本发明具体涉及一种固定游离氮木质素的培育方法，属于生物质能开发的领域。
背景技术：
木质素是聚酚类的三维网状高分子化合物，其基本结构单元是苯丙烷结构。在自然界中，木质素的存储量仅次于纤维素，而且每年都以500亿吨的速度再生，随着化石能源的日益枯竭，木质素的丰富储量，其科学的迅速发展，决定着木质素的可持续发展。木质素及其衍生物具有多种功能性，可以作为分散剂、吸附剂、石油回收助剂、沥青乳化剂等。作为有机物质的来源，其应用前景非常的广阔。例如木质素在土壤微生物的作用下经历腐殖化过程，其分解产物及形成的腐殖质对土壤理化性质会产生影响。
木质素是一种可完全生物降解的天然高分子材料，但立体网状分子结构的存在大大延缓了降解过程，如果通过一定的反应将氮元素接在木质素上，再施加到土壤中，氮元素不会立即释放，而是随着木质素分子的降解而缓慢释放，成为一种新型的缓释氮肥。但现有技术中，尚没有一种固氮量高、稳定好的固定游离氮木质素的培育方法。
技术实现要素：
本发明提供了一种固氮量高、稳定好的固定游离氮木质素的培育方法。为了达成上述目的，采用的具体技术方案是：
步骤1：取生产过大豆的土壤作为第一菌源，在温度为30℃～35℃，pH 7.5～8.5，光照条件下在氨氮培养基上进行培养20～36h，获得的菌落作为固定游离氮木质素的第二菌源；
步骤2：将所述第二菌源、水、碱液按照重量比0.5-1.5∶1-3∶0.5-1.5混合，在常温下搅拌10-15min使所述第二菌源充分溶解，得第二菌源溶解液；
步骤3：向所述第二菌源溶解液中依次加入甲醛、四乙烯五胺，于110-120℃下进行水浴加热，回流搅拌3-4h，合成木质素胺；所述第二菌源溶解液、甲醛、四乙烯五胺的重量份比例为2-6∶0.5-1.5∶0.2-1；
步骤4：将所述木质素胺加入到铁氰化钾中，使其完全沉淀出来，抽滤，用 去离子水进行充分洗涤2-3次，最后抽干后于干燥器中干燥，得干燥后木质素胺；
步骤5：取玉米地的土壤，经自然风干后研磨过筛，取所述干燥后木质素胺放入到马弗炉中进行烘干；取烘干后木质素胺，密封于含有氢氧化钠溶液的容器中，21-25℃下培养3-7天，得培养后木质素胺；
步骤6：取所述培养后木质素胺，放于干燥器中，抽真空后保持三氯化碳沸腾，干燥后转移，加入硫酸钾浸提剂，震荡后过滤，加入硫酸铜溶液，浓硫酸澄清后回流，即得固定游离氮木质素。
对上述技术方案的优选，可以为：
在步骤1中，为生产过一季大豆的土壤；
在步骤2中，第二菌源、水、碱液按照重量比1∶2∶1混合；
在步骤3中，第二菌源溶解液、甲醛、四乙烯五胺的重量份比例为6∶0.5∶0.5；
在步骤5中，取烘干后木质素胺，密封于含有氢氧化钠溶液的塑料盒中，23℃下培养5天；
在步骤6中，取所述培养后木质素胺，放于干燥器中，抽真空后保持三氯化碳沸腾3-5min，干燥后转移到三角瓶中，加入0.5mol/L的硫酸钾浸提剂，震荡20-30min后过滤，加入0.15mol/L的硫酸铜溶液，浓硫酸澄清后回流3h；即得固定游离氮木质素。
下面优选的技术方案，也能达到本发明的目的：
在步骤1中，为生产过二季大豆的土壤；
在步骤2中，第二菌源、水、碱液按照重量比0.5∶1∶1.5混合；
在步骤3中，第二菌源溶解液、甲醛、四乙烯五胺的重量份比例为2∶0.5∶1；
在步骤5中，取烘干后木质素胺，密封于含有氢氧化钠溶液的塑料盒中，21℃下培养3天。
能够实现本发明目的的技术方案还包括：
在步骤1中，为生产过三季大豆的土壤；
在步骤2中，第二菌源、水、碱液按照重量比1.5∶3∶0.5混合；
在步骤3中，第二菌源溶解液、甲醛、四乙烯五胺的重量份比例为2∶0.5∶0.2；
在步骤5中，取烘干后木质素胺，密封于含有氢氧化钠溶液的塑料盒中，21℃下培养3天。
令人意外的是，玉米地的土壤，经自然风干后研磨过筛粒径大小在2mm以下时，具有优良的效果。
本发明的氨氮培养基中以质量百分比计，含有琼脂1％～3％，NH4NO310％～20％，MgSO43％～5％，NaCl 10％～20％，KNO310％～20％，K2HPO410％～20％，氨水20％～56％。
本发明的应用原理为：通过选择固定氮源菌落的土壤作为菌源，提出固氮木质素，再通过水浴法合成木质素胺，木质素胺经提纯后放入到土壤中，在常温下培养5天后，经干燥、浸提、过滤、回流、冷却后，获得能固定游离氮的木质素。
