器，其中所述控制器配置为控制光源和从光学传感器接收光学数据。应理解，也可提供如本文所述的视觉指示器。例如，所述装置可还包含如本文所述的温度传感器和加热元件，其可由控制器控制。
应理解，除非明确地不允许这样的组合，否则关于本文所述的任何整料描述的偏好和任选特征可同等地适用于任何其他整料。类似地，关于制造整料的方法描述的偏好和任选特征同等地适用于整料自身，反之亦然。
附图说明
通过本说明书，本发明的方面将结合下列附图进一步描述，但不限于此，在附图中：
图1示出了具有变化的横截面的整料的一个实施方案的图。
图2示出了比较用乙醇温育时接枝染料和未共价接枝染料从聚合物基质的保留性的线图。
图3示出了来自树枝状大分子-荧光素偶联和洗涤后整料片的x-y扫描的峰值荧光强度的条形图，比较了连接体类型和臂对探针的比率。
图4示出了hplc色谱图的比较，证实了偶联到本发明的整料的蛋白酶k的功效。底物为α乳白蛋白。
图5示出了
图6示出了示例性的4区整料。
图7示出了整料中和液体对照中lampdna扩增的线图比较。
图8示出了切口核酸内切酶反应的原理的图示。
图9示出了液体中、以及具有和不具有耦合到整料片的探针的压碎整料材料浆料中流感nesa反应的条形图比较。
图10示出了立置于样品架中的整料。
图11为证实整料中的nesa反应的照片。
图12示出了用于处理流体样品的两区整料的侧视图。
图13示出了用于处理流体样品的四区整料的顶视图。
图14示出了一种四区加固整料的顶视图。
图15示出了图14的整料的侧视图。
图16示出了具有两个平行清洁区的整料的顶视图。
图17示出了具有两个平行反应区的整料的顶视图。
图18示出了具有两个平行指示区的整料的顶视图。
图19示出了用于分子诊断的装置的框图。
图20示出了用于制造整料的装置的侧视图。
图21示出了使用图20的装置制造整料的方法。
图22示出了用于制造整料的替代装置的图。
图23示出了使用图22的装置制造整料的方法。
具体实施方式
定义
流体样品
如本文所述的流体样品可能包含感兴趣的分析物，可疑似包含感兴趣的分析物，或可能被推定不含感兴趣的分析物(应理解，在分析方法中，可使用例如分子诊断、检测等来确认预期的阴性结果)。
流体样品可为生物样品。生物样品可为自受试者获得的体液，例如，血液、唾液、尿液、初乳、母乳、痰液、脑脊髓液、羊水、血浆、精液、阴道分泌物或血清。样品可视情况合适地稀释。生物流体也可为自受试者获得的生物样品例如组织样品、拭子样品或粪便的提取物；或者其可为自昆虫、蛛形纲动物、寄生虫、甲壳类动物、线虫类等提取的样品。
生物流体也可以是人工培养的，例如，其可以是重组酶、病毒、发酵培养基、疫苗等。
生物样品可以是植物相关的。例如，其可以是植物渗出液或植物的提取物。
流体样品可从擦拭表面或以其他方式从表面提取材料获得，所述表面例如为医疗设备、个人防护设备、家具、柜台或地板。
流体样品可为环境样品，例如，其可为水样品或感兴趣的固体的提取物，例如，土壤提取物、灰烬提取物等。水样品应理解为包括水净化处理中各种阶段的水样品，例如，水样品可为原污水或经处理的污水。
流体样品可为对于分子诊断或分析而言感兴趣的样品。流体样品的处理可包括检测/分析步骤以确定感兴趣的分析物存在或不存在。相应地，如本文所述的整料可能适合于促进流体样品中感兴趣的分析物的检测。
自芯吸
如本文所用，该术语指整料孔隙对液体的毛细作用效果。这是整料的性质，其使得液体样品自发地从整料的第一部分流向与第一部分间隔开的另一部分而不需要施加外部压差(如例如常规柱色谱中所使用的)。在本文所述的诊断方法过程中，正是该自芯吸能力可单独地向流体分析物样品提供运动性。
自芯吸与整料在空间中的取向无关。其可竖直地发生，例如垂直于整料，或横向地发生，即沿着整料，具体取决于流体的施加方法。
自芯吸，如本文所述，指在以下芯吸试验中具有至少1.8cm的芯吸测量值的材料。
当然，应理解，如本文所述自芯吸整料的一些部分可具有较低的芯吸率，例如，在以下芯吸试验中1cm的测量值。这些部分可用作流量限制器，例如以将流体保持在自吸芯整料的前面部分中，如本文中别处所述。
如本文所述，如本文所述的整料合适地自芯吸。
有利地，这意味着将发生流体的流动通过整料而不需要外加压力。相应地，如本文所述的自芯吸整料可用在其中流体在整个整料上无外加压力梯度地流动的方法中。在这里公开的自芯吸整料中，溶剂与整料材料之间有利的界面能通过将流体拉入材料中而导致芯吸作用，直至所有的整料都已被润湿。这种相互作用的自由能将在低于环境压力的溶剂前缘处产生流体静压。换句话讲，芯吸通过整料的流体的背压低于任何高度处的环境压力，并因此低于平均海平面压力。当整料被充满流体时，芯吸将停止。
芯吸试验
该试验测量水将沿尺寸为1.27cm宽、6.35cm长、0.30cm厚的固化整料向上行进的距离。整料如本文所述制备。
测试前，将整料贮存在大气条件(温度：18-22℃，rh：10-40％)下，但本发明人已发现，对于未加载环境敏感试剂(例如，通过固定化/共价接枝)的整料，不需要环境控制。
1.将整料的3mm浸没在去离子水中，使整料呈直立取向；
2.水因芯吸作用而沿整料的长度上移；
3.在具有最高测量值的整料拐角处测量2.0分钟的时间内水行进的距离。
测量可简单地通过观察溶剂前缘以视觉方式进行。
可加入染料以帮助测量。合适地，所述染料为将与水一起行进而不会被整料显著阻滞的染料。合适的实例包括fd&c黄色1号和荧光素。对于如本文所述的一些整料，也可使用红色40和蓝色1，但应理解，任何染料均可能与某些如本文所述的整料的基质中的特定官能团(例如，游离氨基基团)相互作用，从而导致阻滞。
应理解，非常大的染料如蓝色葡聚糖可能因整料的孔隙尺寸而受阻滞。类似地，荷电染料可能以不同的速率沿整料移动。
合适地，如本文所用的自芯吸描述了在此试验中将取得至少1.8cm、优选地至少2.0cm、更优选至少2.3cm、更优选至少2.5cm、更优选至少2.7cm、更优选至少3.0cm、更优选至少3.2cm、更优选至少3.5cm的结果的整料。
应理解，对于本文所述的诊断方法，可能优选芯吸不要太快发生，例如，以视情况允许合适的清洁、扩增和/或检测。相应地，在一些实施方案中，如本文所述自芯吸整料将取得小于4.5cm、例如小于4.2cm、例如小于4.0cm、例如小于3.7cm的结果。
在一些实施方案中，如本文所述的自芯吸描述了将取得在2.5和4.5cm之间、例如3.0和4.0cm之间的结果的整料。
例如，该结果可在2.7和4.2cm之间，例如3.0和4.2cm之间，例如3.2和4.2cm之间，例如3.2和4.0cm之间，例如3.4和4.0cm之间。
例如，该结果可在2.5和4.0cm之间，例如2.5和3.7cm之间，例如2.7和3.7cm之间，例如3.0和3.7cm之间，例如3.2和3.7cm之间。
芯吸率也可以s/4cm为单位量度。下面提供了对应于根据如本文所述芯吸试验的测量值和以s/4cm为单位的芯吸值的比较表(表1)：
表1
整料
如本文所用，术语整料指主要由聚合物基质组成的块体。该聚合物基质也可被称为连续聚合物网络或网状聚合物。换句话讲，整料的聚合物基质是邻接的(contiguous)。
合适地，本文所述整料是伸长的，具有沿着最长长度(本文中称长度)的轴的预期流动方向(芯吸方向)。宽度和深度可相同，或者它们可不同。合适地，宽度和深度不同。长度和宽度限定至少一个诊断表面。该诊断表面合适地是平坦的。在一些实施方案中，整料包含至少两个相对的平行平面侧。
在一些实施方案中，整料可包含一个或多个宽度减小的区域；即，整料可具有一个或多个颈区域。该颈区域可分离不止一个诊断表面。颈区域可通过在适宜形状的模具中制造整料来形成。合适的整料形状将在本文中描述。
相应地，诊断表面可为矩形形状，或者可成型为具有一个或多个宽度减小的区域，例如，哑铃形状。
诊断表面为自其进行检测的表面。然而，检测不一定是对在诊断表面处或诊断表面附近的分析物的检测。如本文所述整料可以是至少部分地半透明的。这可允许整料主体内分析物的检测，例如，在距离诊断表面选自至多5.0mm、至多3.0mm、至多2.5mm、至多2.0mm、至多1.5mm、至多1.0mm、至多0.5mm的深度处。可通过经指示区向光电二极管阵列、ccd(电荷耦合器件)等上照射光来辅助该检测。
相应地，诊断表面可为整料的表面或任何形状的整料的一部分，其适于在有或没有背向照明(即，来自与诊断表面相背的表面的照明)的帮助下由传感器读取或视觉判读。
含分析物的样品可在沿着诊断表面的一个位置(在样品施加部)处施加，检测于一定时间间隔后在与样品施加部间隔开的一个位置(在指示部)处进行。或者，可将样品施加于整料的与诊断表面相对的面(在样品施加部)上，检测于一定时间间隔后在与诊断表面上的样品施加部间隔开的一个位置(在指示部)处进行。或者，可将整料的一端(为具有最小表面积的面的端)浸没在含分析物的样品中(整料的浸没表面为样品施加部)；在此情况下，指示部与浸没端间隔开。
样品施加部与指示部之间的距离可大于1cm，例如大于1.3cm、大于1.5cm、大于1.7cm、大于2cm、大于2.2cm、大于2.5cm、大于3.0cm、大于3.5cm、大于4.0cm、大于4.5cm、大于5.0cm、大于6.0cm、大于7.0cm、大于8.0cm。
本发明人已发现，在这些距离内，可实现样品处理和分析物扩增，例如，dna扩增、蛋白质消化、细胞或病毒裂解、或热处理。这些结果将在本文中描述。
指示部可以是与在流动方向上紧接于其前的整料部分相比具有受限的流动的指示区。例如，指示区可与清洁或扩增区邻近。提供与在流动方向上紧接于其前的区相比具有受限的流动的指示区具有两个有利的潜在应用：
1)其可促进从前一部分流入指示部中的分析物的浓缩。
2)其可阻滞分析物从前一部分的流出。因此，清洁或扩增区可被快速填充以样品，所述样品将较慢地离开该区(以进入具有受限的流动的指示区)，从而延长在前一部分中的“反应时间”。
合适地，整料的长度可为30mm至85mm总流体路径长度，例如30mm至50mm总流体路径长度。
合适地，整料的宽度可为约2mm至约25mm或甚至更宽。
合适地，整料的深度可为1mm至5mm，这为聚合步骤过程中uv固化以引发聚合的合适厚度。更大深度的整料可使用热固化程序制造。
如本文所述，羧基整料指具有游离羧基(-cooh基团)的整料。这些基团可通过选择适宜的单体在聚合过程中引入到整料中，或者它们可以是水解引入到聚合物基质中的酯基团的整料聚合后处理的产物。在一些实施方案中，羧基整料为合适的聚合后水解步骤的产物，例如，使用碱如氢氧化物碱如氢氧化钠。
