一种达玛烷类化合物制备方法及其抗肿瘤用途与流程

本发明属于药物化学研究领域。具体涉及一种化学合成的四环三萜类化合物20(R)-达玛烷-[12-β-羟基-20，25-环氧]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。英文名：

20(R)-Dammarane-[12-beta-ol-20，25-epoxy]-3-O-beta-D-glucopyranside(简称：20(R)-DEG)，其制备方法及其抗肿瘤的用途。

技术背景

含有手性的化合物药物，其对映体的活性和毒性常有巨大的差异，往往其R型具高效、低毒，而其S型则低效(或无效)高毒，反之亦然。手性化合物及其药物的例子不胜枚举。因此在国内外新药研究中，手性化合物的拆分，是常见的创新点，具有重要意义。

本发明人在追踪研究三七抗肿瘤的活性皂苷的过程中，从三七叶中分离得到一个四环三萜单体化合物：达玛烷-[12-羟基-20，25-环氧基]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(简称：DEG)，并申请了中国发明专利(申请号：CN 201510067046.X)。该化合物于1993年由赵平等从三七根中分离得到的^{[1.云南植物研究1993：15(4)：409-412]}。鉴于天然DEG含量很低，为了扩大药物来源，发明人对DEG进行了化学合成。

发明人在研究合成DEG的过程中，发现它是一个外消旋体，是由C₂₀甲基所产生的光学异构体混合体物。

在以往的记载中，均没有查到关于DEG光学异构体的陈述，也没有关于DEG的C₂₀甲基导致DEG光学异构体的记载。

技术实现要素：

本发明公开了一种DEG的光学异构体，即：式I，20(R)-达玛烷-[12-β-羟基-20，25-环氧]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。英文名：

20(R)-Dammarane-[12-beta-ol-20，25-epoxy]-3-O-beta-D-glucopyranside，简称20(R)-DEG。

DEG经以往的C₁₈HPLC检测，呈现单一正态峰，但经手性柱HLPC检测，则呈现2个峰，表明为存在手性化合物。随将DEG经手性柱HPLC拆分，得到了20(R)-DEG和另一个分子量与其相同，可能是其对映体的化合物。体外细胞实验和动物实验均证明，20(R)-DEG具有较好的抗癌活性。

具体地，发明人是通过下述方法实现发明的：

A.DEG合成。

参考刘惟瑳等^{[2.沈阳药学院学报1988：5(1)：14-15]}的合成方法，将4乙酰溴代beta-D葡萄糖与达玛烷-3β，12β-二醇，在碳酸银催化下缩合，得到达玛烷-[12-beta-羟基-20，25-环氧]-3-O-beta-D-四乙酰葡萄糖苷，再脱去保护基，得到DEG。合成路线如下：

B.DEG拆分。

DEG的手性拆分是用DAICELAD-H手性柱得以实现的。将涂敷直链淀粉-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)硅胶为填料的半制备型手性柱，以正己烷/异丙醇/二乙胺＝80/30/0.1→30/15/0.1作为流动相，用示差折光检测器检测，进行HPLC拆分。在此手性分离系统，DEG得到了良好的分离，并获得高纯度20(R)-DEG，如下式：

C.20(R)-DEG结构确证。

通过对20(R)-DEG的核磁共振¹H-NMR和¹³C-NMR的解析，及其HMBC，HMQC， NOESY的综合解析。确证了20(R)-DEG的结构及其立体构型。综合解析的研究结果表明，20(R)-DEG与DEG在C₁₇，C₁₈，C₂₁，C₂₃，C₂₇等存在着较大的差异，其他C则高度重合。

D.20(R)-DEG抗癌活性。

药理学体外细胞水平抑瘤实验是用MTT法完成的；而整体动物体内抑瘤实验，则是用NU/NU雌性裸鼠完成的。体内外药理实验结果表明，20(R)-DEG抗癌效果明显地好于DEG，从而证明DEG的抗癌活性主要来自于20(R)-DEG。

综上所述，本发明的目的之一，是阐述20(R)-DEG制备方法及其结构。本发明目的之二，是阐述20(R)-DEG的抗癌作用及其医药用途。

附图说明

图1DEG手性柱HPLC色谱图。

图2 20(R)-DEG色谱图

具体实施方式

实施例1

DEG的合成：

分别取达玛烷-3β，12β-二醇，英文：dammarane-3beta，12beta-diol(又名：人参二醇，成都曼斯特生物科技有限公司)820mg和四乙酰溴代葡萄糖(阿法埃莎<天津>化学有限公司)1420mg置于反应瓶中，再取30ml无水乙醚和10ml二氯甲烷溶解置于同一反应瓶中，在35℃恒温搅拌令其溶解，再加入1580mg AgCO₃，在避光条件下35℃恒温反应8小时，过滤，滤液＜45℃减压浓缩得到反应产物。反应产物经过硅胶柱层析，洗脱剂用氯仿/甲醇/水＝60/10/1→15/10/1得到达玛烷-[12-beta-羟基-20，25-环氧]-3-O-beta-D-四乙酰溴代葡萄糖苷450mg。

