毕赤酵母内源信号肽及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，本发明涉及毕赤酵母内源信号肽及其应用。
背景技术：
：毕赤酵母是一种重要的低等真核表达系统，在本领域中常被应用于重组表达蛋白，特别是对于重组蛋白的分泌表达具有重要作用。目前，已有一系列有活性的蛋白在毕赤酵母中被成功表达，作为真核表达系统，毕赤酵母表达系统可以对表达的蛋白质进行加工折叠和修饰。并且，毕赤酵母表达还具有培养简单廉价，外源蛋白质既可以胞内积累又可分泌，易于表达产物纯化等优点。大多数分泌蛋白都需要N-端信号序列来介导它们在内膜系统中的转运。毕赤酵母中重组蛋白的分泌通常由N-端信号肽介导。目前毕赤酵母中应用最广泛的信号肽是来自于酿酒酵母的的α-交配因子前导肽序列(αfactor)，但是α-factor对于很多蛋白的分泌效果并不十分理想。因此，本领域还需要筛选分泌效果好的信号肽，从而有助于分泌蛋白在毕赤酵母中的有效表达。技术实现要素：本发明的目的在于提供毕赤酵母内源信号肽及其应用。在本发明的第一方面，提供一种毕赤酵母内源信号肽文库，所述的信号肽文库包括SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和/或SEQIDNO:8所示氨基酸序列的信号肽。在一个优选例中，所述的信号肽具有不同强度的引导目的多肽分泌表达的能力。在本发明的另一方面，提供一种毕赤酵母内源信号肽编码核酸的文库，该 文库包括：编码SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和/或SEQIDNO:8所示氨基酸序列的信号肽的核酸。在一个优选例中，所述的毕赤酵母内源信号肽编码核酸的文库中，所述的编码SEQIDNO:2所示氨基酸序列的信号肽的核酸的序列如SEQIDNO:1；所述的编码SEQIDNO:4所示氨基酸序列的信号肽的核酸的序列如SEQIDNO:3；所述的编码SEQIDNO:6所示氨基酸序列的信号肽的核酸的序列如SEQIDNO:5；所述的编码SEQIDNO:8所示氨基酸序列的信号肽的核酸的序列如SEQIDNO:7。在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有编码信号肽的序列，所述的信号肽选自所述的毕赤酵母内源信号肽文库。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞含有所述的载体；较佳地，所述的细胞是毕赤酵母(PichiaPastoris)细胞。在本发明的另一方面，提供所述的毕赤酵母内源信号肽文库的用途，用于提供信号肽，将所述信号肽的编码序列可操作性地与目的多肽的编码基因序列连接，促进目的多肽的分泌型表达。在本发明的另一方面，提供分离的毕赤酵母内源信号肽，所述的毕赤酵母内源信号肽选自：氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的信号肽；氨基酸序列如SEQIDNO:4所示的信号肽；氨基酸序列如SEQIDNO:6所示的信号肽；氨基酸序列如SEQIDNO:8所示的信号肽。在本发明的另一方面，提供分离的核酸，该核酸编码所述的毕赤酵母内源信号肽；较佳地，所述的核酸选自：核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的信号肽；核苷酸序列如SEQIDNO:3所示的信号肽；核苷酸序列如SEQIDNO:5所示的信号肽；核苷酸序列如SEQIDNO:7所示的信号肽。在本发明的另一方面，提供一种载体或宿主细胞，所述的载体或宿主细胞含有编码信号肽的序列，所述的信号肽选自：氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的信号肽；氨基酸序列如SEQIDNO:4所示的信号肽；氨基酸序列如SEQIDNO:6所示的信号肽；氨基酸序列如SEQIDNO:8所示的信号肽。在本发明的另一方面，提供一种可分泌型表达目的多肽的融合基因，所述的融合基因包括：选自所述的毕赤酵母内源信号肽文库中的至少一条信号肽的编码基因，以及与之操作性连接的编码目的多肽的基因；较佳地，所述信号肽的编码基因位于5’端。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、含有不同信号肽的EGFP表达质粒构建过程。图2、两次PCR扩增带有GAS1’片段的egfp基因。Lane1：以GASF1/EGFPR为引物的第一轮PCR产物(760bp)；Lane2：以GASF2/EGFPR为引物的第二轮PCR产物(780bp)；M：MarkerDL5000。