磷脂酶、编码基因、制备方法及其应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及磷脂酶、编码基因、制备方法及其应用。

背景技术：

磷脂酶(Phospholipase，PL)是生物体内存在的能水解甘油磷脂的酶，根据磷脂酶水解甘油磷脂的位点(Richmond G.S.等，Int.J.Mol.Sci.2011，12:588-612)不同，可将磷脂酶分为磷脂酶A1(PLA₁)、磷脂酶A2(PLA₂)、磷脂酶B(PLB)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)以及溶血磷脂酶A(LysoPLA)，如下式所示：

式中的R₁和R₂为脂肪酰基；R₃为氨基醇类，如胆碱、乙醇胺、肌醇以及丝氨酸等。

PLA₁能够水解二脂肪酰基磷脂的Sn-1位酰基酯键，产生溶血磷脂和脂肪酸。PLA₂则是能够水解Sn-2位的酰基酯键，产生溶血磷脂和脂肪酸。PLB则是能水解二脂肪酰基磷脂的Sn-1位和Sn-2位的两个酰基酯键产生甘油磷酰胆碱和游离脂肪酸的磷脂酶，该酶也同时具有溶血磷脂酶的活性。PLC是能够水解甘油骨架和磷酸基之间的磷酸酯键产生二磷脂酰甘油和磷酸极性醇酯(如磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、磷酸肌醇等)。PLD则是水解磷酸基和氨基醇之间的磷酸酯键生磷脂酸和氨基醇。溶血磷脂酶A则是指能够水解溶血磷脂的Sn-1位或Sn-2位的脂肪酰基酯键，产物是甘油磷酸胆碱和脂肪酸。

磷脂酶广泛存在于各种生物体中，譬如人体中就有PLA₂、PLB、PLC等多种类型的磷脂酶。因为微生物具有生产周期短、生长条件简单、生产效率高等特点，其一直是工业酶制剂领域研究的重点。因此关于各种微生物磷脂酶的报道也非常多，如能够产PLA₁的微生物有：黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus)(Kazutaka M.，等 人.J.Structural.Biology.2013，182:192-196.)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)(CN103074290)、纽波特沙门氏菌(Salmonella newport)(Saxena M.等人，Folia Microbiol.1989，34:195-201.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)(Shiba Y.等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.2001，65(1):94-101)、黑曲霉(Aspergillus niger)(US5378623)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(赵梦梦等人，中国生物制品学杂志，2012，25(7):901-905.)等。

能够产PLA₂的微生物有：鳗弧菌(Vibrio anguillarum)(Ling L.，等人.BMC Microbio.2013，13:271-284.)、紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)(Sugiyama M.等人.J.Biol.Chem.2002，277(22):20051-20058.)、米曲霉(Aspergillus oryzae)(CN1328375)、变铅青链霉菌(Streptomyces livdans)(CN102226165)、超嗜热古菌Aeropyrum pemix(卢冬梅等，微生物学通报，2006，33(5):35-38.)等。

能够产磷脂酶B的微生物有：黑曲霉(Aspergillus niger)(Memon A.等人，FEMS Microbio.Lett.1983，18:15-18.)、嗜热菌(Thermotoga lettingae)(Wei T.等人，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2015)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(Jiang F.等人，Bioresour.Technol.2011，102(17):8052-8056)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Masayama A.等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.，2010，74(1):24-30)、链霉菌NA684(Matsumoto Y.等人，FEBS J.2013，280:3780-3796)、点青霉(Penicillium notatum)(Saito K.等人，Biochim.Biophys.Acta.1968，151:706–708)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Selvaraju K.等人，Biochim.Biophys.Acta.，2014，1841:1383-1392)、牛莫拉菌(Moraxella bovis)(Shiell B.J.等人，Protein Expr.Puri.2007，55:262-272)、产朊假丝酵母(Candida utilis)(Biosci.Biotechnol.Biochem.2006，70(2):377-386)、白假丝酵母(Candida albicans)(Mukherjee P.K.等人，Microbiology.2003，149:261-267)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Oishi H.等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.1996，60(7):1087-1092)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)(Oishi H.等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.1999，63(1):83-90)等。

