一种优化型HLA-I类转基因小鼠的构建方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种优化型HLA-I类转基因小鼠的构建方法,特别涉及一种提高HLA-I转基因小鼠HLA-I分子抗原提呈能力的方法。

背景技术：

MHC I类分子的抗原提呈途径包括三个阶段：抗原肽段的产生、肽段转运到内质网、肽段与MHC I类分子的结合和展示。首先，抗原蛋白在细胞浆中被蛋白酶体降解成3-22个残基的短肽。这些短肽经过热休克蛋白HSP90的进一步修剪，由抗原提呈相关转运蛋白(transporter associated with antigen presentation，TAP)选择性地转运至粗面内质网(rough endoplasmic reticulum，RER)腔内。在RER内，分子伴侣钙联蛋白(calnexin，CNX)促进游离的MHC I重链的折叠，并且募集另一分子伴侣ERp57促进MHC I类分子结构域中二硫键的形成；随后，β2-微球蛋白(β2m)与MHC I重链结合，CNX解离，MHC I与分子伴侣钙网蛋白(calreticulin，CRT)结合。当TAP相关蛋白Tapasin(TAP-associated glyprotein)把TAP转运到MHC I类分子附近时，MHC I类分子重链/β2m/ERp57/CRT/Tapasin/TAP共同形成了多肽装载复合体(peptide-loading complex，PLC)。多肽由TAP转运入RER后，PLC中的MHC I类分子对多肽进行捕获。MHC I类分子正确组装并结合了多肽后稳定性增加，并被从PLC中释放出来，进入分泌途径到达细胞表面，在此接受CTL的监视从而触发可能的免疫应答。因此，MHC I类分子抗原加工递呈过程是一个多分子参与的复杂过程，其中参与的分子都将影响着机体的免疫应答反应。

鉴于MHC I类分子的重要性，目前，多种人源MHC I类分子转基因小鼠(即HLA-I转基因小鼠)已被构建并用于人重要病毒CTL表位的筛选、鉴定和免疫治疗评价，如流感病毒、SARS病毒等，为疫苗的开发和应用奠定了良好的基础。但是，鉴于体内抗原加工和递呈过程的复杂性和多因素性，单独HLA-I转基因小鼠的应用往往会造成表位的漏选和错选，影响表位筛选的正确性。有文献指出，由HLA-A2转基因小鼠中筛选出来的牛痘病毒(VACV)表位多肽仅有1/3能与人体试验结果相符(Kotturi MF,et al.(2009)Of mice and humans:how good are HLA transgenic mice as a model of human immune responses？Immunome Res 5:3.)。

另外，已知HLA-A3超家族(包含HLA-A11、HLA-A33、HLA-A68等)在中国人群HLA分型中占着最大比例(约52.7％)(Sette,A.and J.Sidney(1999)Nine major HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and-B polymorphism.Immunogenetics 50(3-4):201-212.)，其中HLA-A11是A3超家族中分布最广的，统计 分析也表明中国乙肝患者中HLA-A11基因频率较高(梁敏锋等(2007)中国华南地区慢性乙型肝炎患者HLA-A等位基因分布的初步调查及其意义.肝脏12卷4期：240-243)，因此建立该家族相关的HLA-I转基因动物模型进行表位筛选具有重要意义。然而有研究表明，该家族成员偏好结合C末端为碱性氨基酸的多肽，这一特点正好与小鼠TAP结合多肽的偏好性不相符(Falk.K.,et al.(1994)Peptide motifs of HLA-A1,-A11,-A31,and-A33molecules.Immunogenetics 40:238-241.)。我们推测，在该类家族HLA-I转基因小鼠中，与之相匹配的多肽被小鼠TAP分子转运到内质网内中的效率将大大降低，从而影响表位筛选。

综合上述内容，我们急需构建一种优化型HLA-I转基因小鼠，使之具有更高的表位筛选效率，以更好地应用于重大疾病研究中CTL表位的筛选和疫苗的评价。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种构建抗原提呈能力增强的HLA-I转基因小鼠模型的方法。

