一种试卤灵葡萄糖醛酸苷的制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，提供了一种利用生物转化与快速色谱分离技术高效制备试卤灵葡萄糖醛酸苷的方法。

背景技术：

β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase)是一类广泛存在于哺乳动物溶酶体中的糖蛋白,其负责催化葡萄糖醛酸结合物的水解反应。新近研究发现人体内β-糖醛酸苷酶的表达与一些炎症及癌症的发生发展过程密切相关。β-葡萄糖醛酸苷酶在正常人体液中含量很低,但当有胰腺癌,肝癌,胃癌,膀胱癌,前列腺癌等恶性肿瘤时其含量显著增高,因此β-葡萄糖醛酸苷酶被认为是一种重要的肿瘤标志物，通过检测该酶在特定组织中的水平高低可对肿瘤早起诊断有着积极的指导价值。人体肠道中分布的β-葡萄糖醛酸苷酶还可催化多种药物及内源性激素的葡萄糖醛酸苷水解,释放出的甙元可被肠道再次吸收,从而形成药代动力学上的双峰现象。此外，β-葡萄糖醛酸苷酶还可催化伊立替康代谢产物SN-38G的水解并生成SN-38,而后者在肠道中累积可引发肠粘膜脱落并导致严重的迟发型腹泻等毒副作用。筛选高效安全的β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂可在一定程度上减缓伊立替康等化学药物导致的腹泻等胃肠副作用。由此可见，定量检测不同生物体系中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性及筛选β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂对新药研发、临床诊疗和个性化用药意义重大。但上述工作的开展需要借助高效的β-葡萄糖醛酸苷酶探针底物来实现。

近年来，荧光探针因其具有超灵敏分析、操作简单、检测成本低廉、可实现高通量筛选等优势，被国内外广泛用于各种目标酶及目标物的检测。试卤灵属氧杂蒽类荧光染料，对其基本骨架中的酚羟基进行结构修饰可实现荧光信号的封闭与释放，国内外科研人员基于此特征先后研发了一系列以试卤灵为骨架的荧光探针分子，并将其用于多种功能蛋白活性的定量测定、酶抑制剂的高通量筛选及生物示踪研究。当试卤灵7位酚羟连接一个糖基后其荧光信号会暂时封闭，但其在糖苷酶的作用下可水解生成试卤灵并实现荧光信号的释放。因此试卤灵葡萄糖苷、试卤灵木塘苷及试卤灵葡萄糖醛酸苷等试卤灵衍生物在目标酶活性定量及生物示踪研究领域显示了良好的应用前景。然而，与试卤灵葡萄糖苷相比，试卤灵葡萄糖醛酸苷的化学合成工艺极其复杂、收率低且价格昂贵，极大的限制其在生物学及生物医学领域的应用。目前商业化的试卤灵葡萄糖醛酸苷均为化学合成制备，但由于试卤灵葡萄糖醛酸苷化学合成涉及多步保护和脱保护反应、副产物多、制备工艺繁琐、且部分化学反应的条件较为苛刻、导致其制备成本和目标物收率都无法令人满意。

葡萄糖醛酸结合反应是一种重要的II相代谢反应，许多酚类化合物在人体 及动物体内均可被葡萄糖醛酸化转移酶催化(UDP-Glucuronosyltransferases，UGTs)并生成相应的葡萄糖醛酸苷产物。生物法制备目标底物的葡萄糖醛酸苷产物主要利用尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)介导的转糖反应。此类反应中，葡萄糖醛酸转移酶将葡萄糖醛酸从尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)转移到底物的亲核基团上，生成相应的葡萄糖醛酸苷产物。在此背景下，本发明提供了一条高效、操作简单、廉价，试卤灵葡萄糖醛酸苷制备方法，以试卤灵为原料，借助生物体系中的葡萄糖醛酸化转化酶实现底物的高效生物转化，并借助特殊复合材料实现底物与葡萄糖醛酸苷的高效分离与纯化。在此基础上，本发明还建立了以试卤灵葡萄糖醛酸苷为探针底物的β-葡萄糖醛酸苷酶活性的荧光检测方法，该方法可用于不同生物样本中β-葡萄糖醛酸苷酶活性的快速检测及该酶抑制剂的高通量筛选。

