一种群体感应猝灭菌制备方法、MBR膜污染防治方法及装置与流程

本发明涉及污染防治
技术领域：
，尤其涉及一种群体感应猝灭菌制备方法、MBR膜污染防治方法及装置。
背景技术：
：在污水处理、水资源再利用领域，膜生物反应器（MembraneBio-Reactor，简称MBR）是一种由膜分离单元与生物处理单元相结合的新型水处理设备。由于膜的高效分离作用，分离效果远好于传统沉淀池，处理出水极其清澈，悬浮物和浊度接近于零，细菌和病毒被大幅去除；同时，膜分离也使微生物被完全被截流在生物反应器内，使得系统内能够维持较高的微生物浓度，不但提高了反应装置对污染物的整体去除效率，还对进水负荷（水质及水量）的各种变化具有很好的适应性，耐冲击负荷，能够稳定获得优质的出水水质。但是，在分离过程中，膜池内微生物容易在膜表面结膜生长，对膜造成污染，引起通量下降或膜压差上升。部分现有技术虽能够有效减缓膜污染程度，但要么会大量增加能耗（空气擦洗技术），要么需投加药剂，增加运行成本并对正常运行造成风险，要么需对膜表面进行修饰或更换新膜，风险大，投资高，推广困难。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于，提供一种有效节省成本和能耗的群体感应猝灭菌制备方法、MBR膜污染防治方法及装置。为了解决上述技术问题，本发明提供一种群体感应猝灭菌制备方法，用于膜生物反应器MBR的膜污染防治，包括以下步骤：步骤S1，从污水处理厂取样出来的活性污泥或污水中制备具有N-己酰高丝氦酸内酯AHL的分解利用能力的备选菌株；步骤S2，对所述备选菌株进行群体感应猝灭能力验证，筛选出群体感应猝灭解菌；步骤S3，对所述群体感应猝灭菌进行抗生物膜能力验证，获取有效群体感应猝灭菌。其中，所述步骤S1具体包括：对所述从污水处理厂取样出来的活性污泥或污水进行预处理后接种在含有1~4mM作为碳源的AHL的基本培养基上，经过1-4天富集培养后，按体积比取0.5-2%样品转移到新的含有AHL基本培养基中进行培养，重复执行前述步骤2-4次；挑取适量培养完成后的菌液在LB固体培养基上划线培养，以25-30摄氏度培养8-24小时，挑取单菌落保存，作为备选菌株。其中，所述步骤S2具体包括：对所述备选菌株过夜培养，按1：100的比例分别转接到4ml添加有1-10μMAHL的LB液体培养基中，以30摄氏度震荡培养8-12小时后，取培养液离心取上清液，并过滤灭菌；将无菌小纸片平铺在含有报告菌株紫色色杆菌CV026或者VIR07的LB平板上，在无菌纸片上添加30-80μl提取的上清液，过夜培养；以不具有分解AHL能力的细菌作为阴性对照，以具有分解AHL能力的细菌作为阳性对照，判断培养基的颜色变化，将紫色晕圈减少或消失的筛选出来作为所述群体感应猝灭菌。其中，所述步骤S1具体包括：对所述从污水处理厂取样出来的活性污泥或污水用灭菌水进行10-106倍系列稀释，稀释后均匀涂抹在培养基上，以10-40摄氏度培养10-72小时，挑取单菌落进行保存，作为备选菌株。其中，所述步骤S2具体包括：将1μM-100μMAHL加入到含有0.5-1ml新鲜培养基的96孔板上，在每个孔内分别接种所述备选菌株，以10-40摄氏度培养8-72小时，得到的菌液高速离心分离后取上清液保存；将无菌小纸片平铺在含有报告菌株紫色色杆菌CV026或者VIR07的LB平板上，在无菌纸片上添加20-80μl提取的上清液，过夜培养；以不具有分解AHL能力的细菌作为阴性对照，以具有分解AHL能力的细菌作为阳性对照，判断培养基的颜色变化，将紫色晕圈减少或消失的筛选出来作为所述群体感应猝灭菌。