本发明所提供的构建抗原提呈能力增强的HLA-I转基因小鼠模型的方法，具体可包括如下步骤：构建hTAP转基因小鼠，将HLA-I转基因小鼠与所述hTAP转基因小鼠进行交配，所得后代中的双转基因小鼠即为抗原提呈能力增强的HLA-I转基因小鼠模型；

所述hTAP转基因小鼠为转入了如下基因的小鼠：人源TAP1基因、人源TAP2基因、人源PSMB8基因和人源PSMB9基因。

在本发明中，所述hTAP转基因小鼠还被转入了两个HLA-II类分子HLA-DOB基因和HLA-DMB基因。

其中，所述双转基因小鼠为既转入了所述HLA-I转基因小鼠中的外源基因，也转入了所述hTAP转基因小鼠中的外源基因的小鼠。

具体的，所述人源TAP1基因的核苷酸序列为序列表中的序列1；所述人源TAP2基因的核苷酸序列为序列表中的序列2；所述人源PSMB8基因的核苷酸序列为序列表中的序列3；所述人源PSMB9基因的核苷酸序列为序列表中的序列4。所述HLA-DOB基因的核苷酸序列为序列表中的序列5；所述HLA-DMB基因的核苷酸序列为序列表中的序列6。

其中，序列1由8058个核苷酸组成；序列2由9328个核苷酸组成；序列3由3455个核苷酸组成；序列4由5304个核苷酸组成；序列5由3728个核苷酸组成；序列6由6403个核苷酸组成。

更加具体的，所述hTAP转基因小鼠是按照包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将RP11-10A19BAC质粒注射到由目的小鼠1的精子和目的小鼠2的卵子 形成的受精卵的原核中，受精卵移植入代孕母鼠中发育，出生后得到F0代嵌合体小鼠；

所述F0代嵌合体小鼠即为PCR验证鉴定阳性的hTAP首建鼠；

(2)将步骤(1)获得的所述F0嵌合体代小鼠(阳性首建鼠)与所述目的小鼠2进行杂交，通过PCR鉴定和Western blotting分析，从F1代小鼠中获得转入了所述RP11-10A19BAC质粒的杂合体小鼠，该杂合体小鼠即为hTAP转基因小鼠。

当然，所述hTAP转基因小鼠也可为将雄性的杂合体小鼠与雌性的杂合体小鼠进行一次或多次杂交，从杂交后代中获得转入了所述RP11-10A19BAC质粒的纯合体小鼠。

在本发明中，所述目的小鼠1具体为B6D2F1小鼠，所述目的小鼠2具体为C57BL/6小鼠，所述代孕母鼠具体为ICR小鼠。

在本发明中，以上所有的所述RP11-10A19BAC质粒的GenBank ID为207834。

如上所述的构建hTAP转基因小鼠的方法属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种用于构建抗原提呈能力增强的HLA-I转基因小鼠模型的试剂盒。

本发明所提供的用于构建抗原提呈能力增强的HLA-I转基因小鼠模型的试剂盒，具体可包括所述HLA-I转基因小鼠、所述hTAP转基因小鼠以及可读性载体；所述可读性载体中记载有如上所述的构建抗原提呈能力增强的HLA-I转基因小鼠模型的方法。

本发明的又一个目的是提供一种构建hTAP转基因小鼠的试剂盒。

本发明所提供的用于构建hTAP转基因小鼠的试剂盒，具体可包括RP11-10A19BAC质粒以及可读性载体；所述可读性载体中记载有如上所述的构建hTAP转基因小鼠的方法。

所述hTAP转基因小鼠在增强HLA-I转基因小鼠的抗原提呈能力中的应用也属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述HLA-I转基因小鼠可为HLA-A2、HLA-A11、HLA-A1、HLA-A24、HLA-B7、HLA-B27、HLA-B4等目前已有报道的HLA-I转基因小鼠。

在本发明的一个实施例中，所述HLA-I转基因小鼠具体为HLA-A2转基因小鼠或HLA-A11转基因小鼠。所述HLA-A2转基因小鼠为转入HLA-A2基因的C57BL/6J背景小鼠；所述HLA-A11转基因小鼠为转入HLA-A11基因的C57BL/6J×BALB/c背景小鼠。