图3、酶切验证质粒pG1GASg。Lane1：以AflIIandHindIII双酶切pG1GASg(0.7kb与6.9kb)；Lane2-3：AflII单酶切pG1GASg(7.6kb)；Lane4-5：未经酶切的pG1GASg质粒；M：DL15000。图4、质粒pG1DSEg、pG1MSBg、pG1FREg与pG1DANg的PCR验证。Lane1：以pG1DSEg为模板，DSEV/EGFPR为引物扩增得到790bp的片段；Lane2：以pG1MSBg为模板，MSBV/EGFPR为引物扩增得到750bp的片段；Lane3：以pG1FREg为模板，FREV/EGFPR为引物扩增得到750bp 的片段；Lane4：以pG1DANg为模板，DANV/EGFPR为引物扩增得到770bp的片段；M：DL2000。图5、α-MF信号肽序列的PCR扩增(左)与重组质粒pG1MFg的PCR验证(右)。图6、含有不同信号肽的β-Gal表达质粒的构建过程。图7、pG1HLA质粒构建中的连接产物验证。Lane1：用引物G1LF/G1LR扩增lacZ基因前800bp；Lane2：用引物NotI与ClaI双酶切质粒pG1HL(得到9.1kb与0.8kb两条带)。图8、双酶切验证pG1HLA。Lane1：用AflII与HindIII双酶切质粒pG1HL(产物条带大小9.9kb)；Lane2：用AflII与HindIII双酶切质粒pG1HLA(得到两条带，大小分别为6.9kb与3kb)；M:DL15000。图9、重组质粒pG1GASL、pG1DANL、pG1DSEL、pG1MSBL、pG1FREL与pG1MFL的酶切验证。Lane1：用ClaI与HindIII双酶切质粒pG1GASL(得到大小分别为7.7kb与2.2kb的两条带)；Lane2：用ClaI与HindIII双酶切质粒pG1GASg(产物大小7.6kb)；Lane3：用ClaI与HindIII双酶切质粒pG1DANL(得到大小分别为7.7kb与2.2kb的两条带)；Lane4：用ClaI与HindIII双酶切质粒pG1DANg(产物大小7.6kb)；Lane5：用ClaI与HindIII双酶切质粒pG1DSEL(得到大小分别为7.7kb与2.2kb的两条带)；Lane6：用ClaI与HindIII双酶切质粒pG1DSEg(产物大小7.6kb)；Lane7：用ClaI与HindIII双酶切质粒pG1MSBL(得到大小分别为7.7kb与2.2kb的两条带)；Lane8：用ClaI与HindIII双酶切质粒pG1MSBg(产物大小7.6kb)；Lane9：用AflII与HindIII双酶切质粒pG1FREL(得到大小分别为6.9kb与3kb的两条带)；Lane10：用AflII与HindIII双酶切质粒pG1MFL(得到大小分别为7.1kb与3kb的两条带)；M：DL15000。图10、重组毕赤酵母菌的PCR验证。Lane1：以G/MFL为模板，以MFF/G1LR为引物扩增出1.1kb大小的片段；Lane2：以G/DSEL为模板，以DSEV/G1LR为引物扩增出900bp的片段；Lane3：以G/GASL为模板，以GASV/G1LR为引物扩增出900bp的片段；Lane4：以G/DANL为模板，DANV/G1LR为引物扩增出900bp的片段；Lane5：以G/MSBL为模板，MSBV/G1LR为引物扩增出900bp的片段；Lane6：以G/FREL为模板，FREV/G1LR为引物扩增出900bp片段；M：DL15000。图11、不同信号肽介导β-gal表达菌株的胞内(A)外(B)酶活。图12、EGFP表达重组毕赤酵母菌的PCR验证。Lane1：以G/MFg菌体为模板，MFF/EGFPR为引物扩增得到1kb大小的片段；Lane2：以MSBV/EGFPR为引物扩增得到750bp的片段；Lane3：以G/FREg为模板，FREV/EGFPR为引物扩增得到750bp的片段；M：DL15000。图13、不同信号肽介导EGFP分泌表达水平比较。图14、荧光显微镜观测各菌株EGFP表达。具体实施方式本发明人通过对酵母内源基因的筛选，揭示了一系列毕赤酵母内源信号肽，这些信号肽可实现指导目的基因的分泌表达。本发明的信号肽可分离地存在；或可被构建为一个文库，使得人们能从中选用适合的信号肽。术语如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，所述的“可操作地连接”或“操作性相连”是指两个或多个 核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：信号肽核酸序列被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得所表达的蛋白受到信号肽的引导，从而，信号肽核酸被“可操作地连接”到该目的基因核酸序列上。