冬虫夏草的培养方法与流程

本发明有关于一种真菌的培养方法，特别指一种冬虫夏草的培养方法。

背景技术：

冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)又名中华虫草，其为冬虫夏草菌的子实体与僵虫菌核构成的复合体。冬虫夏草的药用价值自古就有记载，在中医上来说，冬虫夏草对于人体有调阴补阳的功效，常食用可改善先天虚弱体质，也为延年益寿、养身的极品。现代医学研究指出冬虫夏草中含有许多成份，如虫草多醣、胺基酸、D-甘露醇、虫草素、生物碱、微量元素、腺苷等，使其具有许多生理活性，包含有免疫调节、抗肿瘤、抗菌作用、抗病毒、护肝、调节内分泌、对中枢神经的镇静、调节心血管、肾脏、呼吸道等作用。不过，由于野生冬虫夏草须生长于高寒、缺氧及低气压的环境中，因此，冬虫夏草一直以来都被视为最珍贵的补气、补阳、补阴的代表药物之一。

早期研究发现中国被毛孢(Hirsutella sinensis)接种蝙蝠蛾幼虫后，能完成从染菌直到长出子实体的全过程，证明中国被毛孢为冬虫夏草的无性型菌株。为能改善野生冬虫夏草取得不易且价钱高昂的缺失，许多研究改以发酵技术开发利用冬虫夏草。一般来说，发酵技术分为液态发酵技术及固态发酵技术两种，而相较于液态发酵技术，固态发酵技术具有下列优点：比较适合真菌类，具有较高产量；使用设备较为简单；废液排放量少，减少对于环境污染；容易控制生产成本。

虽然现有研究已经揭露固态发酵技术较有利于冬虫夏草的开发，不过，过去少有研究投注心力于开发冬虫夏草的发酵技术，并且，基于固态发酵技术涉及许多培养条件，例如培养基组成、温度、湿度、光照等，都分别会影响到冬虫夏草的产率及其内活性成份的含量，以致于仍未有现有技术揭露冬虫夏草内特定成份的生产方法或其培养条件。据此，目前仍未有能够以人工方式稳定量产冬虫夏草的方法以及自其内获得特定活性成份的方法，使得冬虫夏草的开发利用倍增难度，导致市场上冬虫夏草的产品价位仍持续高居不下、供不应求。

技术实现要素：

本发明的主要目的即在于提供一种冬虫夏草的培养方法，其通过人工培养环境的调控，大幅提升冬虫夏草内生物碱的含量，而有利于保健产品的开发与 量产。

本发明的另一目的在于提供一种冬虫夏草的培养方法，其能以人工培养的方式培养出固态冬虫夏草，用以使所培养出的冬虫夏草的成份及其含量十分接近于野生冬虫夏草。

本发明的次一目的在于提供一种冬虫夏草的培养方法，其能够通过人工培养方法稳定冬虫夏草的生产品质，提高其生产效率。

为能达成上述目的，本发明所揭一种冬虫夏草的培养方法，其将一种菌接种于一培养基中，在一培养环境下进行暗室培养后，再进行至少4周的光照培养。

较佳地，该光照培养的光照强度为300～500lux。

较佳地，该培养环境包含有培养湿度为70～90％、培养温度为15～25℃，其中，在本发明的一具体实施例中，该培养温度为20℃。

较佳地，暗室培养的时间为至少4周，其中，在本发明的一具体实施例中，暗室培养时间为6周时，能获得较高量的虫草素。

较佳地，该培养基的含水量为50～60％。

较佳地，该培养基包含有一粉状基质及一氮源，而该粉状基质由至少一五谷杂粮的植物所制备而成，该氮源选得为酵母萃取物、蛋白胨或其组合。

较佳地，光照培养的时间为4周～12周，如4周、8周、12周，其中，由本发明的实施例中可知，光照培养时间越长，能够使所培养出的冬虫夏草具有较高量的虫草素及菌丝体。

本发明的有益效果为：

本发明提供一种冬虫夏草的培养方法，能以人工固态培养方式大量且稳定地获得冬虫夏草，改善野生冬虫夏草生长缓慢的缺点，提高冬虫夏草生长效率及特定活性成份含量，使所培养出的冬虫夏草的成份及组成类似于野生冬虫夏草，而能够达到降低生产成本，提供经济效益等功效。