所述抗原提呈为对相应转基因小鼠的HLA-I限制性表位多肽的提呈。在本发明的一个实施例中，所述HLA-I转基因小鼠具体为HLA-A11转基因小鼠；所述HLA-A11转基因小鼠相应的抗原提呈为对HLA-A11限制性表位多肽的提呈，所述HLA-A11限 制性表位多肽具体为HBc141-151，其氨基酸序列为STLPETTVVRR(序列7)。

在本发明中，所述增强HLA-I转基因小鼠的抗原提呈能力具体体现为针对所述HLA-I限制性表位多肽的CTL反应的增强。

实验证明，本发明构建了hTAP转基因小鼠，将hTAP转基因小鼠与HLA-I转基因小鼠进行交配，繁育出HLA-I/hTAP双转基因小鼠，进行功能实验，发现与HLA-I单转基因小鼠相比，HLA-I/hTAP双转基因小鼠对抗原提呈的能力增强。可见，hTAP转基因小鼠有助于HLA-I转基因小鼠中HLA-I的抗原提呈并增强CTL反应。

附图说明

图1为PCR鉴定hTAP转基因小鼠中人MHC I类抗原提呈途径相关分子。M：DNA分子量标准，各条带由大到小依次为500bp、400bp、300bp和200bp。

图2为Western blotting鉴定hTAP转基因小鼠中人TAP2蛋白的表达。

图3为在HLA-A2/hTAP双转基因小鼠中，HLA-A2分子的表达得到显著上调。A：HLA-A2表达流式图。A2-hTAP表示HLA-A2/hTAP双转基因小鼠；A2表示HLA-A2单转基因小鼠；WT表示野生型C57BL/6J小鼠。B：HLA-A2表达量统计图。

图4为在HLA-A11/hTAP双转基因小鼠中，HLA-A11分子的表达得到显著上调。A：脾细胞表面HLA-A11表达流式图(左)及其统计图(右)，***P<0.001。B：脾细胞表面H2-K^b表达量流式图(左)及其统计图(右)。A11-hTAP表示HLA-A11/hTAP双转基因小鼠；A11het表示HLA-A11单转基因小鼠；TAP表示hTAP转基因小鼠；WT表示野生型C57BL/6J小鼠。

图5为HLA-A11/hTAP双转基因小鼠对HLA-A11限制性表位的CTL反应明显强于HLA-A11单转基因小鼠。A：Elispot检测两种小鼠对HBc141-151的CTL反应，A11-hTAP(n＝5)，A11het(n＝5)，多肽浓度1μg/ml；B：Elispot点数统计柱状图，*P<0.05，**P<0.01。

图6为HLA-A11/hTAP双转基因小鼠中CTL反应显著增强。A：IFN-γ胞内染色散点图；B：INF-γ⁺CD8⁺细胞百分比统计图，^*P<0.05，^**P<0.01。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

RP11-10A19BAC质粒，GenBank ID：207834，该质粒为美国CHOIR(Children’s Hospital Oakland Research Institute)产品。RP11-10A19BAC质粒包含的人MHC I类抗原提呈途径相关分子有TAP1、TAP2、PSMB8和PSMB9，另外还含有两个人MHC II类相关分子HLA-DOB、HLA-DMB。

HLA-A2转基因小鼠：由中国科学院微生物研究所孟颂东课题组惠赠，其遗传背 景为C57BL/6J小鼠。记载于“任玉林等.(2010)新型HLA-A2限制的B,C型HBV特异性CTL表位的筛选及鉴定.科学通报(55)30：2915～2924”一文中，公众可从中国科学院微生物研究所获得。

