一种氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法技术领域本发明涉及核苷酸类辅酶领域，尤其涉及一种氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法。
背景技术：
氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（简称：辅酶Ⅱ，英语：Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，NADP）是一种极为重要的核苷酸类辅酶，它是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）中与腺嘌呤相连的核糖环系2'-位的磷酸化衍生物，参与多种合成代谢反应，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成，辅酶Ⅱ在生物体内除了作为氢转移的载体，还作为磷酸转移的媒介参与各种合成反应。辅酶Ⅱ的用途非常广泛，目前传统纯化工艺多采用离子交换树脂纯化等手段，但由于辅酶Ⅱ合成工艺的影响，粗品中一般含有较多的磷酸根，而磷酸根用离子交换纯化的方法不易去除，且在纳滤浓缩过程中也很难去除干净，因此产品中磷酸根残留不易解决。另外，离子交换法获得的辅酶Ⅱ纯度只有95%左右，收率只有60%，产能受到很大限制，不能满足市场的需求，使得国内需求只能采取外购的方式，增加了企业成本和行业成本。因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法，旨在解决现有技术中磷酸根难以分离，且产品纯度低，收率低的问题。为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：一种氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法，其中，包括以下步骤：a、将经过预处理的辅酶Ⅱ溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，收集浓缩的粗品溶液；b、将获得的粗品溶液pH值调至2-4，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为苯基键合硅胶，流动相A为盐酸溶液配成的pH2-4的溶液，流动相B为乙醇，进行梯度洗脱纯化，得到纯化的样品溶液；c、将纯化的样品溶液用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻干燥机冻干，获得纯化的辅酶Ⅱ。所述的氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法，其中，所述步骤a中用于微滤的微滤膜孔径为0.2-1μm。所述的氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法，其中，所述步骤a中用于纳滤的纳滤膜，其截留分子量为200。所述的氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法，其中，所述步骤a中用于纳滤的纳滤膜为中空纤维膜。所述的氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法，其中，所述步骤a中浓缩的粗品溶液的浓度为20-30g/L。所述的氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法，其中，所述步骤c中纯化的样品溶液用膜浓缩设备进行纳滤后的浓度为100~150g/L。所述的氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法，其中，所述步骤c中，用于纳滤的纳滤膜为截留分子量为200的中空纤维膜。所述的氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法，其中，所述步骤b中按体积比计，流动相A：流动相B为1：99-1：1之间。所述的氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法，其中，所述步骤b中梯度洗脱时的洗脱时间为40min。有益效果：本发明通过应用苯基键合硅胶进行反相高效液相纯化辅酶Ⅱ，获得的产品纯度为99%，收率为90%以上，生产效率比其他工艺提高了80%以上，大大降低了生产成本，且有效解决了现有技术中磷酸根残留不易解决和制备出的产品纯度低、收率低的问题。