附图说明

图1为虫草素的标准检量线。

图2为腺苷的标准检量线。

图3为甘露醇的标准检量线。

图4为在不同光照起始点给予光照4周后所测得的甘露醇含量及菌丝总量。

图5为在不同光照起始点给予光照8周后所测得的甘露醇含量及菌丝总量。

图6为在不同光照起始点给予光照12周后所测得的甘露醇含量及菌丝总量。

图7为在不同光照起始点给予光照4周后所测得的腺苷含量及菌丝总量。

图8为在不同光照起始点给予光照8周后所测得的腺苷含量及菌丝总量。

图9为在不同光照起始点给予光照12周后所测得的腺苷含量及菌丝总量。

图10为在不同光照起始点给予光照4周后所测得的虫草素含量及菌丝总量。

图11为在不同光照起始点给予光照8周后所测得的虫草素含量及菌丝总量。

图12为在不同光照起始点给予光照12周后所测得的虫草素含量及菌丝总量。

图13为各组冬虫夏草分别以不同光照条件培养后，分别测得各组内虫草素、腺苷、甘露醇含量以及菌丝总量的结果。

图14为各组冬虫夏草分别以不同光照条件培养后，分别测得各组内虫草素、腺苷、甘露醇含量以及菌丝总量的结果。

图15为各组冬虫夏草分别以不同光照条件培养后，分别测得各组内虫草素、腺苷、甘露醇含量以及菌丝总量的结果。

具体实施方式

本发明揭露一种冬虫夏草的培养方法，其用以通过人工调控固态培养环境，使人工培养的冬虫夏草具有类似于野生冬虫夏草的成份，并且，其菌丝体能够稳定且快速地生长，以达到供应市场上的需求的功效。

如同本发明所述技术领域且具通常知识者所周知，野生冬虫夏草的生长环境极为复杂，因此，为能培养出的冬虫夏草的成份及组成类似于野生冬虫夏草，并且，要提升其生长效率，在人工培养冬虫夏草除须采用真正的冬虫夏草菌株外，仍需要考虑到各种不同环境因子。

用以培养冬虫夏草的固态培养基中包含有基质、氮源及金属离子，举例来说，氮源为酵母萃取物、蛋白胨或其组合；基质为五谷杂粮类的植物，作为碳源，如燕麦、大豆、薏仁、玉米、小米等。再者，培养基的含水量会影响冬虫夏草的生长，一般来说，含水量以50～60％为佳，其中，当含水量为50％时，冬虫夏草培养约5～7天会开始出现白色菌丝生长于基质表面，再经过18～20天的培养，菌丝会附着于整个基质表面且具有一定的厚度；而在含水量60％时，冬虫夏草培养约14～16天后，开始出现明显菌丝生长。

由于培养容器中空气交换有利于真菌菌丝生长，因此，培养冬虫夏草的培养容器为透气性佳的容器，使于培养过程中，培养容器内部气体与外部气体交换，能获得较佳的生长效果。举例来说，该培养容器如中国台湾实用新型专利第M468890号专利所示、具有通气管道的试管或盒体，或是使用疏水膜的容器。

湿度及温度皆为影响冬虫夏草生长的因素之一，其中，低湿度环境会使培 养基干燥太快，不利于冬虫夏草生长，反之，高湿度环境有利于冬虫夏草生长，因而，若在较为干燥的培养环境中，一般会通过保湿机器来维持环境中的湿度，例如加湿器。一般来说，湿度70～90％、培养温度介于15～25℃为较佳。

以下，为能更进一步证实本发明的功效，兹举若干实施例并搭配附图说明如后。而该实施例为本发明的例示，非用以限制本发明的说明书及权利要求的解释。

在下列实施例中，所采用的冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)采于台湾新竹食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，寄存编号为BCRC37843。