HLA-A11转基因小鼠：来自Taconic公司，雄性模型小鼠编号9660-M，雌性模型小鼠编号9660-F。其遗传背景为C57BL/6J×BALB/c小鼠。

C57BL/6J小鼠：来自北京华阜康生物科技股份有限公司，电话：010-60753558。

ICR小鼠：雌性，来自北京维通利华实验动物技术有限公司。

B6D2F1小鼠：雄性，来自北京维通利华实验动物技术有限公司。

pCDNA3.1-HBc(D)质粒：由中国科学院微生物研究所孟颂东课题组惠赠。记载于“Xu Y.,et al(2013)Activation of anti-HBV immune activity by DNA vaccine via electroporation using heat shock proteins as adjuvant.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao29(12):1765-75”一文中，公众可从中国科学院微生物研究所获得。该质粒携带有乙肝病毒核心抗原的基因序列，其中乙肝病毒核心抗原的基因序列为序列表中序列8。

实施例1、hTAP转基因小鼠的构建

一、F0代嵌合体小鼠的获得

1、F0代小鼠的获得

用BAC注射缓冲液(配方为：10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，100mM NaCl，10μM亚精胺，30μM精胺，pH7.2)将RP11-10A19BAC质粒配制成浓度为1ng/μl的溶液。将配制好的溶液充满显微注射针，将显微注射针安装到显微注射显微镜上，在显微镜下进行显微操作，即推动注射针透过受精卵(精子来源于B6D2F1小鼠，卵子来源于C57BL/6小鼠)透明质带，利用压力泵的持续压力(约150hPa)向原核注入注射针中的DNA，若原核膨胀则表明注射成功(注入体积极难精确控制，以原核体积发生明显膨胀为指导性标准)。将受精卵置于37℃二氧化碳培养箱培养24小时至2-细胞期后移植到代孕雌鼠(ICR小鼠)中，最终获得F0代小鼠。

2、F0代小鼠基因组制备

F0代小鼠出生14天剪取鼠尾0.3cm，加400μl裂解液(由上海南方模式生物有限公司提供，产品目录号：NMS014)及40μl蛋白酶K(浓度为10mg/ml)，56℃消化过夜。离心取上清，两倍体积无水乙醇沉淀，75％乙醇洗涤，稍晾干后溶解于100μl纯水中，50℃烘箱助溶1小时。

3、F0代小鼠基因型鉴定

以步骤2获得的各F0代小鼠的基因组为模板，分别对人源TAP1、TAP2、PSMB8、PSMB9、HLA-DOB和HLA-DMB基因(6个人源基因的序列依次为序列表中序列1-6 所示)进行PCR扩增。针对各基因的引物序列如下：