将达玛烷-[12-beta-羟基-20，25-环氧]-3-O-beta-D-四乙酰溴代葡萄糖苷450mg置于反应容器中，溶解于5ml甲醇中，在常温下搅拌，慢慢滴加蒸馏水至微浑浊，再加入10ml三乙胺，继续搅拌反应5小时，反应产物常温减压浓缩后再次经过硅胶柱层析，用氯仿/乙酸乙酯/甲醇＝40/5/4洗脱，分别接取流份，得到产品DEG(达玛烷-[12-β-羟基-20，25-环氧]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)167mg。

DEG的数据如下：

¹³C NMR(400MHz，C₅D₅N)：

δ39.1，26，8，88.7，40.1，56.2，18.5，35，7，37.0，50.2，39.7，31.3，70.3，49.7，51.4，31.2，25.3，55.0，16.7，16.4，77.1，27.4，35.8，30.0，36.6，73.1，33.3，19.7，28.2，15.8，17.3，107.0，75.7，78.871.9，78.4，63.1。

¹H MNR(400MHz，C₅D₅N)：

1.48，3.75，1.26，1.94，0.98，0.89，1.23，1.25，1.19，0.951.03，0.88，δ4.89。

实施例2

DEG的拆分：

将DEG，经过手性柱检测，出现2个峰(见附图1)。随用半制备手性柱对DEG进行拆分。具体地说，是经过下述方法完成的。

色谱条件：美国Agilent 1260型高效液相色谱工作站；

色谱柱：DAICELAD-H，20×250mm，5μm；(购于北京绿百草科技发展有限公司，日本大赛璐公司出品)

检测波长：206nm

流动相：正己烷/异丙醇/二乙胺＝80/30/0.1→30/15/0.1，在40min内运行完梯度。

流速：2.0ml/min

柱温：35℃

进样体积：200μl

方法：将DEG溶解甲醇，配成1mg/ml甲醇溶液，上述系统进行制备分离，按峰收集，得到20(R)-DEG(见附图2)。

实施例3

20(R)-DEG的结构鉴定：

20(R)-DEG为类白色粉末。mp168～169℃；IR(cm^-1) 3410，3243，2955，2932，1452，1389；FAB-MS(m/z)，623[M+H]⁺，主要碎片峰495[623-128(C₈H₁₆O，侧链)]⁺，461[623-162(Glc)]⁺，提示有一个6碳糖，据此推测其分子量为622，分子式为C₃₆H₆₂O₈；20(R)-DEG的¹³C NMR、¹H MNR、HMBC，HMQC、NOE谱经和DEG数据比对，在C₁₇，C₂₁，C₂₃，C₂₇存在着较大的差别。另外，C₂₁-H分别和C₁₃-H与C₁₈-H存在NOESY。经过对核磁图谱的综合解析碳氢归属相关，确定了20(R)-DEG的立体结构。

20(R)-DEG核磁光谱的碳氢归属及其相关关系如下：

¹³C NMR(400MHz，C₅D₅N，C_位)：δ39.1(C₁)，26，8(C₂)，88.7(C₃)，40.1(C₄)，56.4(C₃)，18.5(C₆)，35，9(C₇)，39.7.0(C₈)，50.2(C₉)，37.1(C₁₀)，31.8(C₁₁)，70.3(C₁₂)，49.7(C₁₃)，51.4(C₁₄)，31.4(C₁₅)，25.4(C₁₆)，55.0(C₁₇)，15.8(C₁₈)，16.4(C₁₉)，76.9(C₂₀)，19.6(C₂₁)，35.8(C₂₂)，16.4(C₂₃)，36.5(C₂₄)，73.1(C₂₅)，33.2(C₂₆)，27.3(C₂₇)，28.2(C₂₈)，16.8(C₂₉)，17.3(C₃₀)，106.9(C_g1)，75.8(C_g2)，78.7(C_g3)71.8(C_g4)，78.4(C_g5)，63.1(C_g6)

¹H MNR(400MHz，C₅D₅N，C_位)：4.04(2H，m，C₁)，4.25(2H，m，C₂)，3.37(1H，dd，C₃)，0.83(1H，C₅)，1.47(2H，m，C₆)，1.34(2H，m，C₇)，1.48(1H，m，C₉)，2.10(2H，m，C₁₁)，3.76(1H，m，C₁₂)，1.78H，m，C₁₃)，1.46(2H，m，C₁₅)，1.76(2H，m，C₁₆)，2.00(1H，m，C₁₇)，0.99(3H，s，C₁₈)，0.89(3H，s C₁₉)，1.21(3H，s C₂₁)，1.16(2H，m，C₂₂)，1.53(2H，m，C₂₃)，1.34(2H，m，C₂₄)，1.25(3H，s，C₂₆)，1.21(3H，s，C₂₇)，1.22(3H，s，C₂₈)，1.03(3H，s，C₂₉)，0.88(3H，s，C₃₀)，6.03(1H，s，12-OH)，δ4.90(1H，d，J＝7.8Hz，C_g1)。

