一种获得可持续降解藻毒素的微生物的方法与流程

本发明涉及一种获得可持续降解藻毒素的微生物的方法(简称天然培养基法)，即从受藻毒素污染的底泥中提取有效的成分，通过一定比例的浓缩，作为培养基来富集、筛选、分离天然环境中的藻毒素降解菌，属于水体污染治理领域。

背景技术：

由水体富营养化导致的海洋赤潮和淡水水华是全球性的水环境问题。许多藻种如铜绿微囊藻等在其生长过程中会释放大量的藻毒素，能够促发肿瘤的产生，对人体健康产生潜在的威胁。在富营养化水体中，存在许多土著微生物，能够利用藻毒素为碳源进行自身代谢，因此生物降解是藻毒素在自然界中主要的转化和消除途径。然而当蓝藻水华爆发导致水中溶解态的藻毒素大量增加，或者对藻毒素降解需求比较急切时，仅依靠环境中的土著微生物对藻毒素的降解所需时间较长，作用十分有限。因此向藻毒素水体中投加外源藻毒素降解菌受到人们的关注。

许多研究报道了藻毒素降解菌的分离方法及其对藻毒素的降解作用。常用分离藻毒素降解菌的程序如下：首先从受到藻毒素污染的环境中选择可能栖息了藻毒素降解菌的环境样品(底泥或水样，包含微生物群落)，然后将此样品在灭菌的水体中涡旋沉淀，使菌体群落与介质分离；其次在以藻毒素为唯一碳源的无机盐培养基中对微生物群落进行富集、分离，最终选择能够利用藻毒素为碳源的微生物。但利用这些方法所分离出的菌种应用于天然水体中时，其对藻毒素的降解能力往往远低于在无机盐培养基中呈现的降解效率，甚至失去对藻毒素的降解能力。这主要可能是有以下两方面原因引起的：首先从营养成分较为丰富的人工无机盐培养基中富集与分离的菌种无法适应营养相对匮乏的天然环境，适应能力退化甚至丧失；其次天然环境中仅有1％的菌种能够通过在化学培养基上纯培养获得菌株，许多具有藻毒素降解功能的细菌是无法进行纯培养的。

为了解决以上问题，有研究者利用稀释培养基来分离微生物，或采用过滤-富集的微生物培养方法，获得了一些不能通过普通微生物分离法获得的藻毒素降解菌，但分离出来的菌种对藻毒素的降解效率仍旧不高。本专利拟提出一种获得可持续降解藻毒素的微生物的方法，具体来说就是从受藻毒素污染的底泥中提取有效成分，通过一定比例浓缩，作为培养基来分离与纯化天然环境中的藻毒素降解菌。通过该法分离与培养出的藻毒素降解菌在天然环境中具有良好的适应性，能持续且高效地降解藻毒素，适宜于多种水体的藻毒素去除，相关专利还未见报道导。

技术实现要素：

本发明提供一种获得可持续降解藻毒素的微生物的方法，具体的说，就是从受藻毒素污染的底泥中提取有效的成分，通过蒸发浓缩，作为培养基来富集、筛选、分离天然环境中的藻毒素降解菌。通过该法分离与培养出的藻毒素降解菌在天然环境中具有良好的适应性，能持续且高效地降解藻毒素。

上述获得可持续藻毒素降解菌的方法，其特征在于，藻毒素降解菌体来自受藻毒素污染的环境样品，可以是底泥或水样。

上述获得可持续藻毒素降解菌的方法，其特征在于，所用富集培养基来自受藻毒素污染的底泥。将底泥与灭菌蒸馏水按一定比例充分混合振荡，其范围可以为1％-20％，取上清液作为富集培养基。

上述获得可持续藻毒素降解菌的方法，其特征在于，藻毒素降解菌的富集过程中需定期定量向富集培养基中加入过滤灭菌的藻毒素进行。

上述获得可持续藻毒素降解菌的方法，其特征在于，藻毒素降解菌的分离培养基来自受藻毒素污染的底泥。将底泥与灭菌蒸馏水按一定比例充分混合振荡，其范围可以为1％-20％，在一定温度下旋转蒸发浓缩一定倍数，其范围可为5-20倍，用作分离培养基。

上述获得可持续藻毒素降解菌的方法，其特征在于，藻毒素降解菌的分离方法采用平板稀释法进行。在浓缩底泥固体培养基上涂布最后一次富集的菌液和经0.22μm滤膜灭菌的藻毒素。