本发明的有益效果在于，提供了一种固氮量高、稳定好的固定游离氮木质素的培育方法，填补了国内外空白。用消化-半自动定氮仪测定其土壤中固态游离氮，含量在42.3mg/kg以上。
具体实施方案
实施例1
取生产过一季大豆的土壤作为菌源，在温度为30℃，pH 7.5，光照条件下在含有琼脂1％，NH4NO310％，MgSO43％，NaCl 10％，KNO310％，K2HPO420％，氨水46％氨氮培养基上进行培养20，菌落作为固定游离氮木质素的菌源；在250mL的三口烧瓶中加入5g的木质素，10mL的蒸馏水，0.5mol/L的氢氧化钠溶液5mL，于常温下搅拌10min，使其充分溶解；然后向其中加入4.2mL的甲醛，搅拌5min后，再向其中加入2.8g的四乙烯五胺，于110℃下进行水浴加热，回流搅拌3h，合成木质素胺；将木质素胺加入到20mL的质量分数为12％的铁氰化钾中，使其完全沉淀出来，抽滤，用50mL的去离子水进行充分洗涤2次，最后抽干后于干燥器中干燥；取某玉米地的5cm的土壤，经风干后研磨过筛，取上述的5g木质素胺放入马弗炉中进行烘干，取20g于50mL的小烧杯中，密封于放入少量水的15mL的氢氧化钠溶液的塑料盒中，23℃下培养5天；然后放于干燥器中，抽真空后保持三氯化碳沸腾3-5min，干燥后转移到三角瓶中，加入80mL0.5mol/L的硫酸钾浸提剂，震荡20min后过滤，加入0.15mol/L的硫酸铜溶液0.6mL，浓硫酸10mL澄清后回流3h；冷却后，最后用消化-半自动定氮仪测定其土壤中固态游离氮达42.3mg/kg以上。
实例2
取生产过一季大豆的土壤作为菌源，在温度为35℃，pH为8.0，光照条件下在 含有琼脂3％，NH4NO320％，MgSO45％，NaCl 20％，KNO310％，K2HPO410％，氨水32％氨氮培养基上进行培养28h，菌落作为固定游离氮木质素的菌源；在250mL的三口烧瓶中加入5g的木质素，10mL的蒸馏水，0.5mol/L的氢氧化钠溶液5mL，于常温下搅拌13min，使其充分溶解；然后向其中加入4.2mL的甲醛，搅拌5min后，再向其中加入2.8g的四乙烯五胺，于115℃下进行水浴加热，回流搅拌3h，合成木质素胺；将木质素胺加入到20mL的质量分数为12％的铁氰化钾中，使其完全沉淀出来，抽滤，用50mL的去离子水进行充分洗涤2次，最后抽干后于干燥器中干燥；取某玉米地的10cm的土壤，经风干后研磨过筛，取上述的5g木质素胺放入马弗炉中进行烘干，取20g于50mL的小烧杯中，密封于放入少量水的15mL的氢氧化钠溶液的塑料盒中，23℃下培养5天；然后放于干燥器中，抽真空后保持三氯化碳沸腾3-5min，干燥后转移到三角瓶中，加入80mL0.5mol/L的硫酸钾浸提剂，震荡25min后过滤，加入0.15mol/L的硫酸铜溶液0.6mL，浓硫酸10mL澄清后回流3h；冷却后，最后用消化-半自动定氮仪测定其土壤中固态游离氮达42.3mg/kg以上。
实例3
取生产过一季大豆的土壤作为菌源，在温度为33℃，pH 8.5，光照条件下在含有琼脂2％，NH4NO315％，MgSO43％，NaCl 20％，KNO320％，K2HPO410％，氨水30％氨氮培养基上进行培养36h，菌落作为固定游离氮木质素的菌源；在250mL的三口烧瓶中加入5g的木质素，10mL的蒸馏水，0.5mol/L的氢氧化钠溶液5mL，于常温下搅拌15min，使其充分溶解；然后向其中加入4.2mL的甲醛，搅拌5min后，再向其中加入2.8g的四乙烯五胺，于120℃下进行水浴加热，回流搅拌4h，合成木质素胺；将木质素胺加入到20mL的质量分数为12％的铁氰化钾中，使其完全沉淀出来，抽滤，用50mL的去离子水进行充分洗涤3次，最后抽干后于干燥器中干燥；取某玉米地的15cm的土壤，经风干后研磨过筛，取上述的5g木质素胺放入马弗炉中进行烘干，取20g于50mL的小烧杯中，密封于放入少量水的15mL的氢氧化钠溶液的塑料盒中，23℃下培养5天；然后放于干燥器中，抽真空后保持三氯化碳沸腾3-5min，干燥后转移到三角瓶中，加入80mL0.5mol/L的硫酸钾浸提剂，震荡30min后过滤，加入0.15mol/L的硫酸铜溶液0.6mL，浓硫酸10mL澄清后回流3h；冷却后，最后用消化-半自动定氮仪测定其土壤中固态 游离氮达42.3mg/kg以上。
以上所述实施例仅仅是本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。