HMBC(400MHz，C₅D₅N，C_位)：C₁-H(C₂，C₃，C₅，)，C₂-H(C₁，C₃，C₄)，C₃-H(C₁，C₂₈，C₂₉，)，C₅-H(C₁，C₂₈，C₂₉，)，C₆-H(C₅，C₈，)，C₇-H(C₅，C₈，C₁₉，)，C₉-H(C₁₁，C₁₄，C₁₈，)，C₁₁-H(C₈，C₁₂，C₁₃，)，C₁₂-H(C₁₁)，C₁₃-H(C₁₂，C₁₄，C₁₇)，C₁₅-H(C₁₆，C₃₀)，C₁₆-H(C₁₄，C₁₅，C₁₇)，C₁₇-H(C₁₃，C₁₆，C₂₀，C₂₁，C₂₂)，C₁₈-H(C₇，C₉)，C₁₉-H(C₁，C₄，C₉)，C₂₀-H(C₁₇，C₂₀，C₂₂)，C₂₂-H(C₂₀，C₂₅)，C₂₃-H(C₂₀)，C₂₄-H(C₂₃，C₂₆，C₂₇)，C₂₆-H(C₂₄，C₂₇)，C₂₇-H(C₂₂，C₂₄，)，C₂₈-H(C₃，C₅，C₂₉)，C₂₉-H(C₃，C₄，C₂₈)，C₃₀-H(C₁₄，C₁₅)。

HMQC(400MHz，C₅D₅N，C_位)：C₃-H(C₃)，C₅-H(C₅)，C₁₃-H(C₁₃)，C₁₉-H(C₁₉)，C₂₁-H(C₂₁)，C₂₆-H(C₂₆)，C₂₇-H(C₂₇)，C₂₈-H(C₂₈)，C₂₉-H(C₂₉)，C₃₀-H(C₃₀)，C_g1-H(C_g1)，C_g2-H(C_g2)，C_g3-H(C_g3)，C_g4-H(C_g4)，C_g5-H(C_g5)，C_g6-H(C_g6)。

NOESY(400MHz，C₅D₅N，C_位)：当照射C₂₁-H时，C₁₃-H和C₁₈-H都有明显加强，表明具有NOE效应。如下：

实施例4

20(R)-DEG体外对肿瘤细胞的抑制作用：

用MTT方法在，人转移性结肠癌细胞(SW620)，人胃腺癌细胞(BGC-823)，人非小细胞肺癌细胞A549，人乳腺癌细胞(MCF-7)，人前列腺癌细胞(PC-3)等5种肿瘤细胞上，对20(R)-DEG的抗癌效果进行了评价，以多西紫杉醇和DEG作为对照药物，并进行抗癌效果的比较。

实验方法：取生长良好的细胞200μl加入96孔板中，置CO2培养箱中培养24小时。加入受试药物20μl/孔，培养48小时。再将20μl MTT加入96孔板中，反应4小时，吸去上清液，再加入20μl DMSO/孔，用酶联免疫检测仪在波长570nm处测定每孔的吸光值，测定药物对细胞的杀伤作用。计算药物抑制50％肿瘤细胞生长所需的浓度(IC₅₀)。结果如下表1。

结果表明，在五个瘤株上均表现出，20(R)-DEG体外抗癌效果IC₅₀浓度略高于多西紫杉醇，但明显低于DEG，以此判断DEG的抗癌活性主要源于20(R)-DEG。

表1：20(R)-DEG对五种癌细胞的抑制IC₅₀值

实施例5

20(R)-DEG对躶鼠体内肿瘤细胞的抑制作用

为了评价20(R)-DEG对动物的抗癌活性，用整体动物裸鼠对其进行了评价。

实验方法：

动物：NU/NU雌性裸鼠，分组，每组10只。

移植肿瘤：取生长良好的细胞接种在前肢皮下，在移植肿瘤后第6～10天，肿瘤重量为100～300mg左右。

给药：腹腔注射隔日一次给药，共给7天。每隔一天称裸鼠体重，计算肿瘤重量。抑瘤率％＝对照组体重-药物组体重/对照组体重结果见表2。

结果：从表2可以看出，20(R)-DEG的抑瘤剂量稍大于多西紫衫醇。相同剂量下，20(R)-DEG抑瘤率明显高于DEG。这一结果与体外细胞抑瘤一致，进一步说明DEG的抗癌活性主要是由20(R)-DEG贡献的。

表2 20(R)-DEG对人转移性结肠癌SW620移植瘤的治疗作用