其中，所述步骤S2具体包括：制作含有1μM-100μMAHL的平板培养基，在所述平板培养基上均匀接种10-50个菌落，培养8-72小时后，转接各个菌落至新鲜培养基保存并记录不同菌落在平板上的生长位置；除去原平板培养基上的每个菌落，在平板表面散布0.5-2mlCV026或者VIR07培养液，以30摄氏度培养12小时，记录不同位置的颜色，将无紫色产生的区域所对应的菌落作为群体感应猝灭菌，活化后保存。其中，所述步骤S3具体包括：步骤S31，过夜培养所述群体感应猝灭菌，将其稀释到LB培养基中，培养至对数增长期；步骤S32，用新鲜培养基稀释至浊度为OD600=0.1-0.25，取2-5μl菌液加入100-200μlLB液体培养基中，以15-30摄氏度培养一定时间后除去菌液；步骤S33，以铜绿假单胞菌为指示菌分别与不同群体感应猝灭菌共同培养48小时后，按照结晶紫染色法分别测定混合生物膜形成量；步骤S34，选取混合生物膜形成量降低50%以上的组合所对应的群体感应猝灭菌作为有效群体感应猝灭菌。本发明还提供一种MBR膜污染防治方法，包括：将按所述的制备方法制备出的有效群体感应猝灭菌进行过夜培养，稀释形成悬浊菌体，封装到多孔载体中，并将所述多孔载体均匀放置在膜池中靠近MBR膜组件的部位。其中，所述MBR膜污染防治方法具体包括：将所述有效群体感应猝灭菌进行过夜培养，以0.1-2%浓度稀释到新鲜培养基中放大培养至对数增长期；通过高速离心收集菌体，除去上清液后用等量灭菌水悬浊菌体；在无菌条件下将菌体悬浊液灌注到灭菌处理过的多孔硬质载体中，将封装完成后的所述载体均匀固定在膜池中靠近MBR膜组件的部位；或者将菌体悬浊液与海藻酸钠混合，形成重量体积比为3-10%的混合液，将混合液通过蠕动泵滴入3-10%的CaCl2溶液中，形成球状菌包，留在溶液中培养8-15小时后装入网格型载体装置固定，然后将所述载体均匀固定在膜池中靠近MBR膜组件的部位。本发明还提供一种MBR膜污染防治装置，所述MBR膜污染防治装置封装有所述的制备方法制备出的有效群体感应猝灭菌，所述MBR膜污染防治装置均匀放置在膜池中靠近MBR膜组件的部位。其中，所述MBR膜污染防治装置为多孔硬质载体或网格型载体。实施本发明所带来的有益效果是：制备出的群体感应猝灭菌置于MBR中，利用污水中的污染物作为营养，在生长过程中分解其它微生物所成产的信号分子，使膜池中其它微生物所生产的AHL信号分子浓度无法达到群体感应所需要的浓度阈值，无法形成信号环路传导，从而使膜池微生物保持浮游状态，抑制它们在MBR膜组件表面形成生物膜，达到防污和节省能耗的效果。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明实施例一种群体感应猝灭菌制备方法的流程示意图。图2是本发明实施例将封装后的载体置于膜池中的工作原理示意图。图3是本发明实施例将另一封装后的载体置于膜池中的工作原理示意图。图4是本发明实施例膜污染防治装置固定于膜池的位置示意图。图5是本发明实施例MBR膜污染防治方法及装置对活性污泥中可溶性EPS的影响示意图。具体实施方式以下结合附图对本发明实施例进行详细说明。细菌的“群体感应”（QuorumSensing，简称QS）是依赖于细菌的数量（Quorum）达到一定密度时才能发生的感应现象（Sensing）。当一个特定环境中的细菌数量增加时，会激活细菌靶基因的表达，展现出新的行为特征，如生物发光、质粒转移、毒性因子的产生、孢子的萌发或生物膜的形成等。