技术内容

本发明的目的在于开发一种高效制备试卤灵葡萄糖醛酸苷的方法，并以试卤灵葡萄糖醛酸苷为探针底物构建了β-葡萄糖醛酸苷酶活性的荧光检测方法。为此，本发明结合高效生物转化与快速色谱分离技术开发了一条高效，廉价的试卤灵葡萄糖醛酸苷制备方法。该方法以试卤灵为原料，选择含有葡萄糖醛酸转移酶(UGT酶)的生物体系为酶源，借助UGT酶介导的酶促反应将试卤灵高效转化为其葡萄糖醛酸化产物，接着将含有该产物的反应液经蛋白沉淀除去大分子后通过填充特殊复合材料的固相萃取柱，借助差异性洗脱体系淋洗后获得试卤灵葡萄糖醛酸苷单体。在此基础上，本发明还以试卤灵葡萄糖醛酸苷为探针底物构建了β-葡萄糖醛酸苷酶活性的荧光检测方法，该方法可用于不同生物样本中β-葡萄糖醛酸苷酶活性的快速检测及该酶抑制剂的高通量筛选。

本发明的具体步骤如下：

1)高效生物转化：利用含有葡萄糖醛酸苷酶(即：UGTs)的生物转化体系将试卤灵高效转化为葡萄糖醛酸结合物，利用有机溶剂沉淀蛋白后并获得待分离样品。其中所用的酶包括重组表达的各种UGT单酶：以及含UGT酶的动物组织微粒体或含有含UGT酶的细胞制备物。

2)目标物选择性洗脱及纯化：将含有试卤灵及其葡萄糖醛酸苷产物的反应液经蛋白沉淀除去大分子后通过填充特殊复合材料的固相萃取柱，首先借助差异性洗脱体系淋洗极性杂质与底物后用酸化有机溶剂选择性洗脱试卤灵葡萄糖醛酸苷，实现目标产物的选择性富集与纯化。最后用氮气吹干含有试卤灵葡萄糖醛酸苷的洗脱液后获得目标化合物单体。

3)试卤灵葡萄糖醛酸苷的应用：以试卤灵葡萄糖醛酸苷为探针底物，在pH7.4的缓冲体系中分别加入待测样品及试卤灵葡萄糖醛酸苷，借助荧光检测器检测单位时间内荧光信号的增益，带入试卤灵标准曲线后获得酶活数据，进而实现不同生物体系中β-葡萄糖苷酶的活性检测及其抑制剂的高通量筛选。

本发明提供的试卤灵葡萄糖醛酸苷的高效制备方法，所述生物转化过程需要5’-二磷酸尿苷葡糖醛酸三钠(UDPGA)在为生物催化过程提供葡萄糖醛酸基 团，其加入的摩尔用量为底物摩尔用量的1-100倍；所述酶源为重组表达的葡萄糖醛酸转移酶，或含有葡萄糖醛酸转移酶的动物组织制备物；所述生物转化反应体系的pH值为6.0-8.0，优选7.4的缓冲体系；反应温度为20-60℃，优选温度为37℃。

