启动子recEA4及其应用的制作方法

本发明涉及启动子recEA4及其应用。

背景技术：

2,4,6-三硝基甲苯(英文名称为2,4,6-Trinitrotoluene，简称2,4,6-TNT或TNT)是一种重要的化工原料，应用范围非常广，是最为常用的爆炸原料，在军事、民事等各领域广为应用。TNT在发挥其良好的化工和爆炸性能的同时，作为一种有毒污染物也在给人们的生活造成伤害。TNT作为一种重要的环境污染物分布于空气、水和土壤，具有很强的毒性，与TNT长期接触可对人体健康造成严重不良影响，许多军事试验基地以及经历过TNT生产过程的地域的土壤和地下水都遭到污染，甚至产生“粉红水”，其清理十分困难和昂贵。TNT和它的降解物具有致突变性和致癌性，对水生和陆生的生物都有极大的危害。人长期暴露于TNT的环境下，会增加罹患贫血的机会，同时可能对肝脏、脾脏和免疫系统造成损害，癌症的患病几率也会大大增加。因此，美国环境保护署已确定，2ppb为TNT在饮用水最大允许检测限制。除此之外，作为一种廉价、高效的炸药，是目前为止最为人所熟知的爆炸装填物，一直在军事上广为应用。在军事上，TNT是主要的炸弹和地雷的爆炸装填物，许多地雷和炸弹在战争中被遗留了下来，TNT以其爆炸性能的长效性威胁着人们的生命安全。据联合国统计，目前全世界至少有78个国家仍受到战争遗留雷场及爆炸物的影响，因此战争遗留爆炸物中TNT的定位和检测也在被人们广为研究。

由于TNT具有明显的毒害作用，目前基于TNT的理化性质，已经开发了许多TNT的检测技术，如高效液相色谱(HPLC)、紫外、气相色谱-质谱(GC-MS)、激光表面增强拉曼光谱(SERS)、核磁共振、离子迁移谱等方法，然而它们都需要昂贵和复杂的仪器或繁复的样品制备方法。生物传感器作为现在工程技术领域的一个研究热点，以生物活性单元(如酶、抗体、核酸、细胞等)作为生物敏感元件与待检测的目标物相互作用后产生响应信号，信号处理元件对响应信号进行接收、加工、转换、输出，从而实现对目标物的定性、定量检测。

TNT在工业生产过程中除自身外还包含多种工业制造过程中不可避免的副产物，包括1,3-二硝基苯(1,3-DNB)和2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT),通常地雷中的这些化合物会通过塑料部件缓慢地泄漏，以其蒸汽迁移到表面，因此常常以TNT、1,3-DNB和2,4-DNT为靶标分子来指示TNT污染活地雷等爆炸物的位置。

技术实现要素：

本发明的目的是提供启动子recEA4及其应用。

本发明提供的启动子，来源于大肠杆菌K-12MG1655，命名为recEA4启动子，为序列表的序列1所示的DNA分子。

本发明还保护序列表的序列1所示的DNA分子在启动目的基因表达中的应用。所述目的基因可为报告基因，具体可为荧光标记基因，更具体可为GFP基因。GFP基因具体可如序列表的序列2所示。所述启动目的基因表达具体可为在2,4,6-三硝基甲苯和/或1,3-二硝基苯和/或2,4-二硝基甲苯和/或2,6-二硝基甲苯的诱导作用下启动目的基因表达。

本发明还保护一种DNA分子(融合DNA)，自上游至下游依次包括序列表的序列1所示的DNA分子和报告基因。所述DNA分子中，由序列表的序列1所示的DNA分子启动所述报告基因的表达。所述报告基因具体可为荧光标记基因，更具体可为GFP基因。GFP基因具体可如序列表的序列2所示。

本发明还保护含有所述融合DNA的重组质粒。所述重组质粒具体可为在载体pPROBE-TT的多克隆位点(例如BamHI和KpnI酶切位点之间)插入序列表的序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。

本发明还保护将所述重组质粒导入宿主菌得到的重组菌。所述宿主菌具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌DH5α。所述重组菌即为用于检测2,4,6-三硝基甲苯和/或1,3-二硝基苯和/或2,4-二硝基甲苯和/或2,6-二硝基甲苯的生物传感器。

本发明还保护所述重组菌在检测2,4,6-三硝基甲苯和/或1,3-二硝基苯和/或2,4-二硝基甲苯和/或2,6-二硝基甲苯中的应用。

合成生物学是21世纪初提出的一门全新的交叉学科，2005年MIT的Endy发表了“工程生物学的基础”的综述论文，明确提出在合成生物学中引入工程中常用的“标准化”、“复杂系统解藕”、“概念抽象化”做法,将合成生物学涉及的生物系统分成DNA、零件、装置、系统这样4个层次。合成生物学包括两条路线：(1)新的生物零件、组件和系统的设计与建造；(2)对现有的、天然的生物系统的重新设计。在此基础上合成生物学界提出了BIOBrick思想，将现有的生物学零件标准化、模块化，便于实现各种新功能的开发和新生命系统的组装。目前关于TNT及其他化合物生物检测研究的各种报道，更趋向于作为一种元件和技术的储备。根据合成生物学BioBrick的思想，可以通过对具有不同生物学功能的Brick的组装，来实现具有不同功能的基因线路与系统。

本发明的发明人采用recEA4启动子，以绿色荧光蛋白为报告基因，构建了以大肠杆菌为底盘的全细胞生物传感器，并在检测中体现出了良好的特异性和灵敏度，为后期生物传感器更深层次的开发提供了良好的元件储备。