如本文所用，“目的基因”是指可由本发明的信号肽引导而分泌表达的基因。本发明对合适的目的基因没有特别的限制，例如包括但不限于：结构基因、编码具有特定功能的蛋白的基因、酶、报告基因(如绿色荧光蛋白、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因LacZ)。如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果信号肽核酸序列与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则信号肽核酸序列对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。信号肽本发明人经过大量的筛选和研究，获得了一组毕赤酵母内源信号肽包括：(1)MSB2信号肽核苷酸序列(SEQIDNO:1)：ATGATTAATTTAAACTCCTTTCTTATACTTACAGTAACACTGTTATCTCCAGCTTTGGCA氨基酸序列(SEQIDNO:2)：MINLNSFLILTVTLLSPALA(2)FRE2信号肽核苷酸序列(SEQIDNO:3)：ATGAGAAACCACCTAAATGATCTAGTGGTATTGTTTTTGCTTCTCACAGTAGCAGCTCAGGCC氨基酸序列(SEQIDNO:4)：MRNHLNDLVVLFLLLTVAAQA(3)GAS1’信号肽核苷酸序列(SEQIDNO:5)：ATGTTGTCCATTTTAAGTGCATTAACTCTGCTGGGCCTGTCTTGTGCT氨基酸序列(SEQIDNO:6)：MLSILSALTLLGLSCA(4)DAN4信号肽核苷酸序列(SEQIDNO:7)：ATGTTCCTCAAAAGTCTCCTTAGTTTTGCGTCTATCCTAACGCTTTGCAAGGCC氨基酸序列(SEQIDNO:8)：MFLKSLLSFASILTLCKA上述的信号肽可指导目的基因以不同的强度进行分泌表达。上述信号肽的变异形式也可被包含在本发明中。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-5个，较佳地1-3个，更佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(如1-5个，较佳地1-3个，更佳地1-2个)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还涉及编码本发明的信号肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO:1、3、5或7所示的编码序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO:2、4、6或8的信号肽，但与SEQIDNO:1、3、5或7所示的编码序列有差别的核酸序列。“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。所述的信号肽可以构成一个文库，从而有利于本领域技术人员从中选择合适的信号肽来引导目的基因以适合的强度进行分泌表达。本发明的信号肽的编码序列可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于信号肽的编码序列而言可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(如一种结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些具有重要特性或功能的蛋白。例如，当用于分泌表达的研究时，所述的目的基因包括但不限于：绿色荧光蛋白、增效的绿色荧光蛋白、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因LacZ等。“绿色荧光蛋白”具有内源荧光基团，在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光，且见光不易淬灭。“增效的绿色荧光蛋白”为对绿色荧光蛋白进行改进后的蛋白。“荧光素酶”作为一种代表性的指示基因表达状况的工具，可良好地指示由信号肽引导的基因表达情况。