多数细菌的生物膜形成和胞外多糖（EPS）的生产是受QS系统调控的，而生物膜的形成和EPS生产是形成MBR膜污染的重要因素，以群体感应信号分子为新靶点MBR膜池微生物的生活状态，使多数膜池微生物能够保持浮游生长状态，减少EPS生产，为MBR膜污染防治提供了一种新策略。通过分解信号分子从而影响QS体系是群体感应猝灭（QSI）研究的主要方向，也是自然环境中微生物互作的普遍形式。利用这一机理快速实现群体感应猝灭菌的定向分离和培养是关键。本发明基于这一原理开发出一种膜生物反应器的膜污染防治方法及装置，解决MBR工艺这一瓶颈问题，以节省能耗，延长膜寿命。请参照图1所示，本发明实施例一提供一种群体感应猝灭菌制备方法，用于膜生物反应器MBR的膜污染防治，包括以下步骤：步骤S1，从污水处理厂取样出来的活性污泥或污水中制备具有N-己酰高丝氦酸内酯AHL的分解利用能力的备选菌株；步骤S2，对所述备选菌株进行群体感应猝灭能力验证，筛选出群体感应猝灭解菌；步骤S3，对所述群体感应猝灭菌进行抗生物膜能力验证，获取有效群体感应猝灭菌。以下对各步骤进行具体说明。N-己酰高丝氦酸内酯（AHL）是最广泛分布的一种群体感应信号分子，本发明步骤S1从AHL信号分子切入。步骤S1制备备选菌株有两种方案，方案A具体包括：对所述从污水处理厂取样出来的活性污泥或污水进行预处理后接种在含有1~4mM作为碳源的AHL的基本培养基上，经过1-4天富集培养后，按体积比取0.5-2%样品转移到新的含有AHL基本培养基中进行培养，重复执行前述步骤2-4次；挑取适量培养完成后的菌液在LB固体培养基上划线培养，以25-30摄氏度培养8-24小时，挑取单菌落保存，作为备选菌株。其中，前述需重复执行2-4次是为了保证所分离的细菌具有AHL的分解利用能力。作为另一种方式，方案B具体包括：对从污水处理厂取样出来的活性污泥或污水用灭菌水进行10-106倍系列稀释，稀释后均匀涂抹在培养基上，以10-40摄氏度培养10-72小时，挑取单菌落进行保存，作为备选菌株。步骤S2主要用于对备选菌株进行群体感应猝灭能力筛选，以获得能够分解90%以上的AHL分子的群体感应猝灭菌。针对步骤S1的方案A，步骤S2具体包括：对备选菌株过夜培养，按1：100的比例分别转接到4ml添加有1-10μMAHL的LB液体培养基中，以30摄氏度震荡培养10-12小时后，取培养液离心取上清，并过滤灭菌；将无菌小纸片平铺在含有报告菌株紫色色杆菌（C.violaceum）CV026或者VIR07的LB平板上，在无菌纸片上添加30-80μl由步骤S21提取的上清液，过夜培养；以不具有分解AHL能力的细菌作为阴性对照，以具有分解AHL能力的细菌作为阳性对照，判断培养基的颜色变化，将紫色晕圈减少或消失的筛选出来作为AHL分解菌。针对步骤S1的方案B，步骤S2具体包括：将1μM-100μMAHL加入到含有0.5-1ml新鲜培养基的96孔板上，在每个孔内分别接种所述备选菌株，以10-40摄氏度培养8-72小时，得到的菌液高速离心分离后取上清液保存；将无菌小纸片平铺在含有报告菌株紫色色杆菌CV026或者VIR07的LB平板上，在无菌纸片上添加20-80μl提取的上清液，过夜培养；以不具有分解AHL能力的细菌作为阴性对照，以具有分解AHL能力的细菌作为阳性对照，判断培养基的颜色变化，将紫色晕圈减少或消失的筛选出来作为所述群体感应猝灭菌。本发明中，过夜培养是指半天时间，大约12-16小时。上述对上清液的灭菌，是为了避免在分离过程中混入杂菌，因为进行分离的环境当中到处是杂菌。