一种测定Phi29DNA聚合酶活性的方法和滚环测序方法与流程

文档序号:12577720阅读:来源:国知局

技术特征:

1. 一种测定Phi29 DNA聚合酶活性的方法,其特征在于,所述方法包括:以环状单链DNA为模板,在扩增引物的存在下,以所述Phi29 DNA聚合酶引发滚环复制,产生大量连续的单链DNA拷贝;然后将荧光分子掺入扩增产物,通过检测扩增产物的荧光信号来定量所产生的单链DNA拷贝数量,从而计算出所述Phi29 DNA聚合酶的活性。

2. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法首先采用标准Phi29 DNA聚合酶引发滚环复制并绘制所产生的单链DNA拷贝数量与标准Phi29 DNA聚合酶活性的标准曲线,然后检测相同条件下待测Phi29 DNA聚合酶引发滚环复制所产生的单链DNA拷贝数量,并根据所述标准曲线计算出所述待测Phi29 DNA聚合酶的活性。

3. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述荧光分子为能够掺入单链DNA的荧光染料;优选为Qubit ssDNA 分析试剂。

4. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述荧光分子为荧光修饰的dNTP;所述将荧光分子掺入扩增产物具体为:在所述扩增产物上结合上测序引物,然后加入所述荧光修饰的dNTP,在聚合酶的作用下,沿所述单链DNA拷贝模板延伸。

5. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述环状单链DNA为M13噬菌体单链DNA。

6. 根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述扩增引物为5’-aagccatccgcaaaaatgacctct-3’。

7. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述Phi29 DNA聚合酶的聚合活性以U/μL为单位表示。

8. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述Phi29 DNA聚合酶引发滚环复制的反应时间为10min~1h;优选为30min。

9. 一种滚环测序方法,其特征在于,利用权利要求1所述的扩增产物,将所述荧光分子掺入扩增产物,具体步骤为:在所述扩增产物上结合上机测序引物,然后加入所述荧光分子,在聚合酶的作用下,沿所述单链DNA拷贝模板延伸,通过不同的荧光信号来确定扩增产物序列。

10. 根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述荧光分子为荧光修饰的dNTP。

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