针对人源TAP1基因的引物对为：

TAP1-F：5’-GCCTCTTATCGTGTGCTTCT-3’；

TAP1-R：5’-CCATCTCCACCCAAGGTC-3’。

TAP1-F/TAP1-R理论扩增产物大小为319bp。

针对人源TAP2基因的引物对为：

TAP2-F：5’-CGCCCACAGTGTTAGGT-3’；

TAP2-R：5’-GAAGAGGCGTTTGGAATAG-3’。

TAP2-F/TAP2-R理论扩增产物大小为234bp。

针对人源PSMB8基因的引物对为：

PSMB8-F：5’-AGTACGTCAGGTATTTAGC-3’；

PSMB8-R：5’-GAGGGAGTAGGAGTATATG-3’。

PSMB8-F/PSMB8-R理论扩增产物大小为438bp。

针对人源PSMB9基因的引物对为：

PSMB9-F：5’-CACTTAATGTCTCAGTGGGA-3’；

PSMB9-R：5’-TATTTCTCTTCCTGTTCCTC-3’。

PSMB9-F/PSMB9-R理论扩增产物大小为289bp。

针对人源HLA-DOB基因的引物对为：

HLA-DOB-F：5’-TAAACGTGTCTGGTATGTC-3’；

HLA-DOB-R：5’-AGTTAAAGATGAATCTGACC-3’。

HLA-DOB-F/HLA-DOB-R理论扩增产物大小为347bp。

针对人源HLA-DMB基因的引物对为：

HLA-DMB-F：5’-CAAAGGAACATCCAGATGAAG-3’；

HLA-DMB-R：5’-TCCCCCATACTCCCTGAAG-3’。

HLA-DMB-F/HLA-DMB-R理论扩增产物大小为228bp。

实验同时设置以H₂O作为模板的空白对照，以C57BL/6J小鼠(野生型)基因组作为模板的阴性对照，以及以人基因组作为模板的阳性对照。

结果显示，通过受精卵显微注射和移植，受体小鼠数为4只，怀孕数为4只，怀孕率100％；移植卵数为30枚/只，总共出生小鼠(F0代)数为24只，出生率20％。阳性2只，阳性率8.3％。6个人源基因均扩增得到相应目的条带的F0代小鼠即为RP11-10A19BAC质粒注射和移植成功的F0代嵌合体小鼠。

二、F1代杂合体小鼠的获得及基因型鉴定

1、F1代小鼠的获得

根据步骤一对F0代小鼠的基因型鉴定结果，选取阳性的F0代嵌合体小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，得到F1代小鼠(野生型和杂合型)。

2、F1代小鼠基因组制备

参照步骤一2进行。

3、F1代小鼠基因型鉴定

参照步骤一3进行。

六个人源基因均扩增得到相应目的条带的F1代小鼠即为鉴定阳性的转入RP11-10A19BAC质粒的F1代杂合小鼠。部分转入RP11-10A19BAC质粒的F1代杂合体小鼠(Founder2和Founder14)的PCR鉴定结果如图1所示。

4、F1代小鼠表达鉴定

取F1代小鼠脾脏细胞作为样本提取蛋白，针对人源TAP2蛋白进行Western blotting检测。其中，所用一抗为抗人源TAP2蛋白的抗体(鼠源，MBL公司产品，其产品目录号为K0137-3)；二抗为抗小鼠IgG的抗体(山羊源，北京中杉金桥生物技术有限公司产品，其产品目录号为ZDR-5307)。实验同时以β-actin作为内参，一抗为抗β-actin的抗体(鼠源，三箭公司产品，其产品目录号为DKM9001)；二抗为抗小鼠IgG的抗体(山羊源，北京中杉金桥生物技术有限公司产品，其产品目录号为ZDR-5307)。

实验同时设置C57BL/6J小鼠(野生型)作为对照。

有明显人源TAP2蛋白检测信号的F1代小鼠为转入RP11-10A19BAC质粒的表达阳性F1杂合小鼠。部分转入RP11-10A19BAC质粒的F1代杂合体小鼠(Founder2和Founder14)的Western blotting鉴定结果如图2所示。该小鼠的背景为C57BL/6J×B6D2F1，可繁殖用于试验。

为了进一步对F1代杂合体小鼠进行确认，本发明的发明人对其进行了基因测序，结果显示，F1代杂合体小鼠(Founder2和Founder14)确实含有序列表中序列1-6所示的6个人源基因(TAP1、TAP2、PSMB8、PSMB9、HLA-DOB和HLA-DMB)。

三、F10代C57BL/6J背景hTAP杂合体小鼠的获得及基因型鉴定

选取步骤二获得的F1代杂合体小鼠与野生型C57BL/6J进行交配，通过基因型鉴定(步骤一，3)和表达鉴定(步骤二4)以及序列测定获得阳性F2代杂合体小鼠。再将阳性F2代杂合体小鼠与野生型C57BL/6J进行繁殖，获得阳性F3代杂合体小鼠，依此类推进繁殖，最终获得F10代C57BL/6J背景的阳性hTAP杂合体小鼠。

四、C57BL/6J背景hTAP纯合体小鼠的获得及基因型鉴定

选取步骤三获得的雄性F10代杂合体小鼠与雌性F10代杂合体小鼠进行一次或多次交配，获得小鼠(野生型、杂合体、纯合体)通过基因型鉴定(步骤二3)和表达 鉴定(步骤二4)获得阳性纯合体小鼠，可用于保种实验。