能够产溶血磷脂酶A的微生物有：马尔尼菲青霉(Penicillium marneffi)(李凌华等人，中华实验和临床感染杂志.2012，6(2):109-112)、大肠杆菌(Escherichia coli)(Karasawa K.等，J.Biochem.1985，98(4):1117-1125)、嗜肺军团菌(Legionella pheumophila)(Flieger A.等，J.Bacteriol.2001，183(6):2121-2124)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)(Wright L.C.等，Biochem.J.2004，384(Pt2)：377-384)、白假丝酵母(Candida albicans)(Takahashi M.等，Biochim.Biophys.Acta.1991，1082(2)：161-169)等。

能够产磷脂酶C的微生物有：粘质沙雷氏菌武汉株(Serratia marcescens wuhan strain)(王常高等人，天然产物研究与开发，2003，15:345-348.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(Stinson M.W.等，Infect.Immun.1979，25(2):558-564)、八丈岛链霉菌(Streptomyces hachijyoensis)(JP49-55893)、、产气荚膜梭菌(Clostridum perfringens)(Zbrozyna A.J.，Acta Microbiol Pol.1966；15(2):145-151)、双酶梭状芽孢杆菌(Clostridium bifermantans)(Miles E.M.等，J.Gen.Microbiol.1947，1(3):385-399)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)(Vasil，M.L.等，Infect.Immun.1990，58(12):4020–4029)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(R.等，J.Hyg.Epidemiol.Microbiol.Immunol.1974，18(3):259-70)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)(Nygren B.，Acta Pathol Microbiol.Scand Suppl.1962，160:1-88)、单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)(Smith G.A.等，Infect.Immun.1995，63(11):4231–4237)、分枝杆菌属(Mycobacterium)(Johansen K.A.等，Infect Immun.1996，64(8):3259-3266)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(Birch M.等，Infect Immun.1996，64(3):751-755)、黄曲霉(Aspergillus flavus)(Tuckwell D.等，Mycol.Res.2006，110(Pt 10):1140-51)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和溜曲霉(Aspergillus tamarii)(CN101410513)、黑曲霉(Aspergillus niger)(WO2004104193)、白假丝酵母(Canidia albicans)(Andaluz E.Yeast，2001，Vol.18，711-721)、克柔氏念珠菌(Candida cruzei)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)(WO2004104193)等。

能够产磷脂酶D的微生物有：唐德链霉菌(Streptomyces tendae)(Mander P.等人.Arch.Pharm.Res.2009，32(10):1461-1467)、产橄榄色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)(Simkhada J.R.等人.Biotechnol.Lett.2009，31(3):429-435)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)(Jacobs A.C.等人.Infect.Immun.2010，78(5):1952-1962)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(Wilderman P.J.等人.Mol.Microbiol.2001，39(2):291-303)等。

当前市场上在售的磷脂酶品种主要有Ultra、10L、F、Oil、G999、A2、PLC等。其中Ultra为一种人工改造的蛋白，表现为PLA₁的活性，其基因来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)脂肪酶的杂交体，其磷脂酶的最适合作用温度在45℃附近，而脂肪酶的最适合作用温度在20℃。因此当温度高于40℃将以磷脂酶的活性为主， 而脂肪酶的活性较低。是一种来自于镰刀菌属微生物Fusarium venenatum的磷脂酶A1，其最适作用温度为55℃。F的磷脂酶为一种来自于丝状真菌曲霉属的磷脂酶A2。Oil、10L和A2都是PLA₂，前者的基因来源于紫红色链霉菌(Streptomyces violaceoruber)，后两个磷脂酶商品的基因都是猪胰腺PLA₂。G999为一种仅作用于溶血磷脂的溶血磷脂酶A，PLC为一种人工改造的磷脂酶C，其能够快速作用于磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺等底物，但是几乎不作用于磷脂酰肌醇和磷脂酸。