本发明提供的试卤灵葡萄糖醛酸苷的高效制备方法，所述分离纯化过程以含有试卤灵及其葡萄糖醛酸苷产物的反应液为原料，以同时键合反相硅胶和阳离子交换色谱填料的复合填料为固定相；所用复合填料中反相填料可选择C8、C18、苯基及其他反相键合填料；离子交换色谱填料选择常用的强阳离子交换树脂填料。混合填料中反相填料与阳离子交换树脂填料的质量比在1:10至10:1之间，优选比例为1:1。上样后采用差异性洗脱流程，分别用纯水、有机溶剂、酸化有机溶剂淋洗不同杂质及目标物；所述有机溶剂可选择甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮中的一种或混合溶剂。所述酸化有机溶剂中所使用的酸为低沸点的有机酸，优选为甲酸或乙酸，酸化溶剂的pH介于0.1-5.0之间。水洗过程中水的用量不低于2倍柱体积；醇具体为甲醇或者乙醇，有机溶剂淋洗的用量为柱体积的2-3倍；节点为洗脱液里不再含有底物试卤灵；酸化有机溶剂的用量为柱体积的2-5倍。

本发明提供的试卤灵葡萄糖醛酸苷的后处理方法，所述生物转化样品上柱且依次通过水洗、醇洗、酸化醇洗之后，经高效液相色谱及液相-质谱检测，代谢产物富集于酸化有机溶剂中；然后经低压蒸发或惰性气体(N₂)吹干，即得纯度>98％的葡萄糖醛酸苷产物。

附图说明

图1：生物转化制备试卤灵葡萄糖醛酸苷的反应式；

图2：生物转化制备试卤灵葡萄糖醛酸苷的流程图；

图3：试卤灵葡萄糖醛酸化反应的高效液相色谱图；

图4：试卤灵葡萄糖醛酸苷的质谱图；

图5：试卤灵葡萄糖醛酸苷的核磁碳谱谱图；

图6：试卤灵葡萄糖醛酸苷紫外波谱图。

具体实施方式

实施例1：利用猴肝微粒体制备试卤灵葡萄糖醛酸苷

试卤灵溶于二甲基亚砜(DMSO)当中配成50mM的贮存液，取猴肝脏微粒体加入等体积的聚氧乙烯醚(Brij58)于冰上进行活化20分钟备用。反应在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行，依次加入活化的猴肝脏微粒体(CyLM)，试卤灵底物，加入氯化镁水溶液(终浓度5mM)，最后加辅因子UDPGA(终浓度4mM)，体系中试卤灵终浓度为0.1mM，猴肝脏微粒体蛋白终浓度为0.5mg/ml，37℃恒温水浴搅拌孵育6h。反应液经甲醇沉淀蛋白后离心，取上清液上固相萃取柱(SPE)，SPE柱由C18反相填料与伯胺聚乙烯树脂填料1:1混合填充。SPE使用前分别用12mL的甲醇和纯水活化固相萃取柱。加入上清液后，使用12mL的纯水淋洗，洗去上清液中的极性杂质，之后加入12mL的甲醇溶液淋洗，此时洗去吸附在 柱子上的未完全转化的试卤灵底物及其他脂溶性杂质，最后加入12mL的1％甲酸-甲醇(体积比)淋洗，得到试卤灵葡萄糖醛酸苷溶液，于室温下N₂吹干酸化甲醇淋洗液，冷冻干燥后称重，生物转化法制得试卤灵葡萄糖醛酸苷4.3mg。目标物含量经HPLC-UV测定为98.6％，总收率为74％。所得产物借助LC-MS及紫外、红外、核磁共振分析技术进行了结构鉴定。其紫外最大吸收波长为456nm，380nm，红外特征波谱数据显示，与底物相比，在3345.41cm-1处羟基伸缩振动峰强度明显增强，在1715.92cm-1处增加了一个羰基特征峰，915.31cm-1处C-H弯曲振动峰变宽。1H-NMR及13C-NMR数据也显示其为试卤灵葡萄糖醛酸苷(附图5)。