上述获得可持续藻毒素降解菌的方法，其特征在于，上述藻毒素降解菌在初始菌落为1×10⁵-10×10⁶CFU/mL对太湖水中的藻毒素降解效率高达90％以上。

上述获得可持续藻毒素降解菌的方法，其特征在于，上述藻毒素降解菌在初始菌落为3.54×10⁶CFU/mL时，在太湖水中降解藻毒素的同时，能够自身增殖，培养18天后，生物量高达4.00×10¹²CFU/mL。

与现有技术相比，本发明提供了一种快速、简便的可持续降解藻毒素的微生物的培养方式，从藻毒素降解菌所生长的天然环境介质提取有效的成分，经蒸发浓缩，作为培养基来分离与纯化藻毒素降解菌。所得藻毒素降解菌在天然环境中具有可持续和高效的藻毒素降解效果，可适用于多种富营养化水体中藻毒素的去除。

附图说明

图1为通过天然培养基法所获得的藻毒素降解菌的SEM形态

图2为通过天然培养基法所获得的藻毒素降解菌对太湖水中藻毒素的降解效果

图3为通过天然培养基法所获得的藻毒素降解菌在太湖水中的增殖

图4为通过传统无机盐培养基方法获得的藻毒素降解菌对太湖水中藻毒素的降解效果

具体实施方式

下面通过实施例对本发明所述的技术及应用给予进一步详细的说明。该实施例以利用该技术去除富营养化水体中藻毒素的实例来说明该技术的作用效果。

实施例1藻毒素降解菌的SEM形态

用扫描电镜(SEM)观察分离的藻毒素降解菌的形态。流程为：(1)将天然培养基中培养2天的菌体在8000rpm离心5min，弃上清液，加入2.5％的戊二醛固定液，过夜；(2)固定：2.5％戊二醛清洗3h，磷酸缓冲液清洗3次，1％锇酸4h缓冲液清洗3次；(3)乙醇梯度脱水：用30％，50％，70％，85％，95％乙醇各清洗一次，100％乙醇2次，每次15min；(4)乙酸异戊酯置换2次，每次20min(每步均需离心，8000rpm，5min，弃上清，倒入下一种试剂，滴管来回吸几下，打散菌块)；(5)临界点干燥：普通定性滤纸裁成圆形纸条，将离心浓缩后的菌液滴入小纸包，放入临界点干燥器样品室，进行CO₂临界点干燥；(6)离子溅射金：将干燥后菌体粉末状纯菌体倒入平皿，碳导电胶带一面粘在盖玻片上，另一面倒扣轻压在菌体粉末上，翻正后用镊子将菌体轻轻刮薄铺平。离子溅射金后，即可进行扫描电镜观察(图1)。

实施例2通过天然培养基法所获得的藻毒素降解菌对太湖水中藻毒素的降解效果

将上述通过天然培养基获得的藻毒素降解菌以初始菌落为3.54×10⁶CFU/mL加入700mL太湖水中，其中含有浓度为207.6μg/mL的MC-RR和171.4μg/mL的MC-RR的藻毒素，该体系在25℃，黑暗条件下连续培养18天。每三天采样测定一次MC-RR和MC-LR的浓度，并加入与取样体积等量的含有藻毒素湖水。培养18天后，藻毒素MC-RR和MC-LR的降解率分别高达98.4％和96.3％(图2)。

实施例3通过天然培养基法所获得的藻毒素降解菌在太湖水中的增殖

将上述通过天然培养基获得的藻毒素降解菌以初始菌落为3.54×10⁶CFU/mL加入700mL太湖水中，其中含有浓度为207.6μg/mL的MC-RR和171.4μg/mL的MC-RR的藻毒素，该体系在25℃，黑暗条件下连续培养18天，每三天测定一次水体中藻毒素降解菌的数量。具体 方法为：取0.1mL水样，用灭菌蒸馏水稀释，选择稀释10^-3、10^-5、10^-7稀释倍数的悬浊液均匀涂布到添加了藻毒素的固体无机盐培养基上计数。培养18天后，藻毒素降解菌的数量高达4.00×10¹²CFU/mL(图3)。

实例4通过传统无机盐培养基方法获得的藻毒素降解菌对太湖水中藻毒素的降解效果

将传统无机盐培养基方法获得的藻毒素降解菌以初始菌落为3.54×10⁶CFU/mL加入700mL太湖水中，其中含有浓度为207.6μg/mL的MC-RR和171.4μg/mL的MC-RR的藻毒素，该体系在25℃，黑暗条件下连续培养18天。每三天采样测定一次MC-RR和MC-LR的浓度，并等量取样体积的含有藻毒素湖水。培养18天后，藻毒素MC-RR和MC-LR的降解率分别为53.7％和71.3％(图4)。