磷脂酶可广泛应用于油脂精炼、磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药工业等多个方面(Demaria L.等，Appl Microbiol.Biotechnol.2007，74(2):290-300)。如CN1780908等公开报道了磷脂酶A可以用于烘烤、用于洗涤剂、改善水溶液或糖浆的过滤性以及制备溶血磷脂等。磷脂酶还可以应用于奶酪生产工艺中，其可以提高奶酪的得率(Nielsen P.H.等人.Int J.Life Cycle Assess.2009，14:137–143)。磷脂酶D可以用于制备高纯度的磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸以及利用磷脂酶D的碱基转移活性可将一些多肽、核苷和多糖类药物通过配位键连接在磷脂载体上，制成具有特殊疗效作用的脂质体等(陈石良等人，工业微生物.1999，29(4):47-50)。

磷脂酶另外一个比较具有十分广阔应用前景的用途是在油脂精炼中，磷脂酶A1、A2、磷脂酶B以及磷脂酶C都可应用于酶法脱胶过程(Clausen K.Eur.J.Lipid Sci.Tech.103(6)，2001，333-340；Jiang F.等人Bioresour.Technol.2011，102(17):8052-8056；CN102634411、CN107455等)。

植物油毛油中的磷脂成分非常复杂，以大豆油的毛油为例，其中的磷脂成分有磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酸(LPA)、磷脂酰丝氨酸(PS)、甘油磷脂酰胆碱(PG)、双磷脂酰甘油(DPG)以及鞘磷脂(SM)等(Glonek T.JAOCS.1998，75(5):569-573)。如此多的磷脂成分存在于胶质中，为了达到较好的脱胶效果就要求所使用的磷脂酶具有相对低的底物选择性，通常的PLA和PLB都基本满足此条件，而PLC则具有较高的底物选择性。

EP0513709第一次提出了有效的酶法脱胶的方法，这一方法是首次使用PLA₂进行切割磷脂的Sn-2的脂肪酸，在40℃或60℃的温度条件下，在pH5.0-5.5的条件下能够使脱胶油中的磷残留量降低到5ppm以下。

US2007/13477则公开了PLA₁在植物油酶法脱胶中的最佳pH值在4.5和5.0之间，并提到反应的优选pH在约4.0的条件下进行最理想，此时体系中钙镁离子会较少与缓冲液中的阴离子结合成难溶盐。

EP1788080公开了一种使用蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的磷脂酶C进行脱胶的方法。WO2008/094847则公开了一种磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶C共同作用的脱胶工艺。

综上所述，现有的商品化磷脂酶以及现有报道的磷脂酶仍然不能满足实际应用的需求。譬如，在植物油的酶法脱胶工艺中，某些商品化的磷脂酶存在作用pH值偏高、残留脂肪酶活性以及某些磷脂酶的温度稳定性低或温度稳定性过高导致残留从而影响后期成品的品质等。

为此开发新型的磷脂酶就顺应了技术发展的需求，本发明提供了一种具有特定磷脂酶活性的蛋白和多肽。具体地，所述的磷脂酶能够水解磷脂的Sn-1和Sn-2位的脂肪酰基酯键，并且在反应过程中不累积溶血磷脂。该磷脂酶还具有较低的脂肪酶活性，最适合作用温度为45℃，最适合作用pH值为4.0，在pH3.0-10.0的范围内以及温度60℃以下的稳定性均非常高的性质。

技术实现要素：

本发明提供了一种具有磷脂酶活性的多肽，其编码基因序列，该多肽的重组制备方法、该多肽的酶学性质及其应用等。本发明所提供的多肽具有能够水解二脂肪酰基磷脂的Sn-1和Sn-2位的磷脂酶活性，分子量为58.75KDa，宽广的pH稳定性、优秀的热稳定性以及底物的广谱性等特点，因而该多肽无疑会在食品加工、油脂脱胶、医药等多个领域具有十分广阔的应用前景。

本发明分离的多肽含有：

(1)SEQ ID NO:2第21－565位氨基酸序列；或

(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO:2第21－565位氨基酸序列所具备的磷脂酶活性的由(1)衍生的多肽。