具体实施方式本发明提供了一种氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。一种氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法，其中，包括以下步骤：S101、将经过预处理的辅酶Ⅱ溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，收集浓缩的粗品溶液；S102、将获得的粗品溶液pH值调至2-4，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为苯基键合硅胶，流动相A为盐酸溶液配成的pH2-4的溶液，流动相B为乙醇溶液，进行梯度洗脱纯化，得到纯化的样品溶液；S103、将纯化的样品溶液用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻干燥机冻干，获得纯化的辅酶Ⅱ。本实施例中采用反相高效液相色谱法纯化辅酶Ⅱ，具体为将辅酶Ⅱ溶液进行初步浓缩后以固定相为苯基键合硅胶，流动相为盐酸配制而成的溶液和乙醇溶液的色谱柱进行纯化，再进一步浓缩及冻干，获得纯化的辅酶Ⅱ。采用本发明所述的应用苯基键合硅胶进行高效液相制备，其所制得的辅酶Ⅱ纯度高、收率高、产量大，且能有效解决现有技术中磷酸根残留不易解决的问题，本发明生产工艺简单，适用于工业化大规模生产纯化辅酶Ⅱ。优选地，所述步骤S101中用于微滤的微滤膜孔径为0.2-1μm，例如，本发明优选实施例的所述步骤S101中用于微滤的微滤膜孔径为0.5μm。微滤的基本原理是筛分过程，在静压差作用下滤除大于10μm的微粒，操作压力为0.7-7bar,原料液在压差作用下，其中溶剂透过膜上的微孔流到膜的低压侧，大于膜孔的微粒被截留，从而实现原料液中的微粒与溶剂的分离。微滤过程对微粒的截留机理是筛分作用，决定膜的分离效果是膜的物理结构，孔的形状和大小。本发明实施例中微滤时采用的微滤膜孔径为0.5μm，能初步除去辅酶Ⅱ粗品溶液中较大的微生物及大颗粒分子，微滤膜允许大分子和溶解性固体（无机盐）等通过，但会截留住悬浮物、细菌及大分子量胶体等物质，对辅酶Ⅱ粗品溶液进行初步纯化。微滤膜的孔径过大，会使较大微生物和大颗粒分子透过微滤膜，影响初步过滤的效果；孔径过小，会导致辅酶Ⅱ也无法透过微滤膜，造成产品的损失。优选地，本发明实施例中的步骤S101中用于纳滤的纳滤膜，其截留分子量为200。更优选地，所述步骤S101中用于纳滤的纳滤膜为中空纤维膜。纳滤是一种允许溶剂分子或某些低分子量溶质或低价离子透过的过滤方法，其特点在于能在很低的压力下具有较高的除盐性能和截留分子量为数百的物质，其对于二价或高价离子，特别是阴离子的截留率很高。本发明采截留分子量为200的纳滤膜，可以将分子量大于200的物质过滤出来。另外，将中空纤维膜作为纳滤膜，可以有效清除辅酶Ⅱ制备工艺中所产生的磷酸根残留和其他小分子杂质，使辅酶Ⅱ得到进一步纯化。本发明较佳实施例中，所述步骤S200中磷酸溶液或盐酸溶液的质量浓度为2%~5%，乙醇溶液的质量浓度为5%~30%.更优选地，所述步骤S200中磷酸溶液或盐酸溶液的体积用量为每毫升样品溶液加5~20毫升磷酸溶液或盐酸溶液，乙醇溶液的体积用量为每升流动相加100~400毫升乙醇溶液。具体而言，磷酸溶液或盐酸溶液的质量浓度过高，会导致在梯度洗脱时洗出，若质量浓度过低，会影响物质的分离纯化效果，本发明中采用质量浓度为2%~5%的磷酸溶液或盐酸溶液，可以保证其在梯度洗脱时不被析出的情况下达到高度纯化辅酶Ⅱ的效果。另外，改变酸的用量会影响峰形，从而影响到检测效果。本发明实施例中采用体积用量为每毫升样品溶液加5~20毫升的磷酸溶液或盐酸溶液，体积用量为每升流动相加的乙醇溶液，可以使峰形对称，减少拖尾现象。本发明所述步骤S102中采用磷酸溶液或盐酸溶液将获得的粗品溶液pH值调至2-4，因为辅酶Ⅱ粗品溶液中也含有磷酸根残留，且是采用盐酸配制成的溶液作为流动相A，本发明中采用磷酸溶液或盐酸溶液来调节粗品溶液的pH值，不会引进新的杂质，并且可以在纯化过程中除去磷酸根等物质。具体而言，反相高效液相色谱法中一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间，其适用于分离非极性和极性较弱的化合物。pH会影响样品存在的状态，因而影响保留时间。本发明实施例中采用盐酸配成的pH2-4的溶液和乙醇作为流动相，可以有效调节样品的保留时间，使样品从进入色谱柱到流出色谱柱的时间达到最优化，能使样品的分离效果良好。样品的保留时间过长，会使检测的灵敏度降低；样品的保留时间过短，会使辅酶Ⅱ与杂质的分离效果降低，影响辅酶Ⅱ的纯化。