经修饰的RNAi多核苷酸及其用途的制作方法

文档序号:19713513发布日期:2020-01-17 19:20阅读:来源:国知局

技术特征:

1.用于抑制靶基因表达的平末端双链rna(dsrna)构建体,所述dsrna构建体包含:

(1)具有5′端和3′端的有义链,其中所述有义链的长度为26、27、28、29或30个核苷酸,其中所述有义链的5′端12个核苷酸和3′端10个核苷酸是2′-修饰的核糖,其防止所述dsrna构建体被dicer加工,其中所述2′-修饰核糖是2′-o-甲基核苷酸,和,

(2)具有5′端和3′端的反义链,其中所述反义链的长度为26、27、28、29或30个核苷酸并且所述反义链是未修饰的,所述反义链与所述有义链杂交并与所述靶基因的mrna杂交,并且

其中所述dsrna构建体以序列依赖性方式抑制靶基因的表达。

2.根据权利要求1的dsrna构建体,其中所述反义链指导靶基因mrna在从反义链5′端起第10和第11个核苷酸之间的单个位点发生均一切割。

3.根据权利要求1的dsrna构建体,其中所述dsrna的有义链可在从有义链3′端起第10和第11个核苷酸之间的单个位点被risc切割。

4.根据权利要求1的dsrna构建体,其中所述dsrna的有义链在从该有义链的3′端起第二个核苷酸处包含错配核苷酸。

5.根据权利要求1的dsrna构建体,其中所述dsrna与具有相同序列的未修饰dsrna相比具有提高的血清和/或脑脊液稳定性。

6.根据权利要求1的dsrna构建体,其中所述有义链3′端的最后2至8个核苷酸与其相应反义链核苷酸错配。

7.根据权利要求1的dsrna构建体,其中所述dsrna在原代细胞中不诱导干扰素应答。

8.根据权利要求1的dsrna构建体,其中所述有义链的任一端和/或所述反义链的3′端被保护基封闭。

9.根据权利要求8的dsrna构建体,其中所述保护基是倒置的核苷酸、倒置的无碱基部分或者氨基端修饰的核苷酸。

10.根据权利要求9的dsrna构建体,其中所述倒置的核苷酸包括倒置的脱氧核苷酸。

11.根据权利要求9的dsrna构建体,其中所述倒置无碱基部分包括倒置的脱氧无碱基部分。

12.根据权利要求11的dsrna构建体,其中所述倒置的脱氧无碱基部分是3′,3′-连接的或5′,5′-连接的脱氧无碱基部分。

13.根据权利要求1的dsrna构建体,其中所述靶基因是sod1、ppib、rip140、pcsk9、tnfα、脂肪细胞脂质结合蛋白或者map4k4。

14.根据权利要求1的dsrna构建体,其中2′修饰核糖核苷酸之间的有义链核苷酸是嘌呤核苷酸,任选地具有一个或更多个硫代磷酸酯连接。

15.根据权利要求1的dsrna构建体,其中2′修饰核糖核苷酸之间的有义链核苷酸形成一个或多个各为1-5个核苷酸的凸出。

16.根据权利要求1的dsrna构建体,其中所述反义链的5′端是磷酸化的。

17.用于抑制靶基因表达的rna构建体,其中所述构建体与权利要求1-16中任一项的dsrna相同,差别仅在于有义链上的单个缺口。

18.根据权利要求17的rna构建体,其中所述缺口占据与距反义链5′端10个碱基的核苷酸相对的位置。

19.根据权利要求18的rna构建体,其中所述缺口占据与距反义链5′端5-15个碱基的核苷酸相对的位置。

20.根据权利要求18-19中任一项的rna构建体,其中每个双链体区域的ag小于-13kcal/mol。

21.载体,其表达权利要求1所述dsrna构建体的至少一条链。

22.细胞,其包含权利要求21的载体或权利要求1的dsrna构建体。

23.根据权利要求22的细胞,其中所述细胞是培养的哺乳动物细胞。

24.根据权利要求22的细胞,其中所述细胞是人细胞。

25.组合物,其包含权利要求1的dsrna构建体以及可药用载体或稀释剂。

26.权利要求1的dsrna构建体在制备用于抑制哺乳动物细胞中靶基因表达的组合物中的用途。

27.根据权利要求26的用途,其中所述哺乳动物细胞是培养的细胞。

28.根据权利要求26的用途,其中所述哺乳动物细胞是人细胞。

29.根据权利要求26的用途,其中所述哺乳动物细胞在递送试剂存在下进行接触。

30.根据权利要求29的用途,其中所述递送试剂是脂质。

31.根据权利要求30的用途,其中所述脂质是阳离子脂质。

32.根据权利要求29的用途,其中所述递送试剂是脂质体。

33.表达权利要求1所述dsrna构建体的至少一条链的载体在制备用于抑制哺乳动物细胞中靶基因表达的组合物中的用途。

34.改进小干扰rna(sirna)的基因沉默作用的方法,其包括修饰所述sirna的有义核苷酸,以变成权利要求1的dsrna构建体。

35.对sirna构建体向靶位点的体内递送进行评估的方法,其包括将该sirna构建体与靶向ppib的权利要求1所述dsrna构建体共递送,以及测定靶位点处ppib功能的抑制,其中在靶位点处ppib功能的成功抑制指示sirna构建体成功体内递送至靶位点。

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