在一个具体实施方式中，所述分离的多肽：

(a)如SEQ ID NO:2所示，或由SEQ ID NO:2第21－565位氨基酸残基构成；或

(b)含有选自前导肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点的氨基酸序列。

本发明提供一种分离的多核苷酸序列，选自：

(1)编码本发明所述分离的多肽的多核苷酸序列；

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；和

(3)(1)或(2)所述的序列的长15－30个碱基的片段。

在一个具体实施方式中，所述多核苷酸序列选自：

(1)SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；

(2)(1)所述的多核苷酸序列的互补序列；和

(3)(1)或(2)所述的序列的长15－30个碱基的片段。

本发明还提供一种核酸构建体，该核酸构建体包含本发明多核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所述核酸构建体是表达载体。

本发明还提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的多核苷酸序列或核酸构建体。

本发明还提供一种组合物，该组合物含有本发明多肽。

本发明还提供一种使用本发明多肽进行油脂酶法脱胶、磷脂改性、改良饲料、或制备食品或药品的方法油脂酶法脱胶方法，其特征在于，所述方法包括使待处理物质与权利要求1或2所述的多肽接触，优选地，所述接触在以下一个或多个条件下进行：

(A)温度为37℃-60℃，优选45±5℃；和/或

(B)pH为3.7-7.0，优选3.4-4.5；和/或

(C)0-3.0mM的钙离子。。

本发明还提供本发明多肽在油脂精炼、磷脂改性、饲料改良剂、食品制备和医药制备中的应用。

附图说明

图1：野生酶的纯化结果SDS-PAGE及活性酶谱图。

图2：pPIC9K-cspl载体图。

图3：本发明多肽重组表达产物的SDS-PAGE图，其中，1：重组菌胞外表达产物，2：空白宿主的胞外产物，3：蛋白分子量标准。

图4：本发明多肽水解磷脂酰胆碱的TLC结果，其中，1：1，3二油酸甘油二酯，2：本发明多肽水解磷脂酰胆碱的结果，3：商品PLA1水解磷脂酰胆碱的结果，4：1，2二油酸甘油二酯，5：油酸。

图5：pH值对本发明多肽活力的影响。

图6：温度对本发明多肽的影响。

图7：金属离子及EDTA对本发明多肽酶活性的影响。

图8：本发明多肽的pH稳定性曲线。

图9：本发明多肽的温度稳定性曲线。

图10：本发明多肽水解产物的TLC结果图，其中，1：本发明多肽对大豆粉末 磷脂的水解结果；2：大豆粉末磷脂的空白对照；3：本发明多肽对大豆来源的磷脂酰胆碱的水解结果；4：磷脂酶A2水解大豆来源的磷脂酰胆碱的结果；5：大豆来源的溶血磷脂酰胆碱对照样品。

具体实施方式

具有磷脂酶活性的多肽

本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽。本发明还包括在SEQ ID NO:2的基础上具有一个或多个(通常为1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸缺失、插入和/或取代，尤其是在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为8以内)氨基酸的多肽。这些变异形式仍然具有本发明的活性。例如，本发明SEQ ID NO:2中N端第1－20位为信号肽序列。因此，SEQ ID NO:2的N端截短1－20个氨基酸残基的序列仍然会具有本文所述的磷脂酶活性。