质粒和细胞作为本发明的优选方式，可以从本发明的信号肽文库中选择不同的信号 肽，分别将它们的编码序列与待研究的目的基因可操作地连接，或将目的基因与所述的信号肽编码序列可操作的连接入合适的载体中，采取适当的方式导入到宿主细胞内，从而获得可分泌表达目的蛋白的宿主细胞。来自于本发明的信号肽文库的任何一种信号肽的编码序列和/或目的基因序列可被包含在重组载体中。作为一种方式，所述的重组载体包括本发明的信号肽的编码序列，在所述信号肽的编码序列的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与信号肽编码序列可操作地连接。作为一种方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：引导目的基因分泌表达的信号肽的编码序列，和目的基因序列。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子等。用于制备重组载体的方法是本领域技术人员所熟知的。术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。优选的，所述的表达载体是酵母细胞适用的表达载体。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的信号肽编码序列和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。包含上述适当的信号肽编码序列和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：酵母，大肠杆菌，动物的组织细胞，植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。作为本发明的优选方式，所述的宿主细胞是酵母细胞，更优选地，所述的宿主细胞是毕赤酵母细胞。融合肽或融合基因本发明还提供一种可分泌型表达的多肽，所述的多肽包括：选自所述的毕赤酵母内源信号肽文库中的至少一条信号肽，以及与之操作性连接的目的多肽。本发明还包括编码该融合肽的融合基因。信号肽在翻译后加工的过程中可被毕赤酵母细胞内的酶在切割位点处剪切掉，使成熟蛋白分泌到细胞外。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。1.材料与方法下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。1.1信号肽编码序列MSB2(SEQIDNO:1)：ATGATTAATTTAAACTCCTTTCTTATACTTACAGTAACACTGTTATCTCCAGCTTTGGCAFRE2(SEQIDNO:3)：ATGAGAAACCACCTAAATGATCTAGTGGTATTGTTTTTGCTTCTCACAGTAGCAGCTCAGGCCGAS1’(SEQIDNO:5)：ATGTTGTCCATTTTAAGTGCATTAACTCTGCTGGGCCTGTCTTGTGCTDAN4(SEQIDNO:7)：ATGTTCCTCAAAAGTCTCCTTAGTTTTGCGTCTATCCTAACGCTTTGCAAGGCCDSE4(SEQIDNO:9)：ATGTCATTCTCTTCCAACGTGCCACAACTTTTCTTGTTGTTGGTTCTGTTGACCAATATAGTCAGTGGAα-MF(SEQIDNO:10)：ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACGTA1.2菌株与质粒菌株：大肠杆菌(E.coli)DH5α。表1、质粒表2、菌株1.3引物表3、引物列表*限制性酶切点以下划线显示；**限制性位点的粘性末端以粗黑体显示。1.4酶与试剂所用pfuDNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司。所用限制性内切酶与T4连接酶，琼脂糖凝胶电泳及SDS-PAGE上样缓冲液与分子量标准购自宝生物工程(大连)有限公司。DNA抽提试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司。表4、实验试剂试剂来源Tryptone购自Oxoid公司Peptone购自BD公司YeastExtract购自Oxoid公司YNB购自Oxiod公司X-Gal购自Amresco公司Zeocin购自Invitrogen公司氨苄青霉素购自上海生工生物工程有限公司生物素购自上海生工生物工程有限公司Agarose购自BiowestZeocin购自Invitrogen公司β-巯基乙醇购自Sigma-Aldrich公司溴化乙锭购自Sigma-Aldrich公司ONPG购自上海生工生物工程有限公司7-氨基头孢烷酸购自Sigma-Aldrich公司头孢菌素C购自Sigma-Aldrich公司对二甲氨基苯甲醛购自上海生工生物工程有限公司其他常规试剂国产分析纯试剂1.5培养基所用培养基的溶剂均为去离子水。