本发明涉及一种固定化细胞多批式发酵生产木糖醇的新技术。
背景技术：
固定化细胞技术是一种在固定化酶技术的基础上形成的一种新型固定化技术，与游离细胞发酵相比，固定化细胞技术的优点可表现为细胞固定化载体为微生物生长提供了充足的空间，保证了生物反应器内较高的细胞浓度使得反应速度加快从而有较高的生产力，分离纯化过程中菌体细胞从发酵液中分离十分容易，由于固定化细胞可以长期多次重复使用简化了游离细胞过程需不断培养菌体的繁复操作防止营养基质的浪费。
固定化细胞技术成功的关键在于载体的选择，在固定化细胞发酵生产木糖醇领域中其固定化方法主要有吸附法、包埋法、交联法等，根据其方法的不同载体的选择也是多种多样的，然而不同载体对于其固定化效果有利有弊。而碳纤维作为一种形似的软性的机械强度较大的材料，大大减少了剪切力和摩擦力对细胞的破坏作用，并且也不具有制备工艺复杂的特点。
再者，碳纤维具有比表面积大、耐高温、生物相容性好、固着化速度快、固着量大、耐生物分解及化学腐蚀、相对成本较低的特点，并且已有相关研究表面聚丙烯腈基碳纤维作为固定化载体在污水处理中的良好应用。但鲜有人把碳纤维作为固定化载体用在热带假丝酵母发酵生产木糖醇的应用中，所以本发明以碳纤维为载体固定化热带假丝酵母进行木糖醇多批式发酵生产，并对其具体工艺进行了确定，提出了一种利用碳纤维固定化细胞多批式发酵生产的新技术。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种碳纤维固定化细胞多批式发酵的新技术、新工艺，应用在固定化热带假丝酵母发酵生产木糖醇中，实现了多批式发酵生产，提高了木糖醇的发酵产率，并缩短了发酵周期和成本。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
本发明的利用碳纤维固定化细胞发酵产木糖醇的新技术，包含以下步骤：
（1）碳纤维预处理：将碳纤维切成长度为0.5-2.0 cm的碳纤维，放入有机溶剂中浸泡3-5 h，过滤或离心回收上清液，用相当于3-5倍碳纤维体积的水对碳纤维进行清洗，然后将清洗后的碳纤维浸泡于体积大于3倍碳纤维体积的沸水浴中处理3-5 h后，用水清洗，烘干，取出备用。
（2）碳纤维固定化热带假丝酵母发酵条件：将步骤（1）中的碳纤维投入到发酵容器中，配制发酵液也加入到发酵容器中，在121℃的条件下灭菌20 min，冷却后进行接种，然后进行固定化细胞多批次发酵生产木糖醇。
（3）固定化细胞多批式发酵：可采用以下三种方法之一进行，（a）先将步骤（1）中备用的碳纤维，取长度为0.5-2.0 cm，以投入量为5-25 g/L加入到发酵培养基中，按5-14%的接种量将种子培养液加入到发酵培养基中进行培养，发酵条件为：初始pH值为4-6，发酵温度为28-32℃，装液量为40-80 mL/250 mL摇瓶，发酵采取两步法进行：第一步发酵时间为16-24 h，转速为160-220 r/min；第二步发酵时间为24 h之后，转速为110-160 r/min。待第一批次发酵结束后，倒出发酵液的20-90%，再补与倒出体积相等的发酵液，进行第二批次的发酵，发酵时间为36-48 h，转速保持110-160 r/min，第三批次及之后与第二批次的条件一致，进行10批次的发酵生产；（b）先将步骤（1）中备用的碳纤维，取长度为0.5-2.0 cm，以投入量为5-25 g/L加入到发酵培养基中，按5-14%的接种量将种子培养液加入到发酵培养基中进行培养，发酵条件为：初始pH值为4-6，发酵温度为28-32℃，装液量为40-80 mL/250 mL摇瓶，发酵采取两步法进行：第一步发酵时间为16-24 h，转速为160-220 r/min；第二步发酵时间为24 h之后，转速为110-160 r/min。