实施例2：利用重组UGT1A9酶制备试卤灵葡萄糖醛酸苷

试卤灵溶于DMSO配成50mM的溶液，反应在pH7.4的磷酸盐缓冲盐溶液中进行，依次加入重组UGT1A9(终浓度为0.2mg/ml)、底物试卤灵(终浓度为0.5mM)、氯化镁水溶液(终浓度5mM)、辅因子UDPGA(终浓度4mM)，37℃恒温水浴搅拌孵育2h。反应液经甲醇沉淀蛋白后离心，取上清液上固相萃取柱(SPE)，SPE柱由C8反相填料与伯胺聚丙烯树脂填料1:1混合填充。SPE使用前分别12mL的甲醇和纯水活化固相萃取柱。加入反应液待反应液完全吸附后，使用12mL的纯水淋洗，洗去反应液中的水溶性物质，后加入12mL的甲醇溶液淋洗，此时洗去吸附在柱子上的未完全转化的试卤灵底物及其他一些脂溶性物质，最后加入12mL的酸甲醇淋洗，得到试卤灵葡萄糖醛酸苷溶液，酸化甲醇淋洗液于室温下N₂吹干，冷冻干燥后称重，制得试卤灵葡萄糖醛酸苷5.6mg。含量经HPLC测定为98.4％，总收率为84％。

实施例3：利用重组UGT1A1制备试卤灵葡萄糖醛酸苷

试卤灵溶于DMSO配成50mM的溶液，反应在pH7.4的磷酸盐缓冲盐溶液中进行，依次加入重组UGT1A9(终浓度为0.2mg/ml)、底物试卤灵(终浓度为0.5mM)、氯化镁水溶液(终浓度5mM)、辅因子UDPGA(终浓度5mM)，37℃恒温水浴搅拌孵育6h。HPLC-UV检测底物转化率达65％。反应液经甲醇沉淀蛋白后离心，取上清液上固相萃取柱(SPE)，SPE柱由苯基反相填料与伯胺聚丙烯树脂填料1:1混合填充。SPE使用前分别12mL的甲醇和纯水活化固相萃取柱。反应液完全吸附后，使用12mL的纯水淋洗，洗去反应液中的水溶性物质；后加入12mL的甲醇溶液淋洗，洗去吸附未完全转化的试卤灵底物及其他脂溶性物质；最后加入12mL的酸甲醇淋洗，得到试卤灵葡萄糖醛酸苷溶液，酸化甲醇淋洗液于室温下N₂吹干，冷冻干燥后称重，生物转化法制得试卤灵葡萄糖醛酸苷3.6mg。含量经HPLC-UV测定为98.5％，总收率为60％。

实施例4：利用大鼠肝微粒体制备试卤灵葡萄糖醛酸苷

试卤灵溶于DMSO配成50mM的溶液，反应在pH7.4的盐酸-Tris缓冲盐溶液中进行，取大鼠肝脏微粒体加入等体积的聚氧乙烯醚(Brij58)于冰上进行活化20分钟备用。依次加入活化的大鼠肝脏微粒体(终浓度为0.5mg/ml)、底物试卤灵(终浓度为0.25mM)、氯化镁水溶液(终浓度5mM)、辅因子UDPGA(终 浓度5mM)，37℃恒温水浴搅拌孵育8h。HPLC-UV检测底物转化率达74％。反应液经甲醇沉淀蛋白后离心，去上清液上固相萃取柱(SPE)，SPE柱为同时键盒C18反相填料与伯胺烷基硅胶的离子交换填料。SPE使用前分别12mL的甲醇和纯水活化固相萃取柱。反应液完全吸附后，使用12mL的纯水淋洗，洗去反应液中的水溶性物质；后加入12mL的甲醇溶液淋洗，洗去吸附在柱子上的未转化的试卤灵及其他脂溶性物质，最后加入12mL的酸甲醇淋洗，得到试卤灵葡萄糖醛酸苷溶液，酸化甲醇淋洗液于室温下N₂吹干，冷冻干燥后称重，生物转化法制得试卤灵葡萄糖醛酸苷4.1mg。含量经HPLC-UV测定为98.3％，总收率为69％。