实施例一：制备冬虫夏草种菌

将购于台湾新竹食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心的该冬虫夏草(BCRC37843)以平板及斜面培养基在温度15～22℃下培养约40～70天后，在4℃冰箱中保存，其中，以浓度为39g/L的马铃薯葡萄糖洋菜培养基在温度20℃下培养60天为较佳。

将经培养的该冬虫夏草切块，并接种于酸碱值6.0的一培养基中，再以均质棒打碎菌块，进行培养，以获得一冬虫夏草种菌，其中，培养基以含有蔗糖、酵母萃取物及蛋白胨的培养基，培养温度为25℃、120rpm培养箱、培养18天为较佳。

实施例二：制备培养基

先将五谷杂粮类的固态碳源以粉碎机粉碎为适当大小的颗粒，约15克，作为培养基质，而该颗粒大小以20～30网孔(mesh)为佳。制备一培养液，其较佳配方为2％葡萄糖、1％氮源、0.01硫酸镁、0.01％磷酸二氢钾，其中，氮源为酵母萃取物或蛋白胨。将该培养液添加至该培养基质中，获得一培养基。

实施例三：检测虫草素及腺苷的含量

将虫草素及腺苷的标准品分别以15％甲醇溶液制备成浓度200、400、600、800、1000μg/mL的溶液，用高效液相层析仪(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)进行分析对虫草素、腺苷标准品甲醇萃取液进行定性与定量分析，以制作出标准线，如图1及图2所示，其中，高效液相层析仪的条件如下：Luna C18(5μm，4×250nm)的液相层析管柱、254nm波长、0.4ml/分的流速、流动相为甲醇：0.02M磷酸钾(15：85)，注入体积为20μL。

取0.1公克的样品粉末装入离心管中，加入5毫升的甲醇溶液，先以100℃的沸水进行萃取，以7000rpm的转速离心10分钟，再取1.5毫升进行离心(7000rpm，10分钟)，以0.22μm滤膜过滤。将滤液通过高效液相层析仪对冬 虫夏草甲醇萃取液进行定性与定量分析，而分析条件与标准品的分析条件相同。通过该虫草素及腺苷的标准线，能获得得到该样品中虫草素及腺苷的含量。

实施例四：检测甘露醇的含量

取样品粉末0.25公克于离心管中，加入100毫升蒸馏水，以80℃恒温水槽加热，约1小时后，以转速7000rpm离心10分钟，取上清液1毫升分置于不同离心管中，再将装有1毫升上清液的离心管内加入1毫升的高碘酸钠溶液，混合均匀，在室温中静置10分钟后，加入0.1％的L-鼠李糖2毫升，混合后再加入4毫升新配Nash试剂，混合均匀，放入53℃恒温水槽中加热至变色，冷却到室温时，在波长415nm的条件下以分光光度计测量其吸收值，通过图3所示检量线，换算出该样品中甘露醇的浓度值。

实施例五：光照试验(一)

依据实施例二所述，将制备好的培养基置入一培养容器中。将实施例一的该冬虫夏草种菌以接菌量20％接入各该培养容器中，分别于温度20℃、湿度70～80％，进行黑暗培养，待菌丝体长满培养基表面后，再培养至一固定培养周数：4周、5周、6周、7周、8周、9周，而该固定培养周数作为光照起始点，用以后续进行不同周数的光照，其中，光照为日光灯白光，强度为300～500lux，光照时间分别为4周、8周、12周。最后，分别采集于各该固定培养周数经不同光照时间的冬虫夏草菌体，经45℃的温度烘干，磨粉检测其内腺苷、虫草素、甘露醇的含量，结果如图4至图12所示。