优选是保守性变异形式。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

本发明SEQ ID NO:2来自枝孢霉WBRD00050(CGMCC No.7508)。来自枝孢霉属(Cladosporium)其它株的与本发明SEQ ID NO:2或其第21－565位氨基酸具有至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、优选至少99％的序列同一性的多肽也包括在本发明范围之内。优选地，来自以下属的微生物，且与本发明SEQ ID NO:2或其第21－565位氨基酸具有至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、优选至少99％的序列同一性的多肽也包括在本发明范围之内：曲霉菌属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、Graphiopsis属、Rachicladosporium属、Verrucocladosporium属、煤炱属(Capnodium)、Antennariella属、Conidioxyphium属、Fumiglobus属、Leptoxyphium属、Microxyphium属、Polychaeton 属、Scorias属、锥梗孢属(Dissoconium)、乌氏霉属(Uwebraunia)、Rasutoria属、叠孢属(Microcyclospora)、小叠孢属(Microcyclosporella)、拟维朗那霉属(Pseudoveronaea)、枝氯霉属(Ramichloridium)、链丝孢属(Scleroramularia)、平脐疣孢属(Zasmidium)、月盾霉属(Peltaster)、接瓶霉属(Zygophiala)、链丝孢属(Scleroramularia)、球腔菌属(Mycosphaerella)、横断孢属(Strelitziana)、节担孢属(Wallemia)、派伦霉属(Peyronellaea)，栓菌属(Trametes)，单端孢属(Trichothecium)、Davidiella属、Rasutoria属、顶齿霉属Acrodontium、糙孢菌Asperisporium、尾孢菌属Cercospora、小尾孢菌属Cercosporella、球腔菌属(Mycosphaerella)、钉孢属(Passalora)、假尾孢菌属(Pseudocercospora)、假小尾孢菌属(Pseudocercosporella)、柱隔孢菌属(Ramularia)、壳针孢属(Septoria)、长蠕孢属(Helminthosporium)、木霉属(Trichoderma)、根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)等丝状真菌。更优选的是，本发明的多肽来源于枝孢霉属(Cladosporium)的微生物。可采用本领域周知的方法计算两条序列之间的序列同一性，这些方法如采用软件BLAST。

此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。应理解，这些氨基酸序列的存在不会影响到所得多肽的活性。因此，本发明也包括在本发明多肽的C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸(例如前述接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点等)所得的多肽，这些多肽仍具有本文所述的磷脂酶活性。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

多核苷酸

本申请包括编码本发明多肽的核苷酸序列或其互补序列。SEQ ID NO:1显示了本发明多肽的编码序列之一。所述“编码序列”包括编码本发明所述多肽的核酸序列，以及与SEQ ID NO：1高度同源的核酸序列。编码本发明多肽的序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码包含SEQ ID NO：2或其第21-565位氨基酸残基的氨基酸序列，但与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有差别的核苷酸序列。

编码本发明多肽的序列包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的片段、类似物、衍生物和变异形式。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

本发明也包括编码本发明多肽的核酸序列(如SEQ ID NO：1或其互补序列)的片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本发明多肽的多核苷酸。因此，在某些实施例中，核酸片段的长度在15－30个碱基。可采用现有技术从本发明的核酸序列中挑选出适当的核酸片段，用作引物或探针。

本发明的多肽的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

核酸构建体

本发明也涉及包括与指导编码序列在合适宿主细胞中，在与该调控序列相适合的条件下表达的一个或多个调控序列可操作连接的本发明的分离多核苷酸的核酸构建体。编码本发明多肽的多核苷酸可以多种方式被操作以保证该多肽的表达。在其插入载体之前该多核苷酸序列的操作可能根据该表达载体而是合乎需要或必需的。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以使合适的启动子序列，由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列包含接到多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从噬菌体T7启动子、大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因等。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞正转录的合适启动子的实例是从米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉糖化酶(glaA)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、氏木霉纤维二糖水解酶II、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、里氏木霉葡聚糖内切酶等基因获得的启动子及其突变、截短和杂合(hybrid)启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子可获得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因。用于酵母宿主细胞的其它有用启动子由Romanos et al.，1992，Yeast 8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

用于细菌宿主的优选终止子可以是来自T7噬菌体的终止子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。

用于酵母宿主细胞的优选终止子获得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因等。

调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。签到序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

调控序列也可以是编码与多肽的氨基酸末端连接的氨基酸序列并且指导该编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核苷酸序列编码序列的5′端可固有地包含 天然连接具有编码分泌多肽的编码区节段的翻译阅读框的信号肽编码区。备选地，编码序列的5′端可包含与该编码区外源的信号肽编码区。当编码序列非天然地包含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。备选地，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区，即分泌进入培养基，都可用于本发明。

