一种用于检测C-KIT基因突变的引物、探针及试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种用于检测C-KIT基因突变的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术：

C-KIT是一种原癌基因，位于染色体4q11-12，全长约80kb。C-KIT编码的C-KIT蛋白属于III型受体酪氨酸激酶家族成员，它是分子量约为145KD的跨膜蛋白，包含了胞内的酪氨酸激酶区、跨膜区和配体结合位点胞外区。当配体与其结合后能激活自身酪氨酸蛋白激酶活性，通过一系列反应激活下游信号转导通路，从而调节细胞的生长与增殖。

胃肠道间质瘤(GIST)是消化道最常见的间叶源性肿瘤。研究表明，在GIST患者中C-KIT基因突变率约为90％。

目前Sanger测序法是C-KIT基因突变检测的主要方法。然而，该方法的灵敏度低，会导致漏检及假阴性的发生，而且检测时间长，无法满足临床检测的实际需求。临床上迫切需要开发一种高灵敏度、快速的C-KIT基因突变检测技术。

本发明的发明人在胃肠道间质瘤(GIST)的日常检测中发现了与胃肠道间质瘤有关的位于C-KIT基因的新突变位点，即1672-1713位缺失突变。本发明的发明人针对该突变开发了一种快速、高灵敏、操作简便的检测试剂盒及相关的检测方法，可以用于GIST化疗预后。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于检测C-KIT基因突变的引物和探针，所述突变是1672-1713位缺失42碱基突变(1672_1713 del 42，K558_I571 del)。本发明的引物与探针包括如下序列：

正向引物(F)：AAGTACAGTGGGACCCAA(SEQ ID No：1)

反向引物(R)：GACCAAAACTCAGCCTGT(SEQ ID No：2)

探针(PB)：TCTGGGAAACTCCCATTTGTGATCA(SEQ ID No：3)

本发明另一方面提供一种用于检测C-KIT基因突变的检测试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.2所示的引物和SEQ ID No.3所示的探针。

根据所采用的PCR方法，本发明的试剂盒还可以包括内参基因和内控基因。

本发明另一方面提供一种用于检测C-KIT基因突变方法，其包括以下步骤：

(1)针对C-KIT的突变位点，设计特异性引物和探针；

(2)提取检测样本中基因组DNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织、全血和血浆等；

(3)建立实时荧光PCR扩增反应体系；

(4)根据荧光PCR仪显示的Ct值判断检测结果：检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴性、阳性判定标准，Ct值>38或无扩增为阴性，Ct值≤38为阳性。

本发明采用了特异性引物和探针技术，可以特异性检测C-KIT基因突变。此方法灵敏度高、特异性强、检测速度快。

附图说明

图1为检测阴性样本的PCR图。

图2为检测突变阳性样本的PCR图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域技术人员熟知的常规条件，或者按照制造厂商建议的条件。

一.原理

本发明的特异性引物与探针同DNA模板结合后，Taq DNA聚合酶以脱氧核苷酸(dNTP)为底物，对内参基因(Internal Reference，IR)及C-KIT基因突变型基因进行体外扩增。检测采用荧光PCR技术，通过 特异性探针水解释放荧光，监测PCR反应的进行，确定C-KIT基因突变情况。

本发明的试剂盒单独设置了内参基因检测体系。内参基因是区别于待检C-KIT基因的管家基因。通过检测内参基因的扩增情况(FAM通道)，可分析待检DNA是否能被正常扩增，从而排除DNA纯度、浓度不佳，或者含有PCR抑制剂等造成PCR检测失败的情况。

本发明的试剂盒在C-KIT基因突变型检测体系中同时设置了内控基因(Internal Control，IC)检测体系。两种体系在同一PCR管中同时进行反应。内控基因也是区别于待检基因C-KIT的管家基因。将识别C-KIT基因突变模板的探针修饰为FAM荧光基团，而将识别内控基因模板的探针修饰为HEX荧光基团。通过检测内控基因扩增情况(HEX通道)，可分析待检DNA是否能被正常扩增，从而排除漏加试剂或样本、样本含有PCR抑制剂等造成PCR检测失败的情况。

进行本试剂盒检测结果判定时，阴性质控品(NC)中FAM、HEX通道检测均应无扩增(不呈典型的S型曲线。注：典型的S型曲线依次表现为指数期、直线期及平台期)或无Ct值，阳性质控品(PC)中FAM、HEX通道检测均应有扩增(呈典型的S型曲线)且Ct值≤28；否则认为实验无效，需重复实验。

二.实验材料和设备

1.针对突变位点设计合成特异性引物和探针

针对C-KIT基因突变位点设计特异引物和探针。通过特异性引物和探针优化，以便实现高灵敏和快速检测。

优化后的引物与探针如下：

正向引物(F)：AAGTACAGTGGGACCCAA(SEQ ID No：1)

反向引物(R)：GACCAAAACTCAGCCTGT(SEQ ID No：2)