由于大肠杆菌DH5α已被证实不能分解AHL，蜡样芽孢杆菌-M9已被证实可以分解AHL，因此本发明选用大肠杆菌DH5α作为阴性对照，用蜡样芽孢杆菌-M9作为阳性对照。用残留的紫色晕圈面积来评价细菌的群体感应猝灭能力，面积越小，群体感应猝灭能力越强，据此筛选出能够分解90%以上的AHL分子的细菌保存备用。针对步骤S1的方案B，步骤S2还具体包括：制作含有1μM-100μMAHL的平板培养基，在所述平板培养基上均匀接种10-50个菌落，培养8-72小时后，转接各个菌落至新鲜培养基保存并记录不同菌落在平板上的生长位置；除去原平板培养基上的每个菌落，在平板表面散布0.5-2mlCV026或者VIR07培养液，以30摄氏度培养12小时，记录不同位置的颜色，将无紫色产生的区域所对应的菌落作为群体感应猝灭菌，活化后保存。通过步骤S2筛选出的群体感应猝灭菌即具备了较强群体感应猝灭能力，细菌种类不尽相同，AHL分解能力也各有相对强弱，均不能最终用于膜生物反应器的膜污染防治，还需通过步骤S3对群体感应猝灭菌进行抗生物膜能力验证。这是因为细菌生物膜的形成是引起MBR膜污染的重要因素，所以衡量群体感应猝灭菌对其它细菌生物膜的形成能力抑制作用是评价其抗MBR膜污染性能的重要指标。步骤S3具体包括：步骤S31，过夜培养AHL分解菌，将其稀释到LB培养基中，培养至对数增长期；步骤S32，用新鲜培养基稀释至浊度为OD600=0.1-0.25，取2-5μl菌液加入100-200μlLB液体培养基中，以15-30摄氏度培养一定时间后除去菌液；步骤S33，以铜绿假单胞菌为指示菌分别与不同群体感应猝灭菌共同培养48小时后，按照结晶紫染色法分别测定混合生物膜形成量；步骤S34，选取混合生物膜形成量降低50%以上的组合所对应的群体感应猝灭菌作为有效群体感应猝灭菌。上述组合包括作为指示菌的铜绿假单胞菌和需测试的群体感应猝灭菌，混合生物膜形成量降低50%以上的组合，表明其中的群体感应猝灭菌能够有效抑制铜绿假单胞菌形成。通过上述步骤制备出的群体感应猝灭菌通常包括但不限于：绿脓杆菌Pseudomonassp.、不动杆菌Acinetobactersp.、丛毛单胞菌Comamonassp.、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonassp.、葡萄球菌Staphylococcussp.、芽孢杆菌Bacillussp.、金黄杆菌Chryseobacteriumsp.等。将制备出的群体感应猝灭菌置于MBR中，利用污水中的污染物作为营养，在生长过程中分解其它微生物所成产的信号分子，使膜池中其它微生物所生产的AHL信号分子浓度无法达到群体感应所需要的浓度阈值，无法形成信号环路传导，从而使膜池微生物保持浮游状态，抑制它们在MBR膜组件表面形成生物膜，达到防污和节省能耗的效果。本发明实施例二提供一种MBR膜污染防治方法，包括：将本发明实施例一所制备出的有效群体感应猝灭菌进行过夜培养，稀释形成悬浊菌体，封装到多孔载体中，并将多孔载体均匀放置在膜池中靠近MBR膜组件的部位。具体来说，将有效群体感应猝灭菌进行过夜培养，以0.1-2%浓度稀释到新鲜培养基中放大培养至对数增长期；通过高速离心收集菌体，除去上清液后用等量灭菌水悬浊菌体。此后有两种方式封装到载体：（1）在无菌条件下将菌体悬浊液灌注到灭菌处理过的多孔硬质载体，例如硬质膜管（如陶瓷膜等，膜孔径在0.05-0.5μm之间，长度为0.8-1.2m，直径为4-30cm）中，将封装完成后的载体均匀固定在膜池中靠近MBR膜组件的部位；（2）将菌体悬浊液与海藻酸钠混合，形成重量体积比为3-10%（w/v）的混合液，将混合液通过蠕动泵滴入3-10%的CaCl2溶液中，形成球状菌包，留在溶液中培养8-15小时后装入网格型载体固定，然后将载体均匀固定在膜池中靠近MBR膜组件的部位。