表达载体

本发明也涉及包括本发明多核苷酸的重组表达载体。在此各种核酸和调控序列可被连接在一起以产生可能包括一个或多个容许在这种位点插入或取代该编码多肽的核苷酸序列的方便限制性位点的重组表达载体。备选地，本发明的核苷酸序列可通过插入核苷酸序列或包括进入适当表达载体的序列的核酸构建体而被表达。在制造表达载体时，编码序列位于载体中以使得该编码序列可操作地连接用于表达适当调控序列。

重组表达载体可以使能够方便地经受重组DNA方法并且可导致感兴趣的核苷酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。

本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。

本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主个复制的元件。

一个以上拷贝的本发明的多核苷酸可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。

本发明的载体优选包含人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

本发明的表达载体更为优选地选择可用于毕赤酵母中表达的载体。本发明的载体优选商品化的毕赤酵母中使用的载体如pPIC、pPICZ、pAO、pGAP或pGAPZ等一系列的载体，更优选地采用pPIC9K载体。

宿主细胞

本发明也涉及包括被用于重组生产多肽的本发明多核苷酸的重组宿主细胞。包括本发明多核苷酸的载体被导入宿主细胞以使得该载体如早先说明的作为染色体的组成部分或作为染色体外的自我复制载体来维持。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物或非单细胞微生物。单细胞微生物例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等；或链霉菌细胞，例如钱青紫链霉菌；或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌和假单胞菌属。在优选的方面，细菌宿主是枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和大肠杆菌细胞。

宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物、酵母或真菌细胞。在优选的方面，宿主细胞是真核细胞，如在此使用的“真核”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门等。

在更优选的方面，宿主细胞是子囊菌门的细胞如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)以及Komagataella属等。

在最优选的方面，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等。在另外最优选方面，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

生产方法

本发明首先经过磷脂酶活性筛选而后通过克隆表达等技术获得本发明多肽的氨基酸及编码多核苷酸序列信息。筛选的方法可以包括文库法、蛋白分离纯化等方法，本发明优选地采用多步层析相结合的分离纯化方法纯化得到具有磷脂酶活性的蛋白， 而后再进一步通过活性电泳及酶谱分析的方法获得具体的有活性的蛋白条带。为了获得目的蛋白的序列信息，可以选择常规的化学测序方法以及质谱鉴定等方法。本发明则优选地采用质谱鉴定的方法，从而鉴定获得的相应蛋白相关肽段的序列信息。经过质谱鉴定的结果分析确定了该蛋白的两个肽段的序列信息，而后通过设计简并引物并以其cDNA库作模版进行PCR反应，从而成功获得一段多核苷酸序列信息。根据此信息再次设计引物通过基因走读的方式获得该多肽的全长序列信息，见SEQ ID NO：2，其编码多核苷酸信息见SEQ ID NO:1。

用SignalP 4.1server软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对SEQ ID NO:2所示的多肽进行分析，结果确定第1-20位的氨基酸序列为信号肽序列。在对本发明多肽使用分泌性表达载体进行重组表达时，可以去除这段信号肽序列，即对应于编码多核苷酸序列SEQ ID NO：1中的第1-60位的核苷酸序列。

在获得多肽的编码序列后，可采用如下方法生产本发明多肽，该方法包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养宿主细胞；以及(b)回收该多肽。

在一个具体实施例中，该方法包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养宿主细胞，其中该宿主细胞包括SEQ ID NO:1核苷酸序列与SEQ ID NO:1所限定的核苷酸序列杂交且编码具有磷脂酶活性的多肽的核苷酸序列；以及(b)回收该多肽。在优选的方面，本发明的多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或为去除N端20个氨基酸残基的序列，或增加一段因重组表达方式所产生的氨基酸序列。

本发明的生产方法中，细胞可以利用本领域已知的方法在适于生产多肽的培养基中培养。例如，细胞可通过在实验室或工业发酵罐中进行的摇瓶培养和小规模或大规模的发酵(包括连续的、分批的、分批补料或固态发酵)，在合适的培养基和容许该多肽表达和/或分离的条件下进行培养。培养发生在利用本领域已知的方法包括碳源和氮源和无机盐的合适培养基中。合适的培养基可获得自商业供应者或可根据公开的组合物来制备。如果该多肽分泌进入培养基，该多肽可从培养基直接回收。如果该多肽不分泌进入培养基，它可从细胞裂解物回收。