预期芯吸方向
如本文所用，术语预期芯吸方向指流体在样品内的主要流动方向。合适地，该方向为从样品施加部到样品检测部和越过样品检测部，样品检测部在本文中也称指示部。芯吸方向可通过观看或以其他方式观察使用中流体通过整料的运动来确定。
分析物
如本文所用，术语分析物指在诊断和/或分析方法中检测的感兴趣的物种。为简单起见，在整个本说明书中，适当时，提及的分析物可包括一种或多种预分析物。预分析物指其自身将经历改变以释放或转化为被检测的分析物的样品组分。例如，细胞可经历裂解以释放分析物蛋白质、脂质和核酸，包括dna和rna。例如，感兴趣的物种可用荧光团修饰。
亲水单体
术语亲水单体指具有极性侧链的单体，其能够在水性环境中离子化或氢键结合。一般来讲，具有高的亲水单体含量的聚合物是可润湿的或将吸收水。亲水侧链的实例包括但不限于羟基、氨基、醋酸酯、胍酸酯、酰胺、硫酸酯、硝酸酯或腈。
合适但不一定的是，亲水单体包含游离的羟基基团。例如，亲水单体可为丙烯酸羟基酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯(hema)、丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟丙酯或丙烯酸2-羟丙酯；或丙烯酸。在一些优选的实施方案中，其为甲基丙烯酸2-羟乙酯(hema)。
当然应理解，连接体单体可自身包含游离的羟基基团；即，连接体单体可为亲水单体。例如，其可为甲基丙烯酸3-(丙烯酰氧基)-2-羟丙酯或甘油1，3-二甘油醇酸二丙烯酸酯。这些包含游离羟基基团的连接体单体可在如本文所述的整料和方法中充当连接体单体和/或充当亲水单体。
连接体单体
如本文所述，连接体单体指具有由包含至少一个-c(r)2o-基团的连接体间隔开的至少两个可聚合基团的可聚合化合物。
所述两个可聚合基团合适地包含乙烯基部分，并可例如为丙烯酰基或甲基丙烯酰基基团。当连接体通过-o-接合到所述两个基团时，连接体单体可因此为丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯，例如，二丙烯酸酯或二(甲基丙烯酸酯)。
每一个r可为氢或可为任何有机基团。换句话说，连接体可为烷基或被取代的烷基链-(c(r)2)n-，其中至少一个、优选地至少两个-c(r)2-基团被氧所代替。r基团可自身包含另外的可聚合基团，并可相同或不同。在一些实施方案中，每一个r基团均为h。
合适地，连接体为乙二醇，例如，乙二醇、二乙二醇或聚乙二醇。或者，连接体可为甘油，例如，甘油1-3-二甘油醇酸酯或甲基丙烯酸3-丙烯酰氧基-2-羟基丙酯。
合适的连接体单体可包括但不限于：
表2
应理解，除非上下文另有规定，否则提及的连接体单体包括两种或更多种不同的此类单体的混合物。即，连接体单体的提及可指单一的如本文所述的连接体单体或指两种或更多种此类连接体单体的组合。
致孔溶剂
如本文所用，提及的致孔溶剂包括致孔溶剂体系，即两种或更多种溶剂的混合物。这些混合物可以是均质的(即，溶剂可混溶)或者它们可以是非均质的(即，溶剂中的至少两者可能不可混溶，混合物可以不止一个相存在)。当然，致孔溶剂可为单一溶剂。致孔溶剂体系可提供为含一种或多种单体，例如，其可提供为单一溶剂外加一种或多种单体，所述单一溶剂和一种或多种单体在组合中稳定(即，不与彼此反应)。
致孔溶剂将在聚合工艺过程中促进孔隙的形成。简言之，可聚合组合物提供为使得至少一些、优选全部单体在溶液中。随着聚合的进行，形成的聚合物链开始从溶液中沉淀，因为虽然成孔剂-单体混合物是单体的良好溶剂，但是是聚合物的不良溶剂。这些沉淀的聚合物核然后变为剩余的单体聚集的场所，其将迅速并入到生长的聚合物网络中。随着核的生长，它们碰撞并团聚，形成具有间隙(intersticial)孔隙的交联小球基质。此组装机制产生高度互连、开放通道的系统，其中连续网络聚合物球体形成通道壁。
合适地，使用溶剂的混合物。合适的溶剂包括醇(例如，辛醇)、醇的混合物(例如，十二烷醇或辛醇与丁二醇)及醇和水的混合物(例如，甲醇或乙醇与水或者十二烷醇或辛醇与水)。合适的致孔溶剂体系包括：正辛醇；正辛醇与1，4-丁二醇的混合物；正辛醇与1，5-戊二醇的混合物；正辛醇与正丙醇的混合物；正辛醇与水的混合物；甲醇与水的混合物；和一种或多种泊洛沙姆与水的混合物。
合适地，可使用表面活性剂作为溶剂或可在溶剂体系中包含表面活性剂。例如，本发明人已发现，包含表面活性剂将给可聚合组合物增加一些乳液特性。这又将导致更大规模的孔隙体系。
合适的表面活性剂的实例包括但不限于聚山梨酸酯、泊洛沙姆和triton-xtm表面活性剂，包括聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯20、泊洛沙姆331、泊洛沙姆181、泊洛沙姆168、tritonx15和tritonx-100。
如本文中其他地方所述，本发明人已发现，在本文中描述的一些方法中，可使用表面活性剂作为溶剂。本文所述的泊洛沙姆可尤其适合作为溶剂使用。
引发剂
合适地，采用自由基聚合来聚合可聚合组合物。相应地，可在可聚合组合物中引入自由基引发剂。合适的引发剂可在热或光化学诱导时引发聚合链反应。合适的引发剂是本领域已知的并包括2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(dmpa或dmpap)、2，2′-偶氮双异丁腈(aibn)、过氧化苯甲酰(bpo)、过氧化月桂酰(lpo)、过硫酸铵和l-抗坏血酸。优选地，可聚合组合物中的引发剂为2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮。
引发剂合适以相对小的量存在。例如，可聚合组合物中引发剂的量可低于总单体(连接体单体和非连接体单体，包括另外的单体)的3％，优选地低于2.5％，更优选低于2％，更优选低于或等于1.5％。合适地，引发剂浓度足以使得可聚合组合物在照射的5分钟内变混浊并在本文所述的辐照条件下于30分钟内基本上完全聚合。
样品施加部
此为含分析物的样品被施加到的整料表面部分。其可为整料的在整料的至少一个其他部分/区的上游的任何部分。其可为模制或机加工到整料中的孔或梳形结构。其可为局限于整料的诊断表面(即，在其上进行检测的面)的区域、或可为整料的一端的浸没面、和(如果整料“对端(endon)”放置于溶液中来以其竖直配置使用的话)四个邻近表面的浸没部分。在一些实施方案中，样品施加部为清洁区或清洁区的一部分，所述区如本文所描述。
可能优选使用载体流体(例如，缓冲液)来帮助样品通过整料。这样的载体流体可在与样品相同的点处加到整料，或者可在上游加入。相应地，在一些实施方案中，样品施加区可在载体流体引入部/区的下游。
指示部
其为在其处进行分析物检测的整料部分。所述样品指示部可为指示区或指示区的一部分，所述区如本文所描述。指示部/区可具有比硝化纤维素低的折射率，例如1.4，并且其可足够薄以在透照时允许超过1％、优选地超过5％、优选地超过10％的入射光通过。
整料制造程序
一般程序
提供以下非限制性一般程序。
在合适的容器中合并单体和一种或多种溶剂以及引发剂。剧烈混合以合并所述成分，直至外观均匀(澄清或在不可混溶组分的情况下呈乳白色)。该溶液为“可聚合组合物”。向所需的模具中分配一定量的可聚合组合物，然后逐出任何气泡，例如通过轻轻搅动或声处理。
通过用uv光(约1mw/cm2)辐照20分钟进行固化。任选地，用至少3份醇洗涤固化的整料中的残余溶剂，然后用压差使至少3份水或其他水性溶液强制通过整料。于40-100℃(例如，40-60℃)下真空干燥整料直至重量不再随时间改变。在环境条件下贮存。
用于多区整料的程序
多区整料(其中存在具有不同化学或物理性质的区域的单个整料)可包含因在初始整料形成(聚合步骤)过程中引入的差异而不同、或因聚合步骤完成后例如通过共价接枝另外的化学部分或通过用试剂处理整料的一部分以实现该部分中整料化学性质的改变的后处理而不同的区。
这样的区可在聚合步骤过程中使用以下方法中之一引入：
方法1：如上面及本文中其他地方的一般程序中所述制备一定类型的整料。在洗涤之前停止，或用溶剂填充经干燥的整料，并将经填充的整料放置在模具中适当位置。按照上面的一般程序制备混合整料，其中将更多的聚合组合物倒入模具中使得它们与已经固化的整料块直接接触。这些组合物可相同或不同(因为即便使用相同的组成，聚合条件也可影响聚合产物)。如一般程序中所述进行固化和后续步骤。换句话讲，整料可分“段”产生，并在每一聚合步骤中通过固体聚合物结构的机械交错搭叠和通过新段的新生聚合物与下面一段中未反应的可聚合基团之间的聚合进行段之间的互连。这样，可制造出线形整料和支化整料。也可包括“垂直”层。
方法2：提供不止一种可聚合组合物，这些可聚合组合物在以下中的至少一个方面不同：亲水单体和/或连接体单体种类；总的非连接体单体对连接体单体的比率；致孔溶剂(溶剂种类、混合溶剂体系的溶剂比率)；溶液中亲水单体、连接体单体和另外的单体(如果存在)的浓度；一种或多种另外的单体的存在和种类；引发剂的存在和种类。向模具中不同位置处分配这些可聚合组合物，以便单体溶液流动为彼此抵接。当发生聚合时，这些不同的位置具有不同的性质。
可能有利的是在模具内提供隔离器以限定不同的位置和防止模具填充过程中、以及可能地初始聚合过程中不同的可聚合组合物的混合。如果提供了这样的隔离器，则这些隔离器可在聚合之前即刻或聚合的中途移除。例如，隔离器可在固化开始后5-30秒、固化开始后30-300秒、固化开始后5-10分钟、固化开始后10-15分钟或固化开始后15-20分钟移除。这允许在区内发生初始聚合而不会有不同的可聚合组合物的混合。一旦隔离器被移除，固化将继续，新生区互连到单个聚合物网络而形成多区化整料。
方法3：向模具中分配可聚合组合物，然后选择性地辐照模具内的一个或多个位置以便聚合仅在所述一个或多个位置处引发。剩余的组合物可在稍后辐照。
整料模具和形状
整料聚合在模具中进行。聚合后，整料可任选地被干燥，任选地从模具取出并任选地如上所述洗涤。干燥、取出和洗涤步骤可在聚合后以任何顺序进行。
例如，整料可被干燥、取出、洗涤并然后干燥。
例如，整料可被取出、洗涤并然后干燥。
例如，整料可被洗涤、取出并然后干燥。