待第一批发酵完成后对发酵液进行沉降，倒出上清液后，再补与倒出体积相等的发酵液，进行第二批次的发酵，发酵时间为36-48 h，转速保持110-160 r/min，第三批次及之后与第二批次的条件一致，进行10批次的发酵生产；（c）先将步骤（1）中备用的碳纤维，取长度为0.5-2.0 cm，以投入量为5-25 g/L加入到发酵培养基中，按5-14%的接种量将种子培养液加入到发酵培养基中进行培养，发酵条件为：初始pH值为4-6，发酵温度为28-32℃，装液量为40-80 mL/250 mL摇瓶，发酵采取两步法进行：第一步发酵时间为16-24 h，转速为160-220 r/min；第二步发酵时间为24 h之后，转速为110-160 r/min。待第一批发酵结束后，对发酵液进行离心沉淀，倒上清液后，再补与倒出体积相等的发酵液，进行第二批次的发酵，发酵时间为36-48 h，转速保持110-160 r/min，第三批次及之后与第二批次的条件一致，进行10批次的发酵生产。
进一步，步骤（1）中，将碳纤维切成长度为0.5～2.0 cm碳纤维放入丙酮中浸泡4h，过滤或离心回收上清液，用相当于5倍碳纤维体积的蒸馏水对碳纤维进行清洗，然后将清洗后的短切碳纤维浸泡于体积6倍碳纤维体积的沸水浴中处理4h后，用蒸馏水清洗，烘干，取出备用。
进一步，步骤（1）中，所述碳纤维载体为聚丙烯腈基碳纤维、沥青基碳纤维、粘胶基碳纤维、酚醛基碳纤维中的任意一种或几种。
进一步，固定化载体碳纤维束丝种类为2 k、3 k、6 k、12 k、24 k任意一种或几种。
进一步，所述碳纤维选自6 k碳纤维。
进一步，步骤（2）中碳纤维投入量为5-25 g/L。
进一步，步骤（2）中的种子培养采用改良的YPD培养基；发酵培养：葡萄糖浓度为10-20 g/L，初始底物木糖浓度为60-140 g/L,酵母浸粉4-15 g/L，硫酸镁0.4-1.0 g/L, 磷酸氢二钾4-8 g/L，初始pH值为4-6，发酵温度为28-32℃。
进一步，步骤（2）中发酵容器的装液量为250 mL摇瓶中装入40-80 mL的发酵液。
进一步，步骤（2）中热带假丝酵母种子液的接种量为5-14%。
发酵采取两步法进行，第一步发酵时间为16-24 h，转速为160-220 r/min；第二步发酵时间为24 h之后，转速为110-160 r/min。可进行10批次的固定化发酵。
碳纤维为载体固着细胞的量较大，能较稳定的吸附热带假丝酵母菌，从而达到固定化的目的；碳纤维载体的性能比较稳定，耐微生物的分解和化学腐蚀，不会和培养基中其他成分发生化学反应，较好地避免了培养基中有效成分的破坏；在多批次发酵生产中，经过补料的方式可以较好地降低发酵产物或底物对热带假丝酵母的抑制；本发明与传统的单批游离细胞发酵相比，生物反应器内的细胞浓度较高，反应速度较快，生产力较高，发酵周期较低，且有效的节约了成本；碳纤维载体在利用完之后能够通过一定的处理手段清洗后反复使用。
本发明之固定化细胞多批次发酵生产木糖醇所用载体，具有总表面积大、抗拉强度高、发酵稳定性好以及便于操作等优点，适宜连续使用，更适合于进行多酶体系连续反应，尤其可高效多批次发酵生产木糖醇，在生物发酵工业中具有广泛的发展前途，在细胞的固定化领域中也有很大的应用范围。本发明在进行细胞固定化多批式发酵生产时，操作简单，固定化过程温和，原料廉价易得，成本低。实验证明，在连续发酵过程中，平均每批结束后菌体的浓度（干重）达为22-27 g/L，平均每批结束后木糖醇转化率（以初始木糖计）为70-73%，每批结束后平均木糖醇体积生产速率为1.3-1.5 g/(L·h),平均固定化效率为30-37%。碳纤维载体固定化热带假丝酵母生产木糖醇可连续发酵使用10次，仍保持良好性能。
发明内容
下面结合实施例，对本发明的具体的实施方式进一步详细描述。以下实施例是用来进一步说明本发明的内容，而不限制本发明的保护范围。对于本发明所涉及的相关内容及所做的修改，均属于本发明保护范围。