优选地，所述步骤S102中的流动相A与流动相按体积比计为1：99-1：1之间。例如本发明优选实施例中流动相A与流动相按体积比计为50:100。流动相的比例会对样品的检测效果和纯化效果造成影响。若提高盐酸溶液的用量，降低乙醇的用量，则样品保留时间会增长，可以得到很好的分离，但所测的样品的峰变宽，峰高降低，影响检测的灵敏度；而降低盐酸溶液的用量，提高乙醇的用量，则样品的检测灵敏度较高，但样品的分离效果不佳。本发明中采用盐酸配制成的pH为2-4的溶液与乙醇按体积比计为1：99-1：1之间，可以使样品在分离纯化效果良好的同时提高样品检测的灵敏度。优选地，所述步骤S102中梯度洗脱时的洗脱时间为40min，可以使所制备的辅酶Ⅱ纯度更高，且能将90%以上的辅酶Ⅱ洗出，提高产量。在步骤S103中，将纯化的样品溶液用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻干燥机冻干，获得本发明所制备的辅酶Ⅱ，其纯度为99%，收率为90%以上。本发明中采用梯度洗脱法比等度洗脱法能使出峰效果更加对称无拖尾，且能提高柱效，改善检测的灵敏度。另外洗脱时间为40min可以使样品的保留时间合适，辅酶Ⅱ的分离纯化效果最佳。具体按照1%B～10%B梯度洗脱纯化。下列通过具体实施例对本发明进一步阐释：包括以下规格色谱柱（柱子直径╳长度）：5cm*30cm、15cm*30cm、30cm*30cm。柱温为室温。实施例一：1.粗品浓缩：将经过预处理的辅酶Ⅱ溶液用膜浓缩设备进行微滤和纳滤，微滤除掉微生物，纳滤采用截留分子量200的中空纤维膜将粗品浓缩至40-60g/L。2.纯化：纯化条件：色谱柱：5cm*30cm；固定相：苯基键合硅胶；流动相：A相：pH为2的盐酸溶液；B相：乙醇。流速：50-80ml/min；检测波长：260nm；梯度：B%：1%～10%（40min）。进样量为10-15g。纯化过程：将浓缩后的粗品溶液用磷酸溶液或盐酸溶液调pH至2-4，将色谱柱用30%以上的乙醇溶液冲洗干净后平衡进样，进样量为10-15g，线性梯度洗脱40min，收集目的峰。浓缩及冻干：将纯化后的样品溶液用膜浓缩设备（截留分子量200的中空纤维膜）纳滤浓缩至100-150g/L纳滤浓缩，然后用真空冷冻干燥机冻干即可得到纯度大于99%的冻干产品辅酶Ⅱ，总收率可以达到90.8%。实施例二：1.粗品浓缩：将经过预处理的辅酶Ⅱ溶液用膜浓缩设备进行微滤和纳滤，微滤除掉微生物，纳滤采用截留分子量200的中空纤维膜将粗品浓缩至40-60g/L。2.纯化：纯化条件：色谱柱：15cm*30cm；固定相：苯基键合硅胶；流动相：A相：pH为3的盐酸溶液；B相：乙醇；流速：400-500ml/min；检测波长：260nm；梯度：B%：1%～10%（40min）；进样量为70-90g。纯化过程：将浓缩后的粗品溶液用磷酸溶液或盐酸溶液调pH至2-4，将色谱柱用30%以上的乙醇溶液冲洗干净后平衡进样，进样量为70-90g。线性梯度洗脱40min，收集目的峰。3.浓缩及冻干：将纯化后的样品溶液用膜浓缩设备（截留分子量200的中空纤维膜）纳滤浓缩至100-150g/L纳滤浓缩，然后用真空冷冻干燥机冻干即可得到纯度大于99%的冻干产品，总收率可以达到91.5%。实施例三：1.粗品浓缩：将经过预处理的辅酶Ⅱ溶液用膜浓缩设备进行微滤和纳滤，微滤除掉微生物，纳滤采用截留分子量200的中空纤维膜将粗品浓缩至40-60g/L。2.纯化：纯化条件：色谱柱：30cm*30cm；固定相：苯基键合硅胶；流动相：A相：pH为4的盐酸溶液；B相：乙醇；流速：2500-3000ml/min；检测波长：260nm；梯度：B%：1%～10%（40min）；进样量为400-500g。纯化过程：将浓缩后的粗品溶液用磷酸溶液或盐酸溶液调pH至2-4，将色谱柱用30%以上的乙醇溶液冲洗干净后平衡进样，进样量为400-500g。线性梯度洗脱40min，收集目的峰。3.浓缩及冻干：将纯化后的样品溶液用膜浓缩设备（截留分子量200的中空纤维膜）纳滤浓缩至100-150g/L纳滤浓缩，然后用真空冷冻干燥机冻干即可得到纯度大于99%的冻干产品，总收率可以达到91.4%。本发明中通过收集样品的目的峰，当其达到标准时，则将其用膜浓缩设备进行纳滤，再用真空冷冻干燥机冻干，获得本发明所制备纯化的辅酶Ⅱ。由本发明所述方法制备的冻干产品辅酶Ⅱ，其纯度可达99%，总收率可达90%以上，另外由于本发明操作简单，其生产工艺也比其它工艺提高了80%以上，有效解决了现有技术中磷酸根残留不易解决和制备出的产品纯度低、收率低的问题。应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。