例如，整料可被取出、干燥、洗涤并然后干燥。
例如，整料可被洗涤、干燥并然后取出。
其他排列组合对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
合适地，模具具有提供所需形状和尺寸的整料的内部维度。例如，模具可限定如这里所述的矩形区域。合适地，整料可具有圆形的端，即，模具可限定具有由直边接合的两个半圆形端的区域。
对于一些应用，可能优选提供一个或多个颈区域(这些为在预期的流动方向上横截面减小的区域)。相应地，可成型合适的模具以限定可变宽度的区域。
模具可由任何合适的材料例如金属、塑料或弹性体制成。模具可内衬薄膜塑料如sarantm、ldpe或内衬硅氧烷膜。
出于经济或易于制造的原因，在一些情况下，聚合可在大模具(即，限定比所需的整料诊断表面大得多的表面积的模具)中进行，然后将片材切割成一个一个单独的整料以供使用。片材可在任何时候切割，但为了方便起见，优选在干燥之前切割。
在本文所述的一些实施方案中，整料呈长圆形形状。即，整料可沿整个芯吸长度具有单一横截面。合适地，长圆形整料的长度介于1cm和10cm之间，优选介于6和8cm之间，更优选介于4和8cm之间。合适地，长圆形整料的宽度介于2mm和25mm之间，优选地介于6mm和20mm之间，更优选介于8和16mm之间，更优选介于10mm和14mm之间；例如，宽度可为约12mm。合适地，长圆形整料的深度介于1mm和10mm之间，优选介于1mm和7mm之间，更优选介于1mm和5mm之间，更优选为约2-3mm。
或者，整料横截面可沿芯吸方向改变。在这些实施方案中，整料的不同区可具有不同的横截面。小的横截面面积可便于检测，例如，为了检测过程中分析物的可视化，可能优选较小的深度，尤其是在采用透照时。较小的横截面面积也可减慢流体从前一区流动的速率。这可起到保持流体于所述前一区中的作用，其可用于延长反应(例如，清洁区中的细胞裂解、反应区中rna向dna的转化、反应区中分析物的扩增)的停留时间。
例如，整料可为“哑铃形状”；即，整料可包含颈区域，所述颈区域具有减小的横截面，其位于具有较大横截面的两个部分之间，图1中示出了它的一个非限制性实例。参照该附图，合适地，将样品施加到整料顶(诊断)表面上的左下方处。流体样品通过沿着芯吸方向芯吸而沿着整料行进。芯吸方向为沿着整料从图像的左下方到右上方对角线。在固定横截面的第一长度中，样品可进入如所述的清洁区和/或反应区，例如，如所述的逆转录或扩增区。样品然后在横截面减小(颈区域)的长度处流入另一区位置中。该颈区域的减小的横截面可减慢流体沿芯吸方向的流动速率，从而增大流体在紧接于其前的区中的停留持续时间。合适地，颈区域为如所述的指示区。在颈区域之后，整料的横截面增大。合适地，整料在颈区域之后包含槽区。
收缩
在聚合洗涤过程中和/或干燥过程中可能发生一些收缩。合适地，固化过程中总收缩率小于顶面总表面积的约10％，更优选小于约5％。
然而，在一些情况下，可能需要部分地包封先前形成的整料结构的整料区一定的收缩。该适度的收缩起到以机械方式将预先形成的整料结构捕集到新形成的整料内的作用。这样的捕集将在两个区之间产生密切的大面积流体连接，其将促进从一个区向另一个中的芯吸。这样的捕集还可起到以机械方式稳定两个区之间的接头的作用。这种适度收缩可为至多约10％，更优选至多约5％，更优选至多约3％。表3和4提供了若干示例性整料的数据。
tbama-甲基丙烯酸四丁基氨基乙酯
maa-甲基丙烯酸
nhs-甲基丙烯酸n-羟基琥珀酰亚胺酯
lyma-甲基丙烯酸月桂酯
glyma-甲基丙烯酸缩水甘油酯
so4aa-2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸
化学部分的共价接枝
如本文所述，通过基质内的反应性基团与附加到化学部分的合适的反应性基团之间的共价反应向整料的聚合物基质接枝化学部分可能是有利的。
例如，许多反应性基团将直接与羧酸基团反应，并可用来向聚合物基质上接枝化学部分。羧酸基团可通过选择适宜的单体引入到聚合物网络中，或者可通过用碱如氢氧化钠或氢氧化钾处理使得酯基团(例如，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯基团)水解而产生。
如本文所述，羧基整料指具有游离羧基(-cooh)基团的整料。
实例水解程序
将7.5mg中性聚合物基质制剂(2∶1egdma∶hema)的圆盘在95℃下于1m或6mnaoh中浸泡1小时。然后通过浸泡在10ml水浴中至少一小时来洗涤圆盘。此在水中的浸泡再重复四次。然后通过浸泡在10ml异丙醇中至少一小时来洗涤圆盘。此在异丙醇中的浸泡再重复两次。最后，将圆盘于40℃下真空干燥过夜。
合适地，引入或水解产生的羧酸基团经预活化以辅助共价接枝，例如，使用已知的偶联试剂。合适的偶联试剂包括但不限于1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edac或edc)、二环己基碳二亚胺(dcc)、二异丙基碳二亚胺(dic)、1-羟基-苯并三唑(hobt)和1-羟基-7-氮杂-苯并三唑(hoat)。
氨基整料生成
许多反应性基团将直接与氨基基团反应，并可用来向聚合物基质上接枝化学部分。相应地，除此之外或作为另外一种选择，游离氨基基团可通过选择适宜的单体引入到聚合物网络中，或者可以受保护的形式引入，保护基团随后被移除以脱去游离氨基基团的保护。合适的氮保护基团是本领域已知的，例如叔丁氧基羰基(t-boc)。
接枝
可共价接枝任何合适的化学部分。合适的实例可包括染料、蛋白质、酶或dna/rna衍生物、蛋白质底物、抑制剂和抗体，如本文所述。合适的化学部分可包括ph敏感基团，包括衍生自强酸或碱的那些；脂质样分子和树枝状大分子，如本文所述。
相应地，在一些方面中，本发明涉及包含共价接枝化合物的整料，所述共价接枝被接枝到聚合物基质的至少一部分上，其中所述共价接枝化合物可选自染料、蛋白质、蛋白质底物、抑制剂、抗体、ph敏感化合物、脂质样分子或树枝状大分子。在一些实施方案中，整料包含选自酶或dna/rna衍生物的共价接枝化合物。在一些实施方案中，整料包含共价接枝寡核苷酸探针，例如，荧光猝灭dna探针。在一些实施方案中，整料包含共价接枝的酶，例如，溶菌酶、防御素、成孔毒素、切口酶、限制酶、核酸酶、转录酶、抗体或蛋白酶。在一些实施方案中，整料包含浸渍的酶，例如，溶菌酶、防御素、成孔毒素、切口酶、限制酶、核酸酶、转录酶、抗体或蛋白酶。在一些实施方案中，整料包含浸渍的寡核苷酸探针，例如，荧光猝灭dna探针。在一些实施方案中，整料包含共价接枝的酶，例如，溶菌酶、切口酶、转录酶或蛋白酶。在一些实施方案中，整料包含浸渍的酶，例如，溶菌酶、切口酶、转录酶或蛋白酶。
fitc染料向氨基整料珠粒的共价接枝
为证实合适的染料向具有游离氨基基团的整料的共价接枝，将荧光素异硫氰酸酯(fitc)共价接枝到聚合物基质材料的珠粒上。
使用丸粒杵和研钵在100μl50mm硼酸钠(ph8.5)中研磨氨基整料材料(1∶3∶1tegdma∶egdma∶hema加5.0％的甲基丙烯酸2-氨基乙酯(ama))。使用硼酸钠缓冲液将磨碎的材料稀释至1ml并于100xg下离心1分钟。将无大块整料、含破碎珠粒的上清液等分(850μl)加入到新的微管中，加入fitc至在900μl的体积中20ng/ml的最终浓度，并在黑暗中温育一小时。通过混合、离心和再悬浮于pbs中来洗涤珠粒两次并最后再悬浮于pbs中。使最后的悬浮液通过becktondickinson40μm细胞过滤器进入5ml圆底管中。
出于比较的目的，使用由羧基整料材料(1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.0％的甲基丙烯酸(maa))形成的珠粒重复相同的过程。
在becktondickinsonfacscalibur流式细胞仪中进行测量。使用中性制剂优化通道设置以建立在仪器动态范围内的前向和侧向散射值。调节荧光增益以允许检测强荧光强度的足够动态范围。如表5中所示，dx3-羧基阴性对照珠粒的fitc处理导致了主要低的荧光群体(门m1)，而氨基珠粒(1∶3∶1tegdma∶egdma∶hema加5％的ama)的fitc处理导致几乎全部珠粒存在于高荧光门(门m2)上。
表5使用用户定义的荧光门控方法将整料珠粒分离成荧光群体。在此实例中，dx3-羧基阴性对照珠粒的fitc处理导致了主要低的荧光群体(门m1)，而(1∶3∶1tegdma∶egdma∶hema加5％的ama)氨基珠粒的fitc处理导致几乎全部珠粒存在于高荧光门(门m2)上。
荧光素尸胺向羧基整料固体的共价接枝
将新鲜的edac固体以16mg/ml溶解于水中。将135μledac溶液与135μl200mmmes(ph7.0)混合并分配到12孔板的孔中。将羧基聚合物基质(1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.0％的maa和2∶1egdma∶hema)的馅饼形状圆盘片浸没在edac/mes溶液中。向每个孔中加入30μl0.33mg/ml的荧光素-尸胺(在dmso中)分子探针染料。使馅饼形状圆盘片于室温下振荡温育0.5小时。移除edac/mes/荧光素染料溶液并将薄片转移到96孔板的孔中。
用乙醇洗去未结合的染料，同时监测荧光。随着时间的推移，收集整料片的一系列荧光x-y扫描。孔扫描读数在bmgfluostaroptima板读数器上进行。使用的过滤器为480(激发)和530(发射)。绘制每个孔的最亮像素强度随时间的变化。如图2中所示，共价接枝的染料保留下来(-■-)，而未共价接枝的染料随着乙醇温育从聚合物基质洗脱出来(-●-)。从荧光素-尸胺向由中性整料材料(2∶1egdma∶hema)的1m氢氧化钠处理形成的羧基-整料材料的edac-介导偶联的试验获得了类似的结果。
氨基改性寡核苷酸探针向聚合物基质的共价接枝
每一次使用前制备新鲜的edac偶联溶液。羧基整料制剂(例如，1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.0％的maa)芯吸大约2.5μl流体每mg整料基质。测试的通用模式是采用6mg塞子，其将芯吸15μl溶液。使用以下配方制备足够的偶联混合物以允许整料的完全饱和：