LB液体培养基(1L)：10gNaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨。LB固体培养基(1L)：1L液体LB培养基加15g琼脂。YPD液体培养基(1L)：20g葡萄糖，10g酵母提取物，20g胰蛋白胨。YPD固体培养基(1L)：1L液体YPD培养基加15g琼脂。MD固体培养基(1L)：13.4g酵母基本氮源(YNB)，20g葡萄糖，500×生物素2ml，1.5g琼脂。BMGT液体培养基(1L)：20g胰蛋白胨，13.4gYNB，10g甘油，10×K2HPO4/KH2PO4缓冲液(1M，pH6.0)100ml，500×生物素2ml。1.6信号肽指导EGFP分泌表达的载体的构建以G1启动子调控的，含有Zeocin抗性基因及HIS4基因的质粒pG1HL为出发质粒，在PG1下游的NotI与HindIII位点之间插入N-端带有信号肽GAS1’编码序列的egfp基因(egfp基因序列见GenBank登录号EU093099.1中第5616-6332位的反向互补序列)，构建含有内源信号肽GAS1’编码序列的EGFP表达载体pG1GASg。利用NotI与AflII酶切位点把GAS1’信号序列替换为其他信号序列即构建为对应的EGFP表达载体，见图1。设计正向引物GASF1(含有GAS1’后半段序列及AflII酶切位点)与GASF2(含有NotI酶切位点及GAS1’前半段序列)，反向引物EGFPR(含有HindIII酶切位点)。以含有egfp基因的pGHg质粒为模板，分别用引物对GASF1/EGFPR与GASF2/EGFPR分两次扩增egfp基因，使其前端加上GAS1’信号肽编码序列与AflII酶切位点(780bp左右片段，见图2)。扩增产物通过NotI/HindIII双酶切后，连入载体pG1HL中取代lacZ基因。连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞。涂布于含有Zeocin抗生素的LB 平板上，挑取阳性转化子扩增质粒，用AflII与HindIII进行单、双酶切验证(见图3)，并经测序进一步验证，获得表达GAS1’为信号肽的质粒pG1GASg。将合成的DAN4正向序列DAN4S与反向序列DAN4A退火，得到两端分别含有NotI与AflII粘性末端的DAN4片段，经双酶切替换pG1GASg载体NotI与AflII酶切位点之间的GAS1’信号肽编码序列，获得表达载体pG1DANg。质粒pG1DSEg、pG1MSBg与pG1FREg的构建方法与pG1DANg相同，只需将对应的含有粘性末端的信号肽序列插入载体的NotI与AflII酶切位点之间即可。构建好的质粒经PCR验证(见图4)及测序验证正确后，保存备用。以含有α-MF的质粒pPIC9k为模板，用引物MFF/MFR扩增α-MF信号肽序列，见图5(左)，产物约270bp。扩增产物经NotI与AflII双酶切后，与经过NotI与AflII双酶切的载体pG1GASg连接，获得含α-MF信号肽的表达载体pG1MFg。以菌液为模板，用引物MFF/EGFPR进行PCR验证，目标产物大小为1kb(见图5(右))。阳性质粒经测序验证正确后保存。1.7β-半乳糖苷酶为报告蛋白的信号肽载体构建为了考察所选内源信号肽对异源蛋白的分泌效果，以β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)基因(lacZ)(lacZ基因来自大肠杆菌基因组，GenBank登录号CP011322.1)为报告基因来考察候选信号肽对分子量较大异源蛋白的分泌表达水平。为了构建含有不同信号肽的β-Gal表达载体，可用lacZ基因替换对应EGFP表达载体中的egfp基因。为此，需先在pG1HL中引入酶切位点AflII，构建质粒pG1HLA，构建过程见图6。以含有lacZ基因的质粒pG1HL为模板，用引物对G1LF/G1LR扩增lacZ基因前800bp(至ClaI酶切位点处)，在其前端NotI位点后引入AflII限制酶切位点，以便于信号肽序列的插入，连接产物的验证见图7。PCR产物用NotI与ClaI双酶切后，与同样经过NotI与ClaI双酶切的载体pG1HL大片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α。