本发明涉及一种地衣芽胞杆菌的发酵培养基及发酵方法，属于微生态制剂
技术领域：
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背景技术：
：益生菌在发酵过程往往使用市场上提供的培养基成品，该成品大多为普通培养基，或者符合某一类型的细菌，没有办法针对某一株菌提供最优良的配方，导致活菌数较低，发酵成本高昂等问题。丰贵鹏，杨丽云，2009，公开了一种地衣芽孢杆菌发酵培养基，最佳配比为：玉米浆0.45g，蛋白胨1.50g，豆饼粉浸汁为1:50，葡萄糖1.50g。刘阳等，2012，公开了对地衣芽孢杆菌的培养基进行了优化，具体公开了素对活菌数影响的显著性次序为:MnSO4＞NaCl＞酵母粉＞蛋白胨，对芽孢数影响的显著性次序为:MnSO4＞蛋白胨＞NaCl＞酵母粉，培养基的最佳配比为:蛋白胨1.0％、酵母粉0.5％、NaCl1.0％、25％浓度的硫酸锰0.2％。宋浩等公开了一种地衣芽孢杆菌发酵培养基，配比为：玉米淀粉16.894g/L，黄豆饼粉10.131g/L，蛋白胨1.126g/L，葡萄糖2.413g/L，硫酸铵7.965g/L，磷酸氢二钾0.45g/L，硫酸镁0.45g/L，氯化钠4.5g/L。谢银堂等，2010，公开了地衣芽孢杆菌XY-2的培养基，培养基质量浓度配比为：玉米淀粉20g/L、豆饼粉90g/L、玉米浆7g/L。CN201310041566.4公开了一种促进地衣芽孢杆菌BL63516生长的发酵培养基，包括牛肉粉或牛肉膏、蛋白胨、麦芽糊精、低聚半乳糖、NaCl和水，所述蛋白胨为牛蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、鱼蛋白胨的一种或几种。然而，不同菌所需的培养基配比不同，造成培养基的成本高低，然而，目前的培养基还没有能兼顾发酵活菌数高，芽孢数高和低成本。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种地衣芽胞杆菌的发酵培养基及发酵方法，能使地衣芽胞杆菌发酵所得活菌数和芽孢数含量高。本发明提供的地衣芽孢杆菌培养基，其含有0.75％的酵母浸粉、1-1.5％的明胶、0.5％的CaCl2。在本发明一个实施方案中，所述培养基含有0.75％的酵母浸粉、1％的明胶、0.5％的CaCl2，用于提高芽孢数。在本发明另一个实施方案中，所述培养基含有0.75％的酵母浸粉、1.5％的明胶、0.5％的CaCl2，用于提高活菌数。其中，所述的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌CGMCCNo.8147。本发明中的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，其保藏号为CGMCCNo.8147，于2013年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，具有耐胃酸、耐肠液、耐胆盐、耐高温等抗逆性能和产酶等益生功能。本发明还提供一种地衣芽孢杆菌CGMCCNo.8147的发酵方法，将地衣芽孢杆菌CGMCCNo.8147的种子液按照1-2％的接种量接种到含有所述的发酵培养基的发酵罐中，温度35-40℃，转速60-150rpm，罐压0.04-0.06Mpa，通风比1：0.1-0.3，培养12-24h，得到活菌数为1×1010cfu/ml以上的发酵液。本发明提供一种地衣芽胞杆菌培养基，该培养基对基础培养基中碳源、氮源、无机盐进行优化，用于发酵地衣芽孢杆菌菌液中活菌数能达到1×1010CFU/g以上。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例地衣芽孢杆菌的培养基优化1)碳源的确定：分别用0.5％的酵母浸粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉替代LB培养基中的酵母粉作为碳源，其余成分不变，配好培养基进行灭菌，接种量2％，37℃培养20h，以平板菌落计数法进行计数，每个处理3个重复，取平均值，综合活菌数与芽孢数以确定最佳碳源。结果如表1所示，酵母浸粉作为碳源的培养基中活菌数及芽孢数都比其他碳源的结果高，故酵母浸粉为最佳碳源。