将160mg/ml的edac溶解在无水dmso中(10x储备溶液)。混合1/2体积的200mmmes缓冲液(ph7.0)、1/10体积新鲜的160mg/mledac(溶解在干燥的dmso中)、1/10体积的荧光猝灭dna探针(100μm储备溶液)。用去离子蒸馏水使溶液取得最终体积。加入足够的偶联混合物以使羧基整料固体或珠粒饱和。反应物于室温下温育2小时至过夜(对于荧光寡核苷酸，在黑暗中温育)。每70μledac溶液加入5μl30mg/ml的甘氨酸(ph7.0)溶液。反应物于室温下温育至少15分钟并然后在200μl水中冲洗3次。对于破碎的整料珠粒，使用轻离心来沉淀珠粒。弃去上清液。样品于65℃下真空干燥1小时。
也用1/10体积的荧光素-尸胺(使用10mg/ml)进行上述反应，作为共价偶联反应效率的对照。
使用连接体分子改变接枝密度
接枝可以是如上所述直接的，或者可经由连接体分子。可使用支化的连接体分子(也称多臂)来增大整料表面上接枝的化学部分的密度。
两种这样的连接体分子为：
nhs-peg-nhs(d型：gas-戊二酰胺琥珀酰亚胺酯)(2-臂)和
4-臂peg-nhs(c型nhs：ss-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)
如下文所述实验中也已使用8臂型式。
在本文中，本发明人通过示意而非限制的方式经由聚合物基质中的氨基基团，展示了树枝状大分子-臂对荧光素尸胺-染料比率的6种组合的偶联水平和稳定性。
连接体和荧光素尸胺最初于室温下温育5分钟。然后将该混合物与edac混合，转移到氨基聚合物基质的干片(1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.5％的ama；1/8馅饼形状圆盘片)并再温育30分钟，然后移除该反应混合物并加入300μl水。
比率为臂对染料探针，因此较低的比率具有较多的染料探针，并且每个8-臂反应具有4倍于相应的2-臂反应的探针。
图3示出了来自树枝状大分子-荧光素偶联和洗涤之后整料片的x-y扫描的峰值荧光强度。对于给定的连接体，较低的臂：探针比率(较高的探针：臂比率)有最大的信号。8-臂2∶1混合物相对于2-臂2∶1混合物获得了更高的洗涤后残余荧光，表明了最大程度的探针偶联。两臂10∶1和2∶1染料：连接体比率的峰值荧光强度的等效性表明了整料表面上可用结合位点的饱和。8-臂2∶1条件的较高值显示染料结合超出固有整料容量；过量的染料偶联到8-臂连接体上的附加结合位点。
酶的共价接枝
本发明人还已证实，功能酶可被共价接枝到如本文所述的整料的聚合物基质。实例描述了使用蛋白酶k和溶菌酶，但应认识，所述程序可适用于其他合适的分子，包括但不限于适体、核酶、其他酶、抗体、凝集素和其他蛋白质。
酶是具有许多氨基基团的复杂分子，这些氨基基团可参与本文描述的共价接枝反应。因此可预期共价接枝将降低或完全抑制酶活性。然而，本发明人已证实，对于所述的酶，即便在共价接枝之后也保持了足够的酶活性。
酶向羧基整料材料(1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.0％的maa)的固定化可使用碳二亚胺偶联反应。例如，酶溶液可在edac在50％干燥的dmso和50％200mmmes(ph7.0)中的新鲜溶液的存在下与羧基基质一起温育。在酶蛋白质中的可用氨基基团与聚合物基质中的羧基基团之间发生共价偶联。
蛋白酶k是对许多肽键、特别是与脂族和芳族氨基酸的羧基基团邻近的肽键具有广谱特异性的蛋白酶。它是从复杂细胞混合物或组织中纯化核酸时使用的非常常见的酶。
溶菌酶是一种糖苷酶，其将特异性地分解革兰氏阴性细菌如大肠杆菌的细胞壁中的碳水化合物键。它是从革兰氏阴性细菌和在较小程度上从革兰氏阳性细菌中纯化核酸时使用的非常常见的酶。
使用共价接枝蛋白酶k的整料介导蛋白水解
本发明人已证实，通过共价接枝到本文所述整料的聚合物网络上而固定化的蛋白酶k能够消化乳白蛋白，从而表现为尽管共价接枝但酶的活性仍保留。确实，观察到的活性高，如下文所述。
将160mg/ml的edac储备溶液溶解在干燥的dmso中。向在pbs中的15μl200mmmes(ph7.0)和20μl10mg/ml蛋白酶k中加入35μl该储备溶液。将该溶液加到20mg圆盘羧基整料聚合物基质(1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.0％的maa)。圆盘于室温下温育1小时。然后将反应用5μl30mg/ml甘氨酸(ph7.0)于室温下淬灭15分钟。然后将圆盘在1xpbs中洗涤3次并在1xpbs中于4℃下保持4天。
将α-乳白蛋白底物以10mg/ml溶解于1xpbs中。将蛋白酶k偶联圆盘切割成相等的8个馅饼形状的片。对于每一测定，将一个馅饼片点侧朝下地放置于0.5ml微量离心管中。对于每一个管，加入27μl10mg/ml乳白蛋白溶液或1xpbs、3μl5mmcaso4。封闭该管并于65℃下温育2小时。加入另外的50μl去离子蒸馏水，封闭该管，并于65℃下再温育30分钟。
通过hplc分析未经处理和经蛋白酶k芯片处理的α-乳白蛋白(图4)。该图重叠示出了相继的hplc运行：蛋白酶k芯片，加α-乳白蛋白(消化了的片段)，无蛋白酶k的芯片，加α-乳白蛋白(完好无损的α-乳白蛋白)。
经蛋白酶k处理的α-乳白蛋白在受试的短温育期后从其原始形式完全降解，表明即使该酶被固定化于聚合物基质上，其活性也得到保持。
使用共价接枝溶菌酶的整料介导细菌细胞壁降解
本发明人还已证实，共价接枝的溶菌酶将保持糖苷水解酶活性。这表明溶菌酶可被固定化于如本文所述的整料上并用来促进如所述的细菌dna的纯化和检测。
在向一小段羧基整料聚合物基质共价接枝溶菌酶后，与溶菌酶标准稀释系列一道，将样品放置到荧光标记细胞壁材料的溶液(
制备160mg/mledac储备溶液在干燥的dmso中的新鲜溶液。自20μl10mg/ml的溶菌酶/1xpbs溶液、28μl200mmmes溶液(ph7.0)和15μl水制备溶菌酶混合物。
将7μl160mg/mledac点样于由整料材料(1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.0％的maa)形成的单个20mg圆盘上。然后加入制得的溶菌酶混合物(63μl)并将样品于室温下温育1小时。然后加入甘氨酸溶液(10μl；30mg/ml溶液，在100mmph7.0的mes溶液中)并将样品于室温下温育15分钟。然后在水中冲洗圆盘并贮存于4℃下直至使用。
为测试固定化的酶的活性，将溶菌酶偶联圆盘和未经处理的对照圆盘各切割成相等的1/8大小的馅饼形状片段。然后向微孔板的两个孔中加入各自的两片并加入溶菌酶底物。还试验溶菌酶标准试剂的稀释系列。每隔一定时间读取荧光以确定碳水化合物分解的程度和随之而来的溶菌酶活性。
功能和官能化
如本文所述的整料可被官能化并可用于各种功能。
例如，如本文所述的整料可：
●在表面上或整个结构上官能化；
●通过在整料的制造过程中添加至少一种官能化单体来官能化，所述官能化单体例如选自具有以下侧链中之一的单体：氨基、羧基、peg、烷基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、酰基卤、巯基或叠氮化物；
●通过化学水解来官能化；
●通过化合物向整料的聚合物基质的共价接枝来官能化；和/或
●通过一种或多种化合物在整料的聚合物基质内的浸渍来官能化。
例如，如本文所述的整料可能可用于以下中的任何或全部，而不限于任何顺序或组合：
●通过物理设计来引导流体的流动(可使用方向来混合试剂与流体)；
●控制流体流动的净速率(通量)；
●颗粒物、全细胞、细胞空壳、细胞器、细胞碎片、病毒衣壳、蛋白质、脂质、核糖体或分子聚集体的机械捕集；
●例如经由细胞、孢子、病毒、细菌、酵母或真菌、分子聚集体等的破坏从混合物中释放分子；
●离子或分子的亲和结合，例如，通过静电、范德华力或氢键相互作用或它们的任何组合；
●经由酸、碱、盐、糖、渗透剂或赋形剂的释放和/或吸附改变流体的ph和同渗容摩；
●贮存、保存或控制试剂向混合物中的释放；
○释放任何类别的分子，包括但不限于酶或其他蛋白质、溶菌酶、防御素、核酸酶、脂蛋白、去垢剂、表面活性剂、变性剂、蛋白酶、激酶、连接酶、聚合酶、逆转录酶或核糖核酸酶抑制剂或它们的任何组合；
●保持和定域化适合定域化于特定区而非其他区中的活性分子如酶、去垢剂或探针；和
●透射光或反射光以用作化学指示器。
相应地，如本文所述的制造方法可还包括官能化整料的步骤使得其配置为实现任何上述功能。
分区化整料
对于一些应用，为了便于样品处理和分析物检测，可优选提供具有有着不同性质的区的整料，这些区沿着预期的流体流动方向(芯吸方向)依次取向和/或沿着芯吸方向平行地定位。当然，应理解，本发明不限于多区整料。
区可在物理性质和/或化学性质方面不同。差异可以是整料的聚合物基质的整体特征(例如，在聚合步骤过程中引入或通过改变区内的聚合物网络结构引入、通过后处理和/或向基质共价接枝另外的化学部分引入)或者可以是用试剂等在该部分处浸渍整料的结果。
在使用中，流体样品被施加到整料的样品施加区，并在与样品施加区间隔开的位置处检测。分析物的检测点在整料的指示部中。
应理解，虽然多区整料含具有不同性质的区，但多区整料的全部区不一定与每个其他的区不同，尽管它们可以不同。
应理解，使用的区的组合和这些区的性质可随预期的流体处理方法而异。以下特定组合提供以示意而非意在限制本发明。其他组合和修改将是显而易见的并在本发明的范围内。
清洁区
该区可配置为将感兴趣的分析物与样品的至少一种其他组分分离开来和/或在检测之前(和可能地在扩增之前)处理分析物。还可向样品中添加试剂如缓冲液、去垢剂、蛋白酶抑制剂或稳定剂。该处理可有助于分析物的释放，例如通过细胞或病毒裂解和/或样品ph的酸化。
为简单起见，在整个本说明书中，适当时，提及的分析物可包括一种或多种预分析物。预分析物指其自身将经历改变以释放或转化为被检测的分析物的样品组分。例如，细胞可经历裂解以释放分析物蛋白质、脂质和核酸，包括dna和rna。
分析物的分离可通过过滤进行；例如，通过在区中提供足够尺寸的孔隙/通道以允许分析物与流体一起移动，但所述孔隙/通道应足够小以防止其他组分的移动。这可称为机械捕集。例如，病毒(尺寸大约0.1μm)可通过清洁区中的过滤作用与红细胞(尺寸大约2μm)分离开来。病毒可然后与芯吸流体一起行进至指示区，任选地经由又一清洁区和/或一个或多个扩增区。例如，病毒可行进通过配置为便于病毒衣壳裂解的清洁区和/或配置为便于逆转录的扩增区和/或配置为扩增dna的扩增区。