转化子提取质粒后，用新引入的酶切位点AflII与原有酶切位点ClaI进行双酶切验证。由图8可见，由于对照质粒pG1HL无AflII位点，经AflII与HindIII双酶切后只有一条带，而引入了AflII位点的质粒pG1HLA经AflII 与HindIII双酶切后得到对应大小的两条带。质粒pG1HLA经过测序验证正确后，保存备用。将质粒pG1HLA用AflII与HindIII双酶切，回收lacZ片段(3kb)。将含有不同信号肽的EGFP表达载体用AflII与HindIII双酶切后，回收载体大片段(6.9kb)。将含有AflII与HindIII粘性末端的lacZ片段与对应的含有信号肽的载体相连，得到含有对应信号肽的β-gal表达质粒，见图6构建流程图。重组质粒经ClaI与HindIII双酶切验证后(图9)，挑选测序正确的质粒保存。实施例1、β-半乳糖苷酶为报告基因的信号肽在毕赤酵母中的指导表达及分泌效果检测将经过测序验证正确的质粒pG1MFL、pG1DSEL、pG1GASL、pG1DANL、pG1MSBL与pG1FREL分别用限制性内切酶SalI进行线性化。酶切产物纯化以后电转化至预先制备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中。在不含有机氮源的MD平板上筛选阳性转化子，进行PCR(图10)和测序验证后，获得相应的重组菌株。以所构建的β-半乳糖苷酶为报告基因的信号肽在毕赤酵母中表达，以YPD为培养基考察含有不同信号肽的各β-gal表达菌株的胞内外酶活。由图11可见，含有内源信号肽的各菌株的胞内与胞外酶活均高于以α-MF为信号肽的G/MFL。其中，以GAS1’为信号肽的菌株G/GASL胞内外酶活均最高，为5700U/mL，说明此信号肽利于所介导蛋白的表达。G/DANL的胞内酶活仅次于G/GASL，说明DAN4信号肽介导β-gal的胞内表达水平均较高，但其分泌效果不佳。而菌株G/MSBL的胞外酶活仅次于G/GASL，且其胞内酶活水平也远远高于对照菌株G/MFL与G/DSEL。以α-MF为信号肽的菌株对β-gal的总体表达水平非常低，说明α-MF不适合在所构建的表达系统中介导β-gal的表达。而G/DANL、G/GASL与G/MSBL的表达水平比较高，单位体积酶活在1000U/mL；且这三株菌的分泌水平也较高。以α-MF介导的蛋白分泌量为对照，分析DAN4、GAS1’、FRE2与MSB2四种信号肽介导β-Gal在表达上清中的相对分泌水平的分泌效果。由表5可见，DAN4、GAS1’、FRE2与MSB2四种信号肽对β-Gal都有很好的分泌效果。表5、各信号肽对β-Gal的相对分泌水平*α-MF介导蛋白的分泌水平均设为1。实施例2、EGFP在毕赤酵母中的表达及分泌效果检测将构建好的质粒pG1MSBg、pG1FREg或pG1MFg分别用限制酶SalI线性化，纯化后，通过电转化的方法转入毕赤酵母GS115感受态细胞中，以整合到其基因组上。利用宿主菌GS115的组氨酸缺陷型特征，在不含有机氮源的MD基本培养基平板上筛选重组菌，经PCR验证(图12)，获得相应的重组菌G/MSBg、G/FREg与G/MFg。以所构建的EGFP为报告基因的信号肽在毕赤酵母中表达，挑取含有不同信号肽的EGFP表达菌株的单菌落，于2mLYPD试管中，30℃，200rpm振荡过夜。吸取YPD试管中的菌液500μL，至含有25mLBMGT培养基的250mL摇瓶中培养。30℃，200rpm培养24h后取样分别测定培养基上清和菌体的荧光强度。吸取上清50μL，于96孔透明酶标板中，加入150μLEGFPRefoldingbuffer，混匀。菌体离心，去上清，用所取发酵液四倍体积的Refoldingbuffer稀释，混匀，吸取200μL于96孔透明酶标板的检测孔中。在荧光酶标仪中，于激发波长485nm，发射波长535nm检测样品的荧光值，结果见图13。由图13可见，含有信号肽的EGFP重组菌株胞内外荧光值均高于对照菌GS115。MSB2与FRE2两种内源信号肽介导的EFGP分泌均高于α-MF，胞外荧光值最高的则是以MSB2为信号肽的重组菌G/MSBg。由图14可见，与荧光酶标仪的检测结果一致。对照菌GS115没有荧光。菌株G/MFg、G/MSBg与G/FREg细胞的荧光强度无显著差异。以α-MF介导的蛋白分泌量为对照，分析部分信号肽介导EGFP表达的在 表达上清中相对分泌水平的分泌效果。由表6可见，FRE2与MSB2信号肽对β-Gal都有很好的分泌效果。表6、部分信号肽对EGFP的相对分泌水平*α-MF介导蛋白的分泌水平均设为1。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页1 2 3