本发明提供的生物传感器不仅可应用于战时及战后地雷等爆炸物位置的检测鉴定，还为土壤及水环境中的TNT检测提供新的方法。

附图说明

图1为recEA4启动子的EC₂₀₀值。

图2为recEA4启动子的时效性。

图3为recEA4启动子的特异性。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。所有统计学分析均采用SPSS 18.0统计学软件。

大肠杆菌DH5α：北京博迈德生物技术有限公司。载体pPROBE-TT(携带序列表的序列2所示的GFP基因)：addgene公司，货号No.37822。载体pMD18-T：中国大连宝生物工程有限公司。

2,4,6-Trinitrotoluene(TNT)、2,4-Dinitrotoluene(2,4-DNT)、2,6-Dinitrotoluene(2,6-DNT)、1,3-Dinitrobenzene(1,3-DNB)、1,4-Dinitrobenzene(1,4-DNB)、2-Nitrotoluene(2-NT)、3-Nitrotoluene(3-NT)、4-Nitrotoluene(4-NT)、苯(Benzene)、甲苯(Toluene)、硝基苯(Nitrobenzene)均购自Sigma-Aldrich公司。TNT的溶解采用超声法，将TNT粉末加入蒸馏水中，800W超声15分钟。其它化合物均先溶于甲醇，然后在Tris缓冲液(200mM，pH7.0)中稀释。

TGA培养基：含10g/L蛋白胨、5g/L NaCl、2g/L D-(+)葡萄糖、11.9g/L HEPES，余量为水，pH7.0。

实施例1、启动子序列的发现

1、提取大肠杆菌K-12MG1655的染色体基因组。

2、取步骤1得到的染色体基因组，用限制性内切酶Sau3AI对其进行部分酶切(37℃，2小时)，然后进行琼脂糖凝胶电泳并回收纯化2kb以下的DNA片段。

3、取pTJ629载体(含有启动子缺失的luxCDABE基因，并含有广宿主复制子oriV和严谨型复制子pSC101)，用限制性内切酶BamHI进行单酶切(BamHI可产生与Sau3AI相同的粘性末端)，回收载体骨架。

4、将步骤2得到的DNA片段与步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒。

5、将步骤4得到的重组质粒转化大肠杆菌DH5ɑ，得到重组菌。

6、取步骤5得到的重组菌，先采用15mg/L TNT浓度进行筛选，再采用1mg/L TNT浓度进行筛选，去除假阳性克隆和组成型表达的克隆，留下在高低浓度下有显著化学发光值差别的克隆。

筛选获得到1个可以感应TNT的启动子，将其命名为recEA4启动子，其核苷酸序列如序列表的序列1所示。

实施例2、recEA4启动子的功能验证

一、重组菌的获得

1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。

2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-CGGGATCCATCATTCACTGAACAA-3’；

R1：3’-GGGGTACCGGATCAGGTAGTCCAGAGTGG-5’。

3、用限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切步骤2得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切载体pPROBE-TT，回收约6.8kb的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在载体pPROBE-TT的BamHI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列1所示的双链DNA分子。

6、将步骤5得到的重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ，得到重组菌。

二、recEA4启动子的EC₂₀₀值

EC₂₀₀是指可引起两倍指征指标反应时的诱导物的浓度，EC₂₀₀的值越小说明反应的敏感性越强。

取步骤一得到的重组菌，接种至TGA培养基，培养至OD_600nm＝0.6时加入TNT并使其浓度为5、10、15、20、30、50、75、100、200或300mg/L(设置不加入TNT的对照处理)，然后37℃、200rpm振荡培养8h，然后吸取200μl菌液至96孔聚苯乙烯检测板(Bio-rad)，在Pekin Elmer 2300 Multilablel Reader进行检测(GFP检测条件为excitation/emission,485/535nm)。

结果见图1(ΔRFU＝RFU_TNT-RFU_对照)。结果表明，recEA4启动子的EC₂₀₀值为5.32±1.32mg/L。

三、时效性

取步骤一得到的重组菌，接种至TGA培养基，培养至OD_600nm＝0.6时加入TNT并使其浓度为30mg/L(设置不加入TNT的对照处理)，然后37℃、200rpm振荡培养一定时间，然后吸取200μl菌液至96孔聚苯乙烯检测板(Bio-rad)，在Pekin Elmer 2300 Multilablel Reader进行检测(GFP检测条件为excitation/emission,485/535nm)。

结果见图2(ΔRFU＝RFU_TNT-RFU_对照)。结果表明，TNT诱导50min左右即可开启报告基因的表达，TNT诱导100min左右可以观察到明显的荧光反应，TNT诱导4小时后荧光反应基本趋于稳定。

三、特异性

取步骤一得到的重组菌，接种TGA培养基，培养至OD_600nm＝0.2时加入目标化合物并使其浓度为66.04μm/L(设置不加入目标化合物的对照处理)，然后37℃、200rpm振荡培养8小时，然后吸取200μl菌液至96孔聚苯乙烯检测板(Bio-rad)，在Pekin Elmer 2300 Multilablel Reader进行检测(GFP检测条件为excitation/emission,485/535nm)。

目标化合物为2,4,6-TNT、2,4-DNT、2,6-DNT、1,3-DNB、1,4-DNB、2-NT、3-NT、4-NT、Toluene或硝基苯。

结果见图3(ΔRFU＝RFU_TNT-RFU_对照)。结果表明，recEA4启动子对2,4,6-TNT、1,3-DNB、2,4-DNT和2,6-DNT的反应较其他化合物有明显差别(P＜0.05)。