多肽可利用本领域已知的特异于该多肽的方法来检测。这些检测方法可包括特异抗体的使用，酶产物的形成，或酶底物的消失。例如，酶活性测定可如在此说明的用来测定多肽的活性。

在优选的方面，本发明采用来源于大豆的粉末磷脂为底物来测定该多肽的活力大小，该方法以大豆粉末磷脂为反应底物，通过本发明多肽的催化其产生游离脂肪酸。而后采用常规的酸碱滴定的方法，用50mM的KOH或NaOH溶液进行滴定，从而定量得到产生的游离脂肪酸的量。

本发明所描述的多肽可利用本领域已知的方法来回收。例如，多肽可通过常规方法，包括但不限于离心、过滤、超滤、萃取、层析、喷雾干燥、冷冻干燥、蒸发或沉淀等从培养基回收。

本发明的多肽可通过本领域已知的多种方法来纯化，包括但不限于色谱法(如离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦、分子排阻)，电泳法(例如等电聚焦)、差异溶解度(如盐析沉淀)、SDS-PAGE或萃取法以获得基本上纯的多肽。

多肽的性能及用途

本发明多肽在酸性范围内对大豆粉末磷脂的水解能力比较强，其在pH4.0时的活力最强，见附图5。在碱性区域如pH8.0时也具有一定的磷脂酶活性。在pH4-7的范围内，脂肪酶活性几乎可以忽略。因此，当使用本发明的多肽水解磷脂时，优选使反应体系的pH在3.5～6.0的范围之内。

本发明的多肽在37℃-60℃的温度范围内均具有很强的水解大豆粉末磷脂的能力，其在45℃附近的活性最高，见附图6。另外，在37℃-60℃的温度范围内，该多肽的脂肪酶活性几乎可以忽略。

2.5mM的钙离子可以提高本发明多肽的磷脂酶活性，而钴离子和镍离子则较强烈地抑制了对本发明多肽的磷脂酶活性，具体结果见附图7。另外，这些金属离子及EDTA存在的条件下，本发明多肽的脂肪酶活性都非常低，可以忽略。因此，在一个具体实施例中，通过向含本发明多肽的反应体系中加入钙离子，例如1.0～3.0mM的钙离子，可提高本发明多肽的磷脂酶活性。因此，本发明也包括一种提高本发明多肽磷脂酶活性的方法，该方法包括向含该多肽的反应体系中加入钙离子，例如加入1.0～3.0mM的钙离子。

本发明多肽在pH3.0至pH10.0的范围内的稳定性都比较好，4-8℃条件下放置17小时后其活性最低也能保持80％以上，见附图8。

本发明多肽的热稳定性也非常好，在60℃及其以下温度孵育1个小时后，活性仍能保持80％以上，见附图9。

另外本发明所提供的多肽可以作用于大豆粉末磷脂中的几乎所有的脂肪酰基磷脂类物质，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇以及溶血磷脂类，见附图10。

本发明所提供的多肽为磷脂酶，可以水解大豆粉末磷脂中的几乎所有的成分，在水解过程中不产生溶血磷脂产物，因此应该是一种磷脂酶B。

本发明所提供的磷脂酶能够催化水解大豆混合磷脂中几乎所有的磷脂成分；在适合磷脂酶作用的条件下其脂肪酶活力非常低几乎可以忽略；催化磷脂水解的效率要 高于现有的磷脂酶A。通常的脱胶工艺是植物油精炼工艺的初始工艺环节之一。因此，此时的油脂样品中会含有游离脂肪酸、不同类别磷脂胶状物等杂质。为此油脂的粘度也会非常高，在脱胶时需要加热以提高油脂的流动性以及增加酶与底物的作用。因此，在油脂酶法脱胶工