实施例1：选取聚丙烯腈基6 k碳纤维进行预处理：在丙酮中浸泡4h后，过滤回收清液，用相当于5倍碳纤维体积的蒸馏水对碳纤维进行清洗，然后将清洗后的碳纤维浸泡于体积6倍碳纤维体积的沸水浴中处理4h后，取出短切碳纤维，用蒸馏水冲洗干净，放入风箱烘干，取出备用。
种子培养：采用YPD培养基，对其进行适当调整得：葡萄糖20 g/L，木糖20 g/L,硫酸镁0.4 g/L, 磷酸氢二钾4 g/L,初始pH值为5-6，在121℃，20 min灭菌后，从活化平板上接一环热带假丝酵母菌种，在30℃，200 r/min下培养24 h。
发酵培养:葡萄糖浓度为10 g/L，初始底物木糖浓度为105 g/L,酵母浸粉10 g/L，硫酸镁0.6 g/L,磷酸氢二钾6 g/L。将碳纤维放入摇瓶中和发酵培养基一同灭菌，灭菌温度121℃，时间为20 min。
取碳纤维的长度为1.0 cm，加入量为10 g/l，按10%的接种量将种子培养液加入到发酵培养基中进行培养，发酵条件为：发酵温度30℃，初始pH值为5，装液量为60 mL/250 mL摇瓶，采用两步法调节转速：第一步 0-24 h，180 r/min；第二步24-48 h，140 r/min。待第一批次发酵结束后，倒出发酵液的80%，再补等体积的发酵液，进行第二批次的发酵，发酵时间为48 h，转速保持140 r/min，第三批次及之后与第二批次的条件一致，进行10批式发酵。平均每批结束后菌体的浓度（干重）达为26.8 g/L，平均每批结束后木糖醇转化率（以初始木糖计）为71%，每批结束后平均木糖醇体积生产速率为1.5g/(L·h),平均细胞固定化效率为33%。
实施例2：选取沥青基6k碳纤维进行前处理：在丙酮中浸泡4h后，过滤回收清液，用相当于5倍碳纤维体积的蒸馏水对碳纤维进行清洗，然后将清洗后的碳纤维浸泡于体积6倍碳纤维体积的沸水浴中处理4 h后，取出短切碳纤维，用蒸馏水冲洗干净，放入风箱烘干，取出备用。
种子培养：采用YPD培养基，对其进行适当调整得：葡萄糖15 g/L，木糖15 g/L,硫酸镁0.6 g/L, 磷酸氢二钾5 g/L,初始pH值为4.5-5.5，在121℃，20 min灭菌后，从活化平板上接一环热带假丝酵母菌种，在30℃，200 r/min下培养24 h。
发酵培养:葡萄糖浓度为15 g/L，初始底物木糖浓度为100 g/L,酵母浸粉10 g/L，硫酸镁0.4 g/L,磷酸氢二钾5 g/L。将碳纤维放入摇瓶中和发酵培养基一同灭菌，灭菌温度121℃，时间为20 min。
取碳纤维的长度为0.8 cm，加入量为12 g/l，按6%的接种量将种子培养液加入到发酵培养基中进行培养，发酵条件为：发酵温度32℃，初始pH值为5.5，装液量为50 mL/250 mL摇瓶，采用两步法调节转速：第一步 0-24 h，200 r/min；第二步24-48h，120 r/min。待第一批发酵完成后对发酵液进行沉降，倒出上清液后，再补等体积的发酵液，进行第二批次的发酵，发酵时间为46 h，转速保持120 r/min，第三批次及之后与第二批次的条件一致，进行10批式发酵。平均每批结束后菌体的浓度（干重）达为24.7 g/L，平均每批结束后木糖醇转化率（以初始木糖计）为70%，每批结束后平均木糖醇体积生产速率为1.5g/(L·h),平均细胞固定化效率为37%。
每次所得产物的固定化效果及木糖醇得率通过以下方法测定：
（1）固定化效率的测量方法采用的是重量法：细胞的固定化效率计算为固定菌体干重/总菌体干重；
（2）木糖醇测定方法采用国标法。
本实施例中测得连续发酵过程中，平均每批结束后菌体的浓度（干重）达为22-27 g/L，平均每批结束后木糖醇转化率（以初始木糖计）为70-73%，每批结束后平均木糖醇体积生产速率为1.3-1.5 g/(L·h),平均固定化效率为30-37%。