纯合小鼠的判定：

同时满足如下I)和II)两个条件的小鼠判定为转入RP11-10A19BAC质粒且可表达转入人源蛋白的hTAP纯合小鼠：

I)经过以上步骤二3和步骤二4均鉴定得到阳性结果；

II)与C57BL/6J野生型小鼠杂交的所有后代经过以上步骤二3和步骤二4的鉴定，同样均可得到阳性结果。

实施例2、hTAP转基因小鼠对HLA-I转基因小鼠的优化作用研究

一、HLA-A2/hTAP双转基因小鼠中HLA-A2在细胞表面的表达量得到提升

1、HLA-A2/hTAP双转基因小鼠的获得

将实施例1构建的F10代hTAP转基因杂合体小鼠与HLA-A2转基因小鼠(C57BL/6背景杂合体)进行交配，对杂交后代进行如下鉴定：

(1)基因型鉴定

对人源TAP1、TAP2、PSMB8、PSMB9、HLA-DOB和HLA-DMB基因的分子鉴定，参照实施例1步骤一3进行。6个基因PCR结果阳性的小鼠为hTAP阳性小鼠，反之为hTAP阴性小鼠。

对HLA-A2基因的分子鉴定的引物对为：

HLA-A2F：5’-GCCCCGAACCCTCGTC-3’；

HLA-A2R：5’-TGAGTGGGCCTTCACTTTC-3’；

理论扩增片段大小为270bp。PCR扩增阳性的小鼠为HLA-A2阳性小鼠，反之为HLA-A2阴性小鼠。

(2)蛋白表达鉴定

对人源TAP2蛋白进行Western blotting检测，参照实施例1步骤二4进行。人源TAP2蛋白表达的为hTAP阳性小鼠，不表达为hTAP阴性小鼠。

对HLA-A2的表达的检测，采用检测小鼠外周血单核细胞表面HLA-A2表达的方法，染色方法见下文之步骤2。

根据各杂交后代的(1)和(2)的鉴定结果，确定杂交后代中的HLA-A2/hTAP双转基因小鼠、HLA-A2单转基因小鼠、hTAP单转基因小鼠以及野生型WT小鼠。

2、HLA-A2/hTAP双转基因小鼠中HLA-A2在细胞表面的表达量检测

分别取HLA-A2/hTAP双转基因小鼠和HLA-A2单转基因小鼠的脾细胞进行流式细胞表面染色，具体操作如下：

(1)处死小鼠，切开小鼠左侧腹部取出脾脏，置于铁筛网中，在预先盛好约10ml 2％FBS DMEM培养基的6cm平皿上研磨，将所得细胞悬液转入15ml离心管中；

(2)离心：4℃1500转/min水平离心5min，弃上清，轻轻震荡使底部细胞弹起；

(3)裂解红细胞：用200μl移液器吸取100μl的10×PBS放在一旁待用，用1ml移液器吸取900μl灭菌ddH₂O加入上步15ml离心管中，迅速用漩涡震荡仪震荡，约5s后迅速加入旁边准备好的100μl 10×PBS，继续震荡混匀5s，加入2％DMEM至10ml；

(4)离心：4℃1500转/min水平离心5min，弃上清，轻轻震荡使底部细胞弹起；

(5)清洗：加入2％FBS DMEM至10ml，4℃1500转/min水平离心5min，弃上清，轻轻震荡使底部细胞弹起；

(6)重悬与过滤：加入5ml 10％FBS 1640培养基重悬，通过200目尼龙膜转入新的15ml离心管中，混匀，吸出10μl到1.5ml EP管中用于计数(细胞计数板，显微镜下计数)；

(7)根据计数结果吸取1×10⁶个脾细胞/只，进行细胞表面分子染色，染色的分子为CD4、CD8、B220以及转基因表达产物HLA分子，相对应的抗体分别为anti-mouse CD4APC(Biolegend公司，Catalog：100412)，anti-mouse CD8αPE(Biolegend公司，Catalog：100708)，anti-mouse B220PerCP-Cy5.5(eBioscience，Catalog：45-0452-80)，以及anti-HLA-A2(Biolegend，Catalog：343304)。

(8)流式细胞仪(Facs Calibur)检测CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞以及B细胞(B220⁺)表面HLA-A2分子的表达水平。