由图4至图12的结果可知，光照时间的长短及光照起始点会影响到冬虫夏草内活性成份的含量，其中：

由图4的结果显示，在固定培养周数(即光照起始点)为第4、5、6周时分别进行光照周数为4周，冬虫夏草内的甘露醇含量缓慢成长。而在固定培养周数(即光照起始点)为第7周，进行光照4周后，会使冬虫夏草菌株内的甘露醇大幅成长，并且，随着光照起始点的周数增加，甘露醇含量也增加，在第9周开始进行光照4周，使冬虫夏草菌株内的甘露醇含量为最高。

由图5的结果显示，在固定培养周数为4及5周时分别给予8周光照，冬虫夏草内的甘露醇含量于培养前期缓慢成长。当在固定培养周数为第6周进行光照8周后，冬虫夏草菌株内的甘露醇开始快速生长，而当在固定培养周数为第9周时给予冬虫夏草进行光照8周，使得冬虫夏草的生理活性下降。

请再参阅图6，在固定培养周数为第4及5周分别进行光照12周，冬虫夏草内的甘露醇含量持续成长，而在固定培养周数第6、7、8、9周分别开始进行12周 光照，其内甘露醇含量持续减少。

综合图4至图6的结果显示，在固定培养周数第6周开始进行光照，能使冬虫夏草内甘露醇的含量增加，其中，又以提供光照时间为8周能够使冬虫夏草内具有最高甘露醇含量，浓度约为181.55mg/g。

由图7的结果可知，在固定培养周数为4、5、6周时分别给予4周光照，会使冬虫夏草内的腺苷含量增加，而在固定培养周数为第7、8、9周时分别给予光照4周后，会使冬虫夏草内腺苷含量随着固定培养周数增加而减少。

由图8的结果可知，在光照时间为8周时，随着固定培养周数的增加，冬虫夏草内的腺苷含量逐渐减少，其中，又以固定培养周数为第9周时，冬虫夏草内线苷含量为最低。而由图9的结果可知，在光照时间为12周时，随着固定培养周数的增加，冬虫夏草内的腺苷含量缓慢减少，并且，在固定培养周数为第9周时，冬虫夏草内腺苷含量为最低。

综合图7至图9的结果显示，在固定培养周数第5周开始进行光照，使冬虫夏草内腺苷含量增加，其中，又以提供光照4周能够使冬虫夏草内具有最高腺苷含量，浓度约为120.50μg/g。

由图10的结果可知，当光照时间为4周时，在固定培养周数为4及5周时给予光照，能使冬虫夏草内的虫草素含量增加，而在固定培养周数为第6、7、8、9周时给予光照，会使冬虫夏草内虫草素含量随着固定培养周数的增加而减少。

由图11的结果可知，当光照时间为8周时，在固定培养周数为4、5、6周时给予光照，能使冬虫夏草内的虫草素含量增加，而在固定培养周数为第7、8、9周时给予光照，会使冬虫夏草内虫草素含量减少，并且，在固定培养周数为第9周时，冬虫夏草内的虫草素含量为最低。

由图12的结果可知，在固定培养周数第4、5周分别给予光照12周时，会使冬虫夏草内虫草素的含量下降，而在固定培养周数第6周时给予光照12周后，冬虫夏草内虫草素含量大幅提升。在固定培养周数第7、8、9周给予光照12周后，冬虫夏草内虫草素含量会开始下降。

由图10至图12的结果显示，在固定培养周数为第6周时提供光照能使冬虫夏草内虫草素的含量增加，其中，以光照时间为第8周时能够获得最高量的虫草素，约为1589.00(μg/g)。

实施例六：光照试验(二)

依据实施例二所述，将制备好的培养基分别置入两个培养容器中，再将实施例一的该冬虫夏草种菌以接菌量20％分别接入各该培养容器中，各该组冬虫 夏草分别于温度20℃、湿度70～80％及下列光照条件下进行培养，其中，第一组连续8周静置于暗室中进行培养；第二组前4周在暗室中培养，后4周在强度300～500lux的光照下进行培养。待各组培养完成后，分别取样检测其内腺苷、虫草素、甘露醇的含量，结果如图13所示。