清洁区可通过过滤作用移除不希望有的污染物。可通过这样的过滤作用移除的其他样品“污染物”包括颗粒物、纤维素、纤维、硅酸盐、全细胞、细胞空壳、细胞器、细胞碎片、病毒衣壳、脂筏和核糖体。
清洁也可通过亲和结合进行，例如通过静电、范德华力或氢键相互作用或它们的任何组合。可通过选择合适的单体或通过在聚合后处理聚合物网络来实现靶向亲和结合，例如通过用氢氧化物处理以水解酯部分或通过如本文所述共价接枝化学部分。
可使用氨基基团如甲基丙烯酸氨基乙酯来捕获具有负电荷的物种如脂质-膜片段、dna和蛋白质。氨基基团是化学反应性的；初始制造之后可使用它们来在整料的内表面上永久性地固定其他化学品。该结合可以是直接的，或者其可经由添加的连接体(例如，碳二亚胺)进行。氨基基团也可用作锚定剂以捕获化学物质(例如，以固定分子如抗体和/或凝集素)和固定化蛋白酶于清洁区中。
可使用带负电的基团如羧基或硫酸根来捕获带正电荷的物种如蛋白质。羧基基团是化学反应性的；初始制造之后可使用它们来在整料的内表面上永久性地固定其他化学品。该结合可以是直接的，或者其可经由添加的连接体进行。羧基基团也可用在清洁区中以固定蛋白酶或去垢剂样分子用于裂解细胞。
可使用例如通过在聚合过程中使用具有长链的单体(例如，甲基丙烯酸月桂酯、或甲基丙烯酸氨基月桂酯、或甲基丙烯酸磺基月桂酯)引入的长链烷基基团来捕获油和脂肪链分子，例如，去垢剂、甘油三酯、卵磷脂、脂质-膜片段和脂蛋白。
如本文所用，捕获既指完全固定化又指流动过程中的阻滞。
清洁区还可促进分析物例如自细胞等(预分析物)的释放。例如，清洁区可促进以下中的一者或多者：
-经由体细胞、病毒、细菌或真菌的破坏从预分析物释放多核苷酸；
-通过细胞裂解释放胞质溶胶；
-通过酸化释放与白蛋白结合的药物；
-用表面活性剂从磨碎的固体提取分析物。
这些可例如通过例如通过向聚合物基质中共价接枝或浸渍试剂而固定化的试剂(包括酶)来实现。
这些试剂可包括蛋白质，例如酶，例如溶菌酶、蛋白酶；防御素、脂蛋白、核糖核酸酶抑制剂；去垢剂、表面活性剂、变性剂、缓冲剂或它们的任何组合。
清洁区还可在流体进入下一流体处理区之前改变流体的性质。这可通过酸、碱、盐、糖、渗透剂或赋形剂的吸收或释放来实现。例如，渗透剂可为甘油。
相应地，在一些实施方案中，本发明可提供如本文所述的整料或制造如本文所述的整料的方法，其中所述整料包含清洁区，所述清洁区配置为实现以下功能中的至少之一：
-机械捕集样品中的某组分以阻滞或防止该组分在芯吸过程中移动通过整料；
-亲和捕集样品中的某组分以阻滞或防止该组分在芯吸过程中移动通过整料；
-经由体细胞、病毒、细菌或真菌的破坏来促进一种或多种多核苷酸释放；通过细胞裂解促进胞质溶胶释放；
-通过破坏样品基质中的掩蔽效应来促进分析物的释放。
在一些实施方案中，提供两个或更多个平行的清洁区。
反应区
反应区为其中执行对分析物的所需化学修饰的区。实例包括但不限于捕获、水解、加成、共轭和扩增，其最后一者将在下文更详细地描述。这些反应可由如本文所述的共价接枝化合物和/或浸渍化合物得到促进。
反应步骤可能花费比样品芯吸通过该区的长度通常所花的时间更长的时间。反应区可因此配置为阻滞该区中的分析物使得它们留在反应区内足以进行反应步骤的时间。这样的阻滞可为机械阻滞或亲和阻滞。
作为另外一种选择或除此之外，整料可构造为限制流出反应区的流动，例如，可在反应区的末端处和/或在下一区的开始处提供颈区域。作为另外一种选择或除此之外，可在反应区下游提供具有低芯吸率的整料段。下文提供了关于整料配置的更多信息。
扩增
于检测之前扩增分析物可能是有利的。如本文所述，扩增包括增加总分析物含量、修饰分析物以便于检测，例如通过与染料等络合或接枝到染料等、通过触发产生发色团的级联反应、或通过其他反应或处理。扩增可在反应区中进行(即，反应区可为扩增区)。
如上文所述，扩增步骤可能花费比样品芯吸通过该区的长度通常所花的时间更长的时间。扩增区可因此如上文所述配置为阻滞该区中的分析物。
整料可与溶液中的酶、核苷三磷酸和核酸相容，以便其基本上不会干扰涉及它们的反应。其还可适于贮存、保持和/或控制以下物质的释放：有机或无机化学品、蛋白质、酶、天然或非天然核苷酸序列、dna类似物、引物、靶核苷酸序列、探针核苷酸序列、荧光标记核苷酸序列、保存试剂、稳定试剂或它们的任何组合。
相应地，在一些实施方案中，本发明可提供如本文所述的整料或制造如本文所述的整料的方法，其中所述整料包含扩增区，所述扩增区配置为实现以下功能中的至少之一：
-提供与溶液中的酶、核苷三磷酸和核酸的相容性；
-在沿着流体路径的一个或多个位置处向样品中引入试剂；混合试剂与样品；
-贮存、保持和/或控制以下物质的释放：有机或无机化学品、蛋白质、酶、天然或非天然核苷酸序列、dna类似物、引物、靶核苷酸序列、探针核苷酸序列、荧光标记核苷酸序列、保存试剂、稳定试剂或它们的任何组合；
-修饰分析物以便于检测，例如通过与探针络合或接枝到探针，例如发色团、荧光团、胶体金、磁性珠粒、量子点或胶乳珠粒。
相应地，在一些方面，本发明涉及具有配置为促进流体样品中靶核酸序列的扩增的部分的整料，所述整料包含以下组分中的至少之一：
-脱氧核苷三磷酸(dntp)
-内引物，例如fip和bip内引物
-外引物，例如f和b外引物
-聚合酶，例如bstwarmstart2.0聚合酶(newenglandbiolabs)
-缓冲剂、稳定剂和/或盐
-环状引物
如本文所述，这些组分中的每一者可独立地如本文所述共价接枝到整料的聚合物基质或浸渍在整料内。
在一些实施方案中，提供两个或更多个平行的扩增区，例如，在清洁区和指示区之间。
指示区
分析物的检测在整料的指示部中进行。合适地，这是整料的诊断表面上或临近整料的诊断表面的位置。该位置可在指示区中。
指示区可配置为便于分析物的检测。这可以是通过基质改性以引入某些化学部分、通过悬浮试剂或探针于网络内或者印刷(任选地接枝)试剂或探针于诊断表面上所致整料基质的机械/物理性质的结果。合适地，整料是至少部分地半透明的，以便可通过整料的背向照明辅助检测。
指示区可包括检测区域，例如斑点和/或条纹，其指示样品中分析物的存在，例如通过改变颜色、发出磷光等。
这些检测区域可包含探针。合适地，探针可包含发色团、荧光团或猝灭剂。例如，探针可包含苍耳烷衍生物，例如荧光素、若丹明、俄勒冈绿(oregongreen)、曙红和德州红(texasred)或它们的衍生物，例如荧光素-尸胺。
合适地，在制造之后于整料中形成检测区域。例如，可在制造之后向整料的表面上印刷检测区域。例如，探针可作为适于喷墨印刷的溶液来提供。这样，可取得合适尺寸和形状的检测区域。
相应地，在一些实施方案中，本发明可提供如本文所述的整料或制造如本文所述的整料的方法，其中所述整料包含指示区，所述指示区具有一个或多个检测区域，所述检测区域包含如本文所述用于检测分析物的探针。
在一些实施方案中，本发明可提供用于制造如本文所述的整料的方法，所述方法还包括向整料的诊断表面施加包含一种或多种探针的溶液以形成一个或多个检测区域的步骤。所述或每一个检测区域可例如独立地为斑点或条纹(定向为横向或居中)。施加溶液的步骤可为喷墨印刷步骤或移液步骤或滚动步骤，或者可涉及向诊断表面下方的本体材料中注入溶液。
在一些实施方案中，分析物可为样品中的靶核酸序列。
在一些实施方案中，可提供两个或更多个平行的指示区，例如，在反应区和槽区之间。
槽区
合适地，如本文所述整料在使用过程中因自芯吸而进行流体和分析物输送。如本文所述，沿着流动方向可能优选不同的芯吸率，例如以帮助清洁、扩增和/或检测。如本文所述向着芯吸方向上整料的末端提供槽区可能是有利的，以在本文所述方法的过程中促进样品沿着整料的运动性。
槽区配置为具有高的芯吸率和/或流体吸收性；换句话讲，其可起到沿着整料抽吸样品的作用。因此，合适地，槽区可在本文所述的芯吸试验中具有大于3.0cm的芯吸率，优选大于3.2cm，更优选大于3.5cm，更优选大于3.7cm。
除此之外或作为另外一种选择，槽区可具有比芯吸方向上在其之前的一个或多个整料区更大的总容量。这可以是槽区与所述在前的区相比具有更大的宽度和/或深度的结果。
合适地，槽区为吸收器，并可为以下中的至少之一：中和器、去活化器、分解器或它们的任何组合。
相应地，在一些实施方案中，本发明可提供如本文所述的整料或制造如本文所述的整料的方法，其中所述整料包含槽区。合适地，所述槽位于芯吸方向上整料的末端处；即，槽区用作已从整料的流体施加部沿着整料芯吸的流体的槽。
多区配置
如本文所述，在一些实施方案中，本发明提供了具有两个或更多个不同的区的整料。这些区可沿着整料的预期芯吸方向从流体施加部向整料的末端顺序布置。
优选地，整料具有位于整料末端处的槽区。在一些优选的实施方案中，整料总是具有位于最远离样品施加区的区域中的槽区。例如，在线形设计中，槽区和样品加载区在整料的相对端处，而在其中样品加载于中心处的径向设计中，一个或多个槽将在整料的最周缘区域处。
可包括任何形式或功能的不止一个区。这些区可相同或不同。例如，可提供两个不同的反应区。这些区可以是相继的且不同(例如，反应区a和反应区b)或者可以由例如清洁区间隔开。在后一情况下，反应区可具有相同或不同的性质。
如本文所述的整料可用于广泛的工艺和方法。相应地，可使用本文所述和/或对本领域技术人员显而易见的组合物、模具、浸渍、接枝和其他方法提供多种多区整料。
以下布置仅提供以示意可提供的多种多区整料。当然，以下非意在限制本发明的多区整料：
指示区-槽区
反应区-槽区
反应区-指示区-槽区
反应区a-反应区b-指示区-槽区
反应区-清洁区-反应区-指示区-槽区
清洁区-指示区-槽区
清洁区-反应区-指示区-槽区
清洁区-反应区a-反应区b-指示区-槽区
清洁区-反应区-清洁区-反应区-指示区-槽区
清洁区-清洁区-反应区a-反应区b-指示区-槽区
附图中示出了多个非限制性的示例性多区整料。
例如，图6示出了示例性的4区整料。可选择性地使用清洁区来从样品捕集颗粒物材料，如污染物或不期望的细胞类型。反应区可承担多种功能：试剂释放、裂解、消化、逆转录、核酸扩增等(即，其可为清洁区、扩增区或如本文所述两者的组合)。指示区可含将识别感兴趣的分析物(包括对照分析物)的存在的试剂。槽区(吸收区)保持从样品施加点通过每一后续区直至分析完成的流体流。这些区是连续的并各自可根据应用的需要具有多种相容的化学物质。如所示，指示区位于横截面积减小的颈区域中。