每种小鼠随机选取6-8周龄5只进行实验。

实验同时设置同窝hTAP小鼠和野生型WT小鼠作为对照。

结果显示，HLA-A2/hTAP双转基因小鼠脾细胞表面的HLA-A2的表达量高于单独HLA-A2转基因小鼠的HLA-A2表达量，并且差异显著(图3)。

二、HLA-A11/hTAP双转基因小鼠中HLA-A11的表达量得到显著提升

1、HLA-A11/hTAP双转基因小鼠的获得

将实施例1构建的F10代hTAP转基因杂合体小鼠与HLA-A11转基因小鼠(杂合子)进行交配，通过实施例1中步骤二3和步骤二4的鉴定，分别得到HLA-A11/hTAP双转基因小鼠、HLA-A11单转基因小鼠、hTAP小鼠以及野生型WT小鼠。

2、HLA-A11/hTAP双转基因小鼠中HLA-A11在细胞表面的表达量检测

A.应用流式细胞术检测HLA-A11/hTAP双转基因小鼠和HLA-A11单转基因小鼠脾细胞表面HLA-A11分子的表达水平，具体操作如下：

(1)脾细胞获取方法同前述步骤一2中(1)-(6)。

(2)根据计数结果吸取1×10⁶个脾细胞/只，进行细胞表面分子染色，染色的分 子为CD4、CD8、B220以及转基因表达产物HLA分子，相对应的抗体分别为anti-mouse CD4APC(Biolegend公司，Catalog：100412)，anti-mouse CD8αPE(Biolegend公司，Catalog：100708)，anti-mouse B220PerCP-Cy5.5(eBioscience，Catalog：45-0452-80)，以及anti-HLA ABC FITC(Beckman，Catalog：PN IM1838U)。

(3)流式细胞仪(Facs Calibur)检测CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞以及B细胞(B220⁺)表面HLA-A11分子的表达水平。

每种小鼠随机选取6-8周龄4-6只进行实验。

实验同时设置同窝hTAP小鼠和野生型WT小鼠作为对照。

结果显示，与单独HLA-A11转基因小鼠相比，HLA-A11/hTAP双转基因小鼠的HLA-A11表达水平得到了显著的上调(图4中A)。这种上调预示着在双转基因小鼠中，由于得到人源TAP分子等的辅助，HLA-A11结合到合适表位的概率大大增加，因而将抗原稳定递呈至细胞表面的能力也会得到显著增强。

B.本发明的发明人进一步检测了该上调作用针对的是HLA-A11/hTAP双转基因小鼠中HLA-A11分子还是小鼠自身MHC I类分子H2-K^b。具体操作如下：

(1)脾细胞获取方法同前述步骤一2中(1)-(6)。

(2)根据计数结果吸取1×10⁶个脾细胞/只，进行细胞表面分子染色，染色的分子为CD4、CD8、B220以及转基因表达产物HLA分子，相对应的抗体分别为anti-mouse CD4APC(Biolegend公司，Catalog：100412)，anti-mouse CD8αFITC(Biolegend公司，Catalog：100705)，anti-mouse B220PerCP-Cy5.5(eBioscience，Catalog：45-0452-80)，以及anti-mouse H2-K^b(Biolegend，Catalog：116507)。

(3)流式细胞仪(Facs Calibur)检测CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞以及B细胞(B220⁺)表面H2-K^b分子的表达水平。

每种小鼠随机选取4-6只进行实验。

实验同时设置同窝hTAP小鼠和野生型WT小鼠作为对照。

结果显示，该上调作用主要针对HLA-A11/hTAP双转基因小鼠中HLA-A11分子，小鼠自身MHC I类分子H2-K^b并没有发生显著的表达上调(图4中B)。

三、同HLA-A11单转基因小鼠相比，HLA-A11/hTAP双转基因小鼠中HLA-A11限制性表位的CTL活性显著增强

为了进一步验证hTAP转基因小鼠对HLA转基因小鼠的优化作用，本发明的发明人通过DNA免疫的方法，比较HLA-A11/hTAP双转基因小鼠与HLA-A11单转基因小鼠对同一抗原表位的CTL反应。