由图13的结果可知，相较于第一组，第二组冬虫夏草的菌丝量多约0.15克，腺苷含量下降约46.67μg/g，甘露醇含量下降约44.05mg/g，虫草素含量大幅增加约455.17μg/g。由此可知，在冬虫夏草的固态培养过程中提供光照有利于促进其菌丝体的生长及合成虫草素。

实施例七：光照试验(三)

依据实施例二所述，将制备好的培养基分别置入三培养容器中，再将实施例一的该冬虫夏草种菌以接菌量20％分别接入各该培养容器中，各该组冬虫夏草分别在温度20℃、湿度70～80％及下列光照条件下进行培养，其中，第一组连续12周静置于暗室中进行培养；第二组前8周在暗室中培养，后4周在强度300～500lux的光照下进行培养；第三组前4周在暗室中培养，后8周在强度300～500lux的光照下进行培养。待各组培养完成后，分别取样检测其内腺苷、虫草素、甘露醇的含量，结果如图14所示。

由图14的结果可知，第一组冬虫夏草内甘露醇的含量分别高于第二组及第三组24.31mg/g及27.70mg/g，并且，其腺苷的含量分别高于第二组及第三组53.83μg/g及135.33μg/g。而第二组及第三组冬虫夏草的菌丝量明显高于第一组。第三组冬虫夏草内的虫草素含量为三组中最高，约为第二组的1.63倍，第一组的2倍多，具体来说，第三组的虫草素含量高于第二组约441.00μg/g且高于第一组约588.83μg/g。

由此可知，光照确实对于冬虫夏草生产虫草素及其菌丝体生长有帮助，并且，随着光照时间增加，能够有效提升虫草素的生产及菌丝体的生长。

实施例八：光照试验(四)

依据实施例二所述，将制备好的培养基分别置入四个培养容器中，再将实施例一的该冬虫夏草种菌以接菌量20％分别接入各该培养容器中，各该组冬虫夏草分别在温度20℃、湿度70～80％及下列光照条件下进行培养，其中，第一组连续16周静置于暗室中进行培养；第二组前12周在暗室中培养，后4周在强度300～500lux的光照下进行培养；第三组前8周在暗室中培养，后8周在强度300～500lux的光照下进行培养；第四组前4周在暗室中培养，后12周在强度300～500lux的光照下进行培养。待各组培养完成后，分别取样检测其内腺苷、虫草 素、甘露醇的含量，结果如图15所示。

由图15的结果可知，就菌丝总量来说，第一组为最低，第二组为次低，第三组及第四组的菌丝量明显增加。就甘露醇含量来说，随着光照时间增加，甘露醇含量逐渐下降，因此，第一组的甘露醇含量为最高，而分别高于第二组、第三组及第四组10.81mg/g、30.50mg/g及37.27mg/g。就腺苷来说，第一组具有最高量的腺苷，第一组腺苷含量分别高于第二组、第三组及第四组42.67μg/g、142.00μg/g、147.95μg/g。第四组的虫草素含量为最高，而为第一组的两倍多，并且，第四组的虫草素含量分别高于第一组、第二组及第三组673.85μg/g、445.17μg/g及271.00μg/g。

由此可知，在冬虫夏草固态培养过程中提供光照，能够提升冬虫夏草虫草素及菌丝的生长，并且，随着光照时间的增加，虫草素及菌丝的生长效率会越佳。

通过上述实施例的说明，能清楚证实本发明所揭冬虫夏草的培养方法具有提高冬虫夏草生长效率及特定活性成份含量，而能够有效地改善野生冬虫夏草生长缓慢的缺点。换言之，本发明所揭冬虫夏草的培养方法能以人工固态培养方式大量且稳定地获得冬虫夏草，并且，使所培养出的冬虫夏草的成份及组成类似于野生冬虫夏草，而能够达到降低生产成本，提供经济效益等功效。

以上仅是通过各该实施例详细说明本发明，熟知该技术领域者在不脱离本发明精神下，而对于说明书中的实施例所做的任何简单修改或是变化，均应为本案权利要求所涵盖。