如本文所述，可以向整料基质施加含传染剂如流感病毒颗粒的流体样品并使用整料使流体在不同功能的区之间移动的自芯吸性质以连续的方式裂解、逆转录、扩增和检测特定的扩增产物。
整料之间的流体接合部
在一些情况下，可能有利的是在单个设备或外壳中组合不止一个整料。这些单独的整料中的每一者可含有一个或多个如本文所述的区。合适地，这些单独的整料可放置为彼此接触或流体连通使得流体将从一个整料的特定接液部分移动或芯吸到另一整料中。合适地，整料可由外部框架保持彼此接触。或者，可将整料引入到机械组件中，所述机械组件将在施加样品后的某个时间使它们彼此接触。应理解，如果在整料之间的接合部中存在足够的物理接触水平，则这些整料之间的流体传输将是最有效的。在一个实施方案中，单独的整料的界面或抵接表面具有基本上相同的形状或者整料中的一者或两者是足够柔性的以适形于接合部的形状。还应理解，可将不同芯吸材料的一部分放置在两个单独的整料之间以在其间建立流体接合部。
本发明的整料中相关化学过程的演示
以下描述的特定化学过程以示意而非限制的方式提供。
dna扩增
如本文所述的整料可包含一个或多个扩增区。在一些实施方案中，扩增区配置为扩增dna。在一些实施方案中，扩增区配置为将rna转化为dna并且扩增dna二者。在一些实施方案中，提供两个扩增区：第一个配置为将rna转化为dna，第二个配置为扩增新生的dna。
合适地，dna扩增经由等温方法例如链置换扩增(sda)进行。例如，dna扩增可经由滚环扩增(rca)、重组酶/聚合酶扩增(rpa)、指数扩增反应(expar)、螺旋酶依赖性扩增(hda)或环介导扩增(lamp)进行。
优选地，dna扩增可经由环介导扩增(lamp)进行。相应地，在一些方面，本发明提供了用于处理流体样品的自芯吸整料，所述整料包含配置为实现流体样品中dna的环介导扩增的扩增区。本发明还提供了制造这样的整料的方法。
lamp是由notomi及其同事于2000年开发的等温扩增方法(notomi，t.等人，2000，nucleicacidsresearch，28，e63)。此方法使用每靶一组4-6个引物，并可将靶分子扩增为含有原始靶序列的多个复制品的发夹样和花椰菜形结构的混合物。lamp通常在65℃左右使用bst聚合酶样酶运行。当在恒温、具有染料的实时pcr机器中运行时，其将产生pcr样扩增曲线，这些曲线从基线开始上升的时间(time-to-rise)与起始模板的初始量的对数成反比。当模板分子越丰富时，荧光将越快升至阈值以上。
配置为实现环介导扩增的扩增区可包含以下组分中的至少之一：
-脱氧核苷三磷酸(dntp)
-内引物，例如fip和bip内引物
-外引物，例如f和b外引物
-聚合酶，例如bstwarmstart2.0聚合酶(newenglandbiolabs)
-缓冲剂、稳定剂和/或盐
-环引物
如果存在，任何这些组分可被浸渍到聚合物基质中。这可通过在所需的区位置用所述一种或多种组分的一种或多种溶液灌注聚合物基质并然后让溶剂蒸发(这可自然地发生或可在升高的温度和/或减压下进行或通过冻干进行)来实现。浸渍的组分可然后随着芯吸流体通过该区而溶解到芯吸流体中，从而与样品混合以进行lamp反应级联。
作为另外一种选择或除此之外，可使用如本文所述的方法使聚合酶共价接枝到聚合物基质。
应理解，可在芯吸流体中(例如，在样品缓冲剂中)包含促进反应所需的一种或多种组分，以便当芯吸流体在反应区中时可发生反应。
配置为实现lamp的扩增区可还包含逆转录酶。所述逆转录酶可如所述浸渍到基质中。作为另外一种选择或除此之外，其可使用如本文所述的方法共价接枝到聚合物基质。应理解，在本文所述的方法中，逆转录酶可提供在芯吸流体中，例如样品缓冲剂中。
应理解，可将额外的一组lamp组分与相应的模板dna序列、rna序列或病毒颗粒一起浸渍以用作反应对照样品。例如，对照反应可与分析物扩增一起并行地进行。
作为另外一种选择或除此之外，配置为实现lamp的扩增区可在配置为将rna转化为cdna的扩增区(逆转录区)之后，所述配置为将rna转化为cdna的区包含逆转录酶。逆转录酶可被浸渍到聚合物基质中。作为另外一种选择或除此之外，其可使用如本文所述的方法共价接枝到聚合物基质。
相应地，在一些方面，本发明提供了一种制造用于处理流体样品的自芯吸整料的方法，所述方法包括形成配置为实现dna的lamp的扩增区。
形成配置为实现dna的lamp的扩增区的步骤可包括浸渍以下中的一者或多者：脱氧核苷三磷酸(dntp)；内引物，例如，fip和bip内引物；外引物，例如，f和b外引物；环引物；聚合酶，例如，bstwarmstart2.0聚合酶；盐、稳定剂和/或缓冲剂；和对照模板dna和/或rna和/或病毒颗粒(当然，试验模板由芯吸流体供给)。例如，所述浸渍可以是dntp、内引物和外引物及任选地还有环引物的浸渍。
形成扩增区可还包括用聚合酶浸渍聚合物基质和/或向聚合物基质共价接枝聚合酶。
形成扩增区可还包括用逆转录酶浸渍聚合物基质和/或向聚合物基质共价接枝逆转录酶。或者，所述方法可还包括通过逆转录酶的浸渍和/或向聚合物基质共价接枝逆转录酶来形成配置为将rna转化为cdna的扩增区(逆转录区)的步骤。
例如，制造用于处理流体样品的自芯吸整料的方法可为包括以下的方法：
-提供亲水单体和连接体单体，所述连接体单体具有由包含至少一个-c(r)2o-基团的连接体间隔开的两个可聚合基团；
-任选地其中还提供一种或多种另外的单体；
-通过在致孔溶剂中合并所述亲水单体和连接体单体来获得可聚合组合物；
-聚合所述可聚合组合物以形成整料；
-获得作为不含有未聚合的起始材料的聚合物基质的整料；
-形成配置为实现dna的lamp的扩增区，其通过以下实现：
-向聚合物基质中浸渍以下中的一者或多者：脱氧核苷三磷酸(dntp)；内引物，例如，fip和bip内引物；外引物，例如，f和b外引物；环引物；聚合酶，例如，bstwarmstart2.0聚合酶；盐、稳定剂和/或缓冲剂；和模板dna和/或rna和/或病毒颗粒；
-用聚合酶浸渍聚合物基质和/或向聚合物基质共价接枝聚合酶。
所述方法可还包括用逆转录酶浸渍聚合物基质和/或向聚合物基质共价接枝逆转录酶的步骤。或者，所述方法可还包括通过逆转录酶的浸渍和/或向聚合物基质共价接枝逆转录酶来形成配置为将rna转化为cdna的扩增区(逆转录区)的步骤。
所述浸渍可通过向整料施加试剂，然后通过自然蒸发溶剂、于升高的温度和/或减压下蒸发溶剂、冻干或任何其他合适的方法来进行。
还提供了根据所述方法制造的用于处理流体样品的自芯吸整料，所述整料包含配置为实现流体样品中dna的环介导扩增的扩增区。
lamp等温扩增反应
25μl等温lamp反应含有1.4mmdntp、1.6μmfip和bip内引物、0.2μmf和b外引物、0.4μm环引物、≥16单位的bstwarmstart2.0聚合酶(newenglandbiolabs)、dna模板或病毒颗粒和补充了6mmmgso4的1xnewengland
使用流感病毒来证实自芯吸整料中的lamp扩增。
流感病毒是一种负链分节段rna病毒。获得了针对2012-2013季季节性流感的美国medimmune疫苗。2012-2013medimmune疫苗是一种含有活性减毒流感a/california/7/2009(h1n1)、a/victoria/361/2011(h3n2)和b/wisconsin/1/2010病毒株的三价疫苗。使用parida等人在专利(ep2499264a1、us20120231445、wo2011058580a1)中公布的流感aca2009lamp引物。使用这些针对a/california/7/2009株的血凝素基因设计的lamp引物，本发明人能够在溶液中和整料中对稀释的液体疫苗进行lamp反应。使用1e7作为公开颗粒/ml(1e6.5至1e7.5)的平均值来计算lamp反应中使用的病毒颗粒/rna复制数。
应理解，对于从病毒扩增核酸序列，病毒裂解必须在病毒核酸的扩增之前进行。这可通过使用高温在扩增区中实现，或者例如在如本文所述整料的在前清洁区中通过其他方法实现。
对于rna的扩增，合适地进行病毒rna向病毒互补dna(cdna)的逆转录(逆转录)。这可在配置为将rna转化为dna的扩增区中，所述扩增区在配置为实现dna扩增的扩增区之前，或者逆转录和dna扩增可在同一区中进行。
液体反应混合物被芯吸到干燥的整料中，于65℃下温育，在95℃下灭活，并将整料样品浸泡在缓冲液中以洗脱反应产物。扩增产物通过实时pcr定量(图7)。将液体(对照)反应物稀释至与实时pcr前从整料洗脱的液体相同的程度。在50分钟的等温lamp扩增反应后，来自洗脱和液体对照lamp反应的实时pcr扩增曲线同时从基线上升，表明在液体中和整料中具有相当的扩增水平。
dna检测
如本文所述的整料可配置为便于dna的检测，例如通过dna的核酸杂交和信号传导。
相应地，在一些方面，本发明提供了一种制造用于处理流体样品的自芯吸整料的方法，所述方法包括形成配置为便于dna的检测的指示区。例如，所述方法可为制造用于处理流体样品的自芯吸整料的方法，所述方法包括形成配置为实现dna的核酸杂交和信号传导的指示区。
例如但非作为限制，所述核酸杂交和信号传导可以是切口核酸内切酶(nesa)杂交和信号传导过程。配置为实现nesa杂交和信号传导的指示区包含dna探针。合适地，dna探针包含荧光团和由核酸链例如dna的短单链连接的猝灭剂。合适的探针是本领域已知的。合适地，配置为实现nesa杂交和信号传导的指示区还包含切口酶，例如，切口核酸内切酶。相应地，在一些方面，本发明涉及包含切口酶的整料；所述切口酶可共价接枝到整料的聚合物网络和/或浸渍到整料的聚合物网络中。
合适地，所述探针适于检测靶序列。nesa杂交和信号传导过程在美国专利申请us2012/00655088中有详细描述。简而言之，探针的荧光团通过其接近猝灭剂而猝灭。当探针遇到靶序列时，dna探针的核酸序列将与靶序列杂交而形成包含dna探针的双链dna段。作为双链dna，可通过切口酶切割dna探针的核酸序列，从而从荧光团释放猝灭剂使得可检测荧光。通过设计，切口核酸内切酶可分裂dna探针的核酸链而不是靶dna(如图8中所示)。合适地，使用光来使得荧光团可视化。光的波长可选择为合适。光可例如为uv光。