探针(PB)：FAM-TCTGGGAAACTCCCATTTGTGATCA-BHQ-1(SEQ ID No：3，含荧光标记)

2.检测样本处理与DNA的提取

检测样本可以是新鲜病理组织、石蜡包埋组织、全血、血浆和腹腔积液。以下仅以石蜡包埋组织样本为例进行说明。

在样本采集之前，病人未经过酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)类药物治疗；由于DNA样品质量会影响检测结果，因此应确定DNA样品来源的石蜡包埋组织样本中含有癌组织细胞，并且不少于整个样本的25％；且DNA样品OD260/OD280＝1.8±0.2，0D260/OD230≥1.7；浓度为5-10ng/μl。

石蜡包埋组织样本在室温下保存时限不超过12个月，提取后的DNA样品在-20℃冷冻条件下保存时限不超过6个月。

3.适用仪器

Stratagene Mx3000P。

4.试剂盒的组成

试剂盒组成见表1。试剂盒中不含核酸提取成份，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen公司生产，货号：56404)试剂盒完成石蜡包埋组织样本DNA提取。检测试剂组成及C-KIT基因待检突变位点见表2。IR检测试剂只含内参基因检测体系(FAM通道)，C-KIT检测试剂同时含有C-KIT基因突变检测体系(FAM通道)及内控基因检测体系(HEX通道)。

表1：试剂盒组成

其中所述内参基因和内控基因的具体序列可以由本领域技术人员 根据实验情况容易地确定。

三.检测方法

1.使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen公司生产)试剂盒，按照使用说明书进行石蜡包埋组织样本DNA提取。

2.取试剂盒中的检测试剂以及阳性质控品(PC)。待检测试剂及阳性质控品PC融化后短暂离心，置于冰上。

3.按17∶0.3的体积比例混合IR检测试剂和Taq DNA聚合酶，按17∶0.3的体积比例混合C-KIT检测试剂和Taq DNA聚合酶。按17.3/孔分装IR检测试剂和C-KIT检测试剂至八连管中。向装有IR检测试剂和C-KIT检测试剂的八连管中分别加入2.7μl待检DNA样品、阴性质控品(NC，溶解DNA的缓冲液，由使用者自备)及阳性质控品PC，吹打混匀，盖紧管盖后短暂离心。注意：混匀时不要使用漩涡振荡仪；混匀后立即进行后续操作。

4.荧光PCR仪检测通道设定需同时选择FAM、HEX通道(参比染料设置为“无”)。反应程序设置如下(表2)：

表2：

四.检测结果的解释

1.Ct值确定：首先设定Stratagene MX3000P荧光PCR仪的基线：选择“适合基线(Adaptive baseline)”设定时的荧光信号，阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品NC扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，即令阴性质控品NC扩增曲线显示“No Ct”为准。从软件中读取各样本在各位点检测的Ct值。

2.定性分析：

(1)实验质量评判：若NC中FAM、HEX通道检测均无扩增(不呈典型的S型曲线。注：典型的S型曲线依次表现为指数期、直线期及 平台期)或无Ct值，PC中FAM、HEX通道检测均有扩增(呈典型的S型曲线)且Ct值≤28，则可继续分析；否则认为实验无效，需重复实验。

(2)待检DNA样品中内参基因(IR)检测情况评判：若内参基因检测(FAM通道)有扩增且19≤Ct值≤25，则可继续分析；若其Ct值较小，则认为DNA样品浓度过高；若其Ct值较大或无扩增，则认为DNA样品浓度过低、发生降解，或其中可能含有PCR抑制剂。

(3)待检DNA样品中内控基因检测情况评判：若内控基因检测(HEX通道)有扩增且Ct值≤25，则可继续分析；若内控基因检测(HEX通道)Ct值较大或无扩增，但突变位点检测(FAM通道)有扩增且Ct值≤38，则可继续分析(可能由于突变位点扩增对内控基因扩增产生抑制)；若内控基因检测(HEX通道)Ct值较大或无扩增，而突变位点检测(FAM通道)无扩增或有扩增但Ct值>38，则无法继续分析，需重复实验(可能由于DNA样品发生降解、其中含有PCR抑制剂或未加样品)。

(4)待检DNA样品中基因突变情况评判：若样品中某突变位点检测(FAM通道)有扩增且Ct值≤38，则判定该样本突变结果为阳性；若Ct值>38或无扩增，则判定该样本突变结果为阴性。

注意：同一DNA样品中可能同时存在多种突变。

图1为检测结果为阴性的样本的PCR图，图2为检测结果为阳性的样本的PCR图。

通过对比检测，证实本发明的荧光PCR方法和传统测序方法的结果是相符的，而本发明的荧光PCR方法的灵敏度和选择性高于传统测序方法。

因此，本发明荧光PCR反应体系可检测C-KIT基因1672-1713位缺失42碱基突变，检测方便快捷，准确性高，可满足C-KIT基因突变快速检测的要求。