HLA-A11/hTAP双转基因小鼠和HLA-A11转基因小鼠各随机选取6-8周龄5-7只，对小鼠进行两次肌肉注射乙肝病毒核心抗原真核表达载体pCDNA3.1-HBc(D)质粒(每 次注射量均为100μg/只，两次注射之间隔14天)，末次注射后第11天检测两种小鼠针对HBc核心抗原中HLA-A11限制性表位HBc141-151(STLPETTVVRR，序列7)的CTL反应。具体操作如下：

(1)脾细胞获取方法同前述步骤一2中(1)-(6)，之后进行以下IFN-γElispot检测和胞内IFN-γ染色，检测CTL反应。

(2)IFN-γElispot检测：小鼠IFN-γElispot检测试剂盒来自BD公司，货号(551083)，具体操作步骤按试剂盒说明书操作。过程如下：第一步，用抗小鼠IFN-γ抗体(试剂盒包含)包被Elispot 96孔板8～16个小时；第二步，获取脾细胞当天，相应的待测孔中加入含特定的刺激物(多肽)的10％FBS 1640培养基100μl，加入含1×10⁶个待测样本细胞的10％FBS 1640培养基100μl，形成200μl的培养体系，细胞均匀地铺在平板底部；第三步，将添加有刺激物的细胞培养板放入CO₂培养箱培养18～20个小时，刺激过程中，多肽特异性的CTL细胞将会被相应多肽刺激持续分泌IFN-γ，分泌的IFN-γ将在细胞所在位置被Elispot板上预先包被的IFN-γ抗体捕获；第四步，弃去细胞液体，洗板，加入Biotin标记的抗IFN-γ抗体，分泌IFN-γ的细胞位置将被Biotin标记的抗IFN-γ抗体标记；第五步，显色反应，试剂盒AEC Substrate Set(BD公司，货号551951)，分泌IFN-γ的位置将形成一定大小的红色斑点，1个斑点代表一个特异性的抗原特异性CD8⁺T细胞，斑点的多少体现了CTL免疫反应的强度。

(3)多肽刺激与胞内IFN-γ染色：第一步，96孔U型底细胞培养板(Costar，货号：Costar-3799)相应的待测孔中加入含特定刺激物(多肽)的10％FBS 1640培养基100μl，加入含1×10⁶个待测样本细胞的10％FBS 1640培养基100μl，形成200μl的培养体系，刺激物配制时同时加入Monensin(Biolegend，货号：420701)，使最终培养体系Monensin浓度变成1×(原液为1000×)；第二步，37℃CO₂培养箱培养4～6小时；第三步，细胞表面染色，使用抗体为anti-mouse CD4PerCP(三箭公司，Catalog：M10043-32C)，anti-mouse CD8αPE(Biolegend公司，Catalog：100708)；第四步，胞内IFN-γ染色，使用的抗体为anti-mouse IFN-γAPC(eBioscience，Catalog：17-7311-82)；第五步，流式细胞仪(Facs Calibur)检测CD8⁺T细胞的IFN-γ表达水平，与阴性对照(不加多肽刺激)相比，CD8⁺IFN-γ⁺的细胞即为抗原特异性的CTL细胞，CD8⁺IFN-γ⁺的细胞的百分比越高，说明相应的CTL反应越强。

Elispot检测结果如图5所示，HLA-A11/hTAP双转基因小鼠中的CTL反应强度明显大于HLA-A11单转基因小鼠，并且差异显著。这表明hTAP转基因小鼠不仅提高了HLA-A11转基因小鼠中HLA-A11的表达，同时也增强了HLA-A11对限制性表位的提呈，促进了体内的CTL反应。

多肽刺激与胞内IFN-γ染色结果如图6所示，与HLA-A11单转基因小鼠相比， HBc141-151多肽刺激后胞内IFN-γ染色表明HLA-A11/hTAP双转基因小鼠表达更多的IFN-γ，激活出更强的CTL反应，并且差异显著。