图8示出了切口核酸内切酶反应的原理。当单链dna探针与其dna配对杂交时，切口核酸内切酶将切割探针链，从而分离荧光团与猝灭剂。因为位于切口侧面的探针两侧均较短，故它们将倾向于与靶分离，导致荧光。靶dna然后自由结合到新的未切割探针并继续此循环，产生荧光。如果dna探针是共价接枝到整料的，则荧光将在固定化的部位。
可使用如本文所述的方法将dna探针浸渍到聚合物基质中和/或可将所述探针经由寡核苷酸连接体共价接枝到聚合物基质。形成配置为实现dna的nesa杂交和信号传导的指示区的步骤可包括如本文所述向聚合物基质中浸渍一种或多种dna探针和/或向聚合物基质上共价接枝一种或多种探针。优选地，dna探针是共价接枝的。这将防止荧光团在整料内的迁移，所述迁移会削弱信号。此外，对于不止一种分析物的检测，合适地，可将适宜的dna探针共价接枝于一个或多个指示区内的不同点处以便每一分析物可独立地可视化。例如，整料可包含两种沿着整料的芯吸方向于不同点处共价接枝到聚合物基质的dna探针。
可使用如本文所述的方法将切口酶浸渍到聚合物基质中和/或可将切口酶共价接枝到聚合物基质。形成配置为实现dna的nesa杂交和信号传导的指示区的步骤可包括如本文所述向聚合物基质中浸渍一种或多种切口酶和/或向聚合物基质上共价接枝一种或多种切口酶。
例如，制造用于处理流体样品的自芯吸整料的方法可以是包括以下的方法：
-提供亲水单体和连接体单体，所述连接体单体具有由包含至少一个-c(r)2o-基团的连接体间隔开的两个可聚合基团；
-任选地其中还提供一种或多种另外的单体；
-通过在致孔溶剂中合并所述亲水单体和连接体单体来获得可聚合组合物；
-聚合所述可聚合组合物以形成整料；
-获得作为不含有未聚合的起始材料的聚合物基质的整料；
-形成配置为实现dna的nesa和信号传导的指示区，其通过以下进行：
-用dna探针浸渍聚合物基质和/或向整料共价接枝dna探针；
-用切口酶浸渍聚合物基质和/或向聚合物基质共价接枝切口酶。
优选地，形成配置为实现dna的nesa和信号传导的指示区的步骤包括向聚合物基质共价接枝dna探针。
合适地，切口酶为切口核酸内切酶。
任选地，可存在不止一种dna探针。
还提供了根据所述方法制造的用于处理流体样品的自芯吸整料，所述整料包含配置为实现流体样品中dna的nesa杂交和信号传导的指示区。
偶联dna探针的nesa反应
为测试偶联的探针进行nesa反应和信号传导的能力，将带有共价接枝的探针的整料材料片置于nesa反应溶液中并与仅在溶液中(对照)的结果进行比较。结果示于图9中。对照反应和整料加(plugs)共价接枝nesa探针的反应二者均发出荧光，表明该系统在溶液中、以及探针接枝到整料时都起作用。
为在芯吸反应中显示nesa，使用碳二亚胺化学将胺化nesa探针的斑点固定于羧基整料的指示区中。在芯吸开始前不久，向偶联探针上游不远的整料中浸渍切口核酸内切酶的2μl小斑点。将含缓冲液和dna模板的nesa反应混合物加到50ml圆锥管中。通过立置整料使得样品施加部在反应混合物中来将反应混合物施加到整料(图10)。整料于48℃下在此位置中温育1小时。将整料切成两半(图11，照片)并使之在uv可视化盒中于一侧可视。检测区域因固定化的nesa反应产物而发出荧光。
荧光信号来自整料内的以下事件链：
a)探针与靶序列的杂交，
b)由切口核酸内切酶识别靶双链体序列以及与靶双链体序列络合，
c)通过切口核酸内切酶对靶双链体中的一条链进行酶裂分，
d)络合物组分(包括荧光猝灭剂)的解离，和
e)来自现在未猝灭的荧光端(固定化端)的探针的荧光发射。
图12至23的详细讨论
图12示出了用于处理流体样品102的两区整料110的一个实施方案的侧视图。流体样品102可为生物样品或环境样品，具有或不具有载体流体。整料110包括第一区112和槽区114。第一区112中的化学品和试剂处理流体样品102并且所得混合物113流到或芯吸到槽区114中。
在一些实施方案中，整料110可具有不止两个用于处理流体样品的区。例如，图12中所示与整料110相似的三区整料可包括清洁区、配置作为扩增区的反应区和槽区。
图13为可用来处理流体样品的整料210的一个实施方案的俯视图，其包括清洁区212、反应区214、带指示斑点220的指示区216和槽区218。整料220可配置作为用于分子诊断设备的测试棒，以测试分析物如流体样品102中的靶核酸序列，并且这样的整料将具有配置作为扩增区的反应区214。流体混合物102被加载到整料210中、清洁区212处。清洁区212中的化学品和试剂处理混合物102并且所得混合物213流到或芯吸到反应区214中。反应区214中的化学品和试剂可实现各种功能，如扩增混合物213中预定的靶核酸序列，并且所得混合物215流到或芯吸到指示区216中。指示区216中的化学品和试剂处理混合物215并且所得混合物217流到或芯吸到槽区218中。
当流体混合物215在指示区216中处理时，指示区216中的试剂可与混合物215反应并产生在施加光时可通过反射或透照由光学传感器读取的结果。如果靶核酸序列在混合物215中，则指示区216中透射通过指示斑点220的光的波长和/或强度将存在变化。随着试验进行到结束，混合物217从指示区216流向或芯吸向槽区218，在这里，混合物217被吸收和收集。箭头222示出了整料210中芯吸的方向，并且是如本文所讨论的整料处理条带的典型特征。
四区整料的一个替代实施方案包括配置为具有扩增区212、清洁区214、指示区216和槽区218的整料210。在此实施方案中，清洁区214提供样品的酸或酶处理。
在其他实施方案中，整料可具有不止四个区，如用于实现rna基生物样品的分子诊断测试的五区整料，其具有以下区：清洁区、rna向互补dna的逆转录区、产生的dna的扩增区、指示区和槽区。
图14为加固整料300的一个实施方案的顶视图。图14示出了设置于基材330上的整料310。在一个替代的实施方案中，可无基材330地使用整料310。具有或不具有基材330的整料310可以用来以多种可能的配置处理流体样品，如配置为测试棒以实现分子诊断测试。基材330加固和强化整料310并可防止整料310在组装、装运和操作过程中的破裂。基材330可呈多种配置，如：载体、支承物、框架或托盘。整料310包括清洁区312、反应区314、指示区316和槽区318。图14示出了流体混合物313从清洁区312向反应区314的流动。混合物315离开反应区314并且行进到指示区316。混合物317离开指示区316并且行进到槽区318。指示区316包括指示斑点320和在基材330中的开口或窗口332以允许光源和/或光学传感器能够从整料310上方和下方二者以光的形式到达指示斑点320。
任选地，可向整料或向图14和15中示出的基材330添加光学可读代码(图中未示出)以提供序列号、产品代码、测试代码或它们的任何组合，其可由配置为读取指示区316中的指示测试结果的光学传感器读取。
图15示出了图14的加固整料300的侧视图。整料310设置于基材330上，并且流动从左到右从清洁区312向反应区314向指示区316向槽区318行进。
如图14和图15中所示，指示区316包括颈区域，即，该区中的横向横截面积改变。指示区316的这种变窄是为了在混合物315进入指示区316时减慢其流动，从而与无此限制的配置相比增加在反应区314中发生化学反应的时间量并提供混合物315进入指示区320中的流动的延长。如果靶核酸序列在混合物315中，则指示区316中的化学反应将引起从指示区316发射的光的波长和/或强度的改变并由光学传感器检测到，如图19中所示。作为检测在区316中的测试结果的过程的一部分，指示区316从顶部到底部的薄度将减少透射通过指示区316的任何光的衰减。
整料中的区可配置为具有两个或更多个平行的子区以便该区内的平行处理，如图15-18中所示例。图16示出了具有两个平行的清洁区的整料510的一个实施方案。整料510包括平行地运行的清洁区512a和512b。两个清洁区均接收一部分混合物102。混合物102在两个平行的清洁区512a和512b中处理，两个清洁区可具有不同的过程化学，并且随着混合物流行进到反应区514，输出流513a和513b合并到一起。混合物515从反应区514流向指示区516，指示区516包括指示斑点520。混合物517从指示区516流向清洁区518。
图17示出了整料610的一个实施方案，其具有两个平行的反应区614a和614b，允许在同一整料610中进行两个不同的反应过程。整料610包括接收混合物102的清洁区612。清洁区612的输出流被分成两个混合物613a和613b，其流入相应的平行反应区614a和614b中。相应的平行反应区614a和614b的输出流615a和615b流入指示区616中。指示区616包括指示斑点620。反应区616的输出流617流向槽区618。
图18示出了整料710的一个实施方案，其具有平行的指示斑点716a和716b。整料710包括清洁区712、反应区714、指示斑点716a和716b及槽区718。混合物713从清洁区712流向反应区714。混合物715a和715b流入相应的指示斑点716a和716b中。指示斑点716a和716b包括相应的指示斑点720a和720b。混合物717a和717b从相应的指示斑点716a和716b流入槽区718中。在混合物715a和715b的处理过程中，根据特定的测试应用的需要，两种或更多种靶核酸序列的指示可使用一个或两个光学传感器在单独的指示斑点716a和716b中实现。
图19示出了用于处理或测试流体样品如用于分子诊断测试的装置800的框图。装置800包括测试坞850和测试棒840。测试棒840包含如前文所述的整料，包括分别结合图13-18示出和描述的示例性整料210、310、510、610和710。测试坞850包括包含加热器和温度传感器的加热器系统880、控制器855、光源860、光学传感器865、接口870和内部电源如电池(未示出)。
在一些实施方案中，加热器系统880可包括在测试棒840中并耦合到测试坞850中的控制器855。在一些实施方案中，光源860和光学传感器865可包括在测试棒840中并耦合到测试坞850中的控制器855。