方式（1）和方式（2）封装有效群体感应猝灭菌所用的载体不同，请再分别参照图2和图3所示，图2所示为按方式（1）封装后的载体置于膜池中的工作原理示意图，群体感应猝灭菌被包埋在硬质膜管（如陶瓷膜等）内，避免与膜池中微生物直接接触和同化，但是污水中的污染物和AHL信号分子可以自由通过微孔进入，污染物提供群体感应猝灭菌营养，AHL信号分子被群体感应猝灭菌代谢掉，整个膜池中AHL信号分子浓度将处于一个较低水平，无法达到膜池中微生物在膜组件表面形成生物膜所需要的浓度阈值，从而使膜池微生物处于浮游状态，阻止形成生物膜，保持膜表面清洁，达到防污效果。图3所示为按方式（2）封装后的载体置于膜池中的工作原理示意图，有效群体感应猝灭菌先封装成菌球，再将菌球固定在网格型的载体中，AHL信号分子和营养物质自由出入菌球，AHL信号分子被分解，而菌球内微生物则不会被同化。相应地，本发明实施例三提供一种MBR膜污染防治装置，封装有按本发明实施例一所制备出的有效群体感应猝灭菌，该MBR膜污染防治装置均匀放置在膜池中靠近MBR膜组件的部位。具体地，MBR膜污染防治装置为多孔硬质载体（图2）或网格型载体（图3）。MBR膜污染防治装置固定于膜池的位置请参照图4所示。本实施例的MBR膜污染防治装置，其工作原理及所带来的有益效果，与本发明实施例一、二相同，请参照前述实施例的描述，此处不再赘述。本发明还对实施效果进行了验证，例如，请参照图5所示，为本发明实施例的MBR膜污染防治方法及装置对活性污泥中可溶性EPS的影响示意图，从图中可以看出，图2、图3所示的两种膜污染防治方式都能有效的防止EPS的产生，在80天的测试周期内，安装有MBR膜污染防治装置的膜池污水中的EPS含量保持在10mg/l以下，而没有安装膜污染防治装置的对照组已经达到120mg/l左右。再如，下表1为本发明实施例的MBR膜污染防治方法及装置对污水中污染物去除率的影响示意表，表明本发明对水中污染物去除没有明显影响。表1：去除率（%）对照组图2图3COD95.2±1.595.2±1.894.6±1.7磷55.1±2.653.5±3.354.2±1.53.4氨氮53.4±2.354.6±2.553.8±1.9硝态氮95.1±2.795.9±2.195.4±1.2下表2为本发明实施例的MBR膜污染防治方法及装置对膜丝的影响示意表，表明本发明把污堵时间从10-14天降低到85-95天左右，清洗频率降低到原来的1/9-1/7。表2：TMP<40Kpa对照组图2图3污堵时间119389污堵时间139591下表3为本发明实施例的MBR膜污染防治方法及装置对膜阻的影响示意表，表明本发明明显降低了总液体阻力、泥饼阻力、固有膜阻，显著降低了MBR膜的污染程度，降低了冲洗难度。孔租有所增加是因为泥饼减少之后微小颗粒物直接进入膜孔造成的，但这可以通过反洗简单去除。表3：抗污染能力对照组图2图3总液体阻力4.534.154.22泥饼阻力2.652.012.15孔阻0.841.51.4固有膜阻1.030.690.75Rc/Rt(%)55.250.146.9Rp/Rt(%)20.133.530.2Rm/Rt(%)24.916.517.5以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。当前第1页1 2 3