表1不同碳源对地衣芽孢杆菌的活菌数及芽孢数的影响处理活菌数(CFU/mL)芽孢数(CFU/mL)葡萄糖1.18×1091.67×107酵母浸粉1.94×1092.37×107淀粉6.33×1088.57×106蔗糖6.47×1085.3×106麦芽糖5.13×1087.9×1062)氮源的确定：分别用1％的黄豆饼粉、牛肉膏、明胶、硝酸钾替代LB培养基中的蛋白胨作为氮源，其余成分不变，配好培养基进行灭菌，处理方法同1)碳源的确定。结果如表2所示，明胶作为氮源的培养基中活菌数及芽孢数都比其余氮源结果高，故确定明胶为最佳氮源。表2不同氮源对地衣芽孢杆菌的活菌数及芽孢数的影响处理活菌数(CFU/mL)芽孢数(CFU/mL)黄豆饼粉1.07×1081.62×105明胶3.77×1096.33×106牛肉膏3.51×1082.8×105硝酸钾2.17×1083.30×1053)无机盐的确定：分别用1％的NaCl、CaCl2、K2HPO4、MgSO4替代LB培养基中NaCl，其余成分不变，配好培养基进行灭菌，处理方法同1)碳源的确定。结果如表3所示，CaCl2作为无机盐的培养基中活菌数及芽孢数都优于NaCl、K2HPO4、MgSO4，故确定CaCl2为最佳无机盐。表3不同无机盐对地衣芽孢杆菌的活菌数及芽孢数的影响处理活菌数(CFU/mL)芽孢数(CFU/mL)K2HPO42.74×1095.43×107CaCl28.35×1094.73×108NaCl1.45×1096.62×107MgSO41.74×1091.23×1084)培养基成分含量的优化：将筛选出的最佳碳源按照0.25％、0.5％、0.75％，最佳氮源0.5％、1.0％、1.5％，最佳无机盐按照0.5％、1.0％、1.5％的添加量设计正交试验(L933)，按正交表配置培养基，灭菌，处理方法同1)碳源的确定。结果如表4所示，通过直观分析可得出实际最佳组合为：A3B2C1；通过极差分析，酵母浸粉、明胶、CaCl2的极值R1分别为32.74、23.62、28.08，所以从活菌数来看，各营养因素对发酵培养效果的影响大小顺序为：酵母浸粉>CaCl2>明胶；极值R2分别为30.28、18.98、50.94，所以从芽孢数来看，各营养因素对发酵培养效果的影响大小顺序为：CaCl2>酵母浸粉>明胶。以生物量为指标对A3B2C1和A3B3C1进行试验，最后确定最佳组合为A3B2C1，即最佳培养基为：0.75％酵母浸粉、1％明胶、0.5％CaCl2。表4正交设计方案及结果5)与LB培养基比较：按得到的最佳培养基配方配制液体培养基，分别接种2％的地衣芽孢杆菌菌液至最佳培养基和LB培养基中，处理方法同1)碳源的确定。结果如表5所示，优化后的最佳培养基活菌数达到2.85×1010CFU/mL，芽孢数为5.43×109CFU/mL，比LB的活菌数8.35×108CFU/mL和芽孢数4.73×106CFU/mL都要高。表5最佳培养基与LB培养基的培养效果比较培养基活菌数(CFU/mL)芽孢数(CFU/mL)最佳培养基2.85×10105.43×109LB培养基8.35×1084.73×1066)与现有的各种地衣芽孢杆菌培养基的比较：按得到的最佳培养基配方配制液体培养基，分别接种2％的地衣芽孢杆菌菌液至最佳培养基、培养基A、培养基B、培养基C及培养基D中，处理方法同1)碳源的确定。培养基A：玉米浆0.45g，蛋白胨1.50g，豆饼粉浸汁为1:50，葡萄糖1.50g；培养基B：蛋白胨1.0％、酵母粉0.5％、NaCl1.0％、25％浓度的硫酸锰0.2％；培养基C：玉米淀粉16.894g/L，黄豆饼粉10.131g/L，蛋白胨1.126g/L，葡萄糖2.413g/L，硫酸铵7.965g/L，磷酸氢二钾0.45g/L，硫酸镁0.45g/L，氯化钠4.5g/L；培养基D：玉米淀粉20g/L、豆饼粉90g/L、玉米浆7g/L。结果如表6所示，优化后的最佳培养基活菌数达到2.26×1010CFU/mL，芽孢数为5.27×109CFU/mL，比目前公开的优化培养基发酵后的活菌数和芽孢数都要高。表6最佳培养基与各优化培养基的培养效果比较培养基活菌数(CFU/mL)芽孢数(CFU/mL)本发明培养基2.26×10105.27×109培养基A6.55×1093.73×107培养基B9.96×1088.85×106培养基C7.63×1093.68×107培养基D2.25×1084.95×106当前第1页1 2 3