装置800可通过检测流体样品102中一种或多种由rna或dna组成的靶核酸序列用来确定流体样品102是否含有分析物，如特定的细菌、病毒、真菌、寄生生物等。每一测试棒可配置为检测至少一种靶核酸序列，如特定的病原体，例如乙型肝炎、丙型肝炎、h1n1流感病毒等。测试棒840可配置为用后即抛的一次性使用的测试棒，其连接到测试坞850，测试坞850提供进行诊断测试所需的电力和电子系统。在诊断测试后测试坞850可与测试棒840断开连接，并与新的测试棒840一起使用以进行另一测试。测试坞850和测试棒840可使用多种技术配置为耦合在一起，这些技术未在图19中示出。
清洁区812处理流体样品102并产生混合物813，混合物813流到或芯吸到反应区814。反应区814处理自清洁区812接收的混合物813并产生混合物815，混合物815流到或芯吸到指示区816。指示区816处理从反应区814接收的混合物815并产生混合物817，混合物817流到或芯吸到槽区818。槽区818吸收混合物817，结束输入到测试棒840中的流体102的处理。混合物102被处理成混合物813，然后混合物813被进一步处理成混合物815，混合物815被处理成混合物817，其结束在测试棒840中的处理。在流体样品102已被放置并流入清洁区812中后，流体样品102将由已贮存在测试棒840的清洁区812内的各种化学品和试剂处理。在其他实施方案中，可有不止四个顺序耦合的流体处理区。
测试坞850通过有线或无线连接到通信设备875以便读出测试结果。包括加热器和温度传感器的加热器系统880被热耦合到反应区814并且加热器系统880调节反应区814的温度以支持反应区814中dna的扩增，无论所需的温度控制是等温还是其他。可使用光学传感器865与光源860的结合来实现流入指示区816中的混合物815的检测，因为光源860将透过指示区816中的指示斑点820照到光学传感器865。指示区816处理混合物815，如果已发现在样品流体102中存在靶核酸序列，则所得混合物将在由光学传感器865接收的光的波长和/或强度方面产生变化。由光学传感器865接收的光学数据经由链路854被发送至控制器855，在这里，其可经由链路852被发送至接口870。接口870可经由有线或无线链路872将数据发送至计算机或通信设备875。计算机或通信设备875可处理接收到的数据，并且确定是否已在流体混合物102中检测到靶核酸序列以及向装置800的操作者提供关于测试结果的语音和/或视觉消息。在一些实施方案中，控制器可确定是否已在流体样品102中检测到靶核酸序列，并且经由接口870向通信设备875发送通信或消息以将测试结果通知装置800的操作者。
测试棒840可包含各种机械指示器、电子标签(如rfid标签)或光学可读唯一标识符中的任何一种，其可在测试开始时由测试坞850读取以识别连接到测试坞850的测试棒840的类型及在测试过程中控制器855和通信设备875应遵循的测试协议的类型，如测试过程中待进行的任何加热过程的时间安排。
在一个替代的实施方案中(未示出)，光源可在测试棒840的指示斑点820下方与光学传感器865相邻。在这样的替代的实施方案中，光源将从下方照射指示斑点820而光学传感器865将检测由指示斑点820反射或发射的光并检测光在波长和/或强度方面的变化。
控制器855可为微处理器、asic、状态机或其他类型的处理器，其配置为从光学传感器865接收光学数据。通信设备875可被耦合至电信网络或耦合至与互联网耦合的网路服务以提供对数据库的可及性，测试结果可被存储在数据库中以便进一步分析。通信设备875可以是蜂窝电话、智能电话、平板电脑、个人计算机或具有合适的计算或通信能力的其他设备。
图20示出了用于制造多区整料910的装置900的图。图20示出了将在模具905中形成的整料910的侧视图。制造后，整料910可包含各种流体处理区，如：清洁区912、反应区914、指示区916和槽区918。这些区由过渡913、915和917分开。多通道分配器920的喷嘴922、924、926和928位于模具905上方，在模具905中，将在至少一种亲水单体、至少一种连接体单体、至少一种致孔溶剂和至少一种引发剂的聚合之后形成整料910。应理解，装置900为具有四个区的示例性配置，可使用类似的装置通过例如使用多于或少于四个喷嘴来形成具有多于或少于四个区的整料。使用装置900可制备各种类型和型式的整料。
分配器920的每一个喷嘴可根据聚合过程中的需要，填充以溶剂、单体和其他化学品的定制混合物以形成整料910的个体的区。喷嘴922可含有形成区912所需的化学混合物932。喷嘴924可含有形成区914所需的化学混合物934。喷嘴926可含有用来形成区916的化学混合物936。喷嘴928可含有用来形成区918的化学混合物938。在制造装置900的一个替代的实施方案中，整料的任何区内多个串联和/或平行的区域可通过向位于待具有这样的区域的区上方的分配器920增加更多的喷嘴来制造。下面结合图21描述使用图20的制造装置的方法。
图21列出了使用与图20中所示相似的制造装置制造整料如相应的图13、14和19中示出的整料210、310和整料测试棒840或各种其他整料的步骤的方法1000，其中所述整料包含三维自芯吸聚合物。步骤1001提供配置为制造整料910的模具905。步骤1002在模具中限定多个区912、914、916和918，如通过在图20中模具905的相关联的相应区上方设置喷嘴922、924、926和928。步骤1003提供多个容器、喷嘴922、924、926和928，其中所述多个容器中的每一个与所述多个区中的一个相关联。
步骤1004向所述多个容器中的一个中分配多种亲水单体中的一种或多种单体。步骤1005向所述多个容器中的一个中分配多种致孔溶剂中的一种或多种致孔溶剂。任选的步骤1006向所述多个容器中的一个中分配多种连接体单体中的一种或多种单体。任选的步骤1007向所述多个容器中的一个中分配多种引发剂中的一种或多种引发剂。任选的步骤1008可重复步骤1004、1005、1006和1007直至所述多个容器中的每一个已接收至少一种单体、至少一种致孔溶剂、至少一种连接体单体和至少一种引发剂。
任选的步骤1009混合所述多个容器中的每一个的内容物。步骤1010向模具中相应的多个区中的每一个中计量加入所述多个容器中的每一个的内容物。步骤1011引发模具的内容物的聚合。步骤1012完成模具的内容物的聚合并由此形成整料。步骤1013从整料洗涤任何剩余的溶剂。
图22示出了用于制造整料1110的装置1100的图。图22示出了将在模具1105中形成的整料1110的侧视图。制造后，整料1110可包含各种流体处理区，如：清洁区1112、反应区1114、指示区1116和槽区1118。这些区由可移除的隔离器1113、1115和1117分开。多通道分配器1120的喷嘴1122、1124、1126和1128位于模具1105上方，在模具1105中，将在至少一种亲水单体、至少一种连接体单体、至少一种致孔溶剂和至少一种引发剂的聚合之后形成整料1110。应理解，装置1100为具有四个区的示例性配置，可使用类似的装置通过例如使用多于或少于四个喷嘴来形成具有多于或少于四个区的整料。
分配器1120的每一个喷嘴可根据聚合过程中的需要，填充以溶剂、单体和其他化学品的定制混合物以形成整料1110的个体的区。喷嘴1122可含有形成区1112所需的化学混合物1132。喷嘴1124可含有形成区1114所需的化学混合物1134。喷嘴1126可含有用来形成区1116的化学混合物1136。喷嘴1128可含有用来形成区1118的化学混合物1138。下面结合图23描述使用图22的制造装置的方法。
图23列出了使用图22的隔离器和装置制造整料1110的方法1200，其中所述整料包含自芯吸聚合物。步骤1201提供配置为制造整料1110的模具1105及多个隔离器1113、1115和1117。步骤1202将所述多个隔离器定位在模具中以限定多个区。步骤1203提供多个容器，其中所述多个容器中的每一个与所述多个区中的一个相关联。
步骤1204向所述多个容器中的一个中分配多种亲水单体中的一种或多种单体。步骤1205向所述多个容器中的一个中分配多种致孔溶剂中的一种或多种致孔溶剂。步骤1206向所述多个容器中的一个中分配多种连接体单体中的一种或多种单体。步骤1207向所述多个容器中的一个中分配多种引发剂中的一种或多种引发剂。步骤1208重复步骤1204、1205、1206和1207直至所述多个容器中的每一个已接收至少一种单体、至少一种致孔溶剂、至少一种连接体单体和至少一种引发剂。
步骤1209混合所述多个容器中的每一个的内容物。步骤1210向模具中相应的多个区中的每一个中计量加入所述多个容器中的每一个的内容物。步骤1211引发模具的内容物的聚合。在步骤1212中，模具中聚合的状态通过例如使用光学方法来监测。步骤1213在内容物凝固之前从模具移除所述多个隔离器。移除所述多个隔离器的时间安排可根据在移除隔离器之前待取得的所需聚合状态而异。步骤1214完成模具的内容物的聚合并由此形成一个邻接的整料。步骤1215从整料洗涤剩余的溶剂。
在已如上所述形成整料后，可向整料的区中加载各种需要提供每个区的一些不同功能的试剂。每个区所需的试剂可以作为液体施加，所述液体将芯吸到该区或区内的某个区域中并贮存在先前创建的区内。作为另外一种选择或除此之外，整料可例如通过水解和/或共价接枝而被进一步衍生化。整料可任选地与贮存的一种或多种试剂一起干燥。
本发明的整料的一些优点
与先前已知的整料相比，本发明的整料显示出许多优点。除了对于技术人员显而易见的其他优点外，在如本文所述的一些实施方案中，它们可以：
偶允许样品的处理而无需外部泵送。
●制造和使用更高效且更成本有效。
●具有优异的机械性能，使得它们更易于操作。
●允许纳入广泛的功能。例如，本发明的整料可提供完整的“棒上实验室”诊断或分析测定。换句话讲，本发明的整料可以是多功能的。
●适合于大批量的样品处理(通过消除对芯吸设备中薄膜形式的需要)。
●通过允许使用透照以便于检测。
●如本文所述，配置为进行化学反应，例如，细胞裂解、蛋白质变性或分析物扩增。
应理解，本文所述的实例和变型仅用于示意的目的，并且本领域技术人员将在其基础上想到各种变型或改变，这些变型或改变包括在本申请的精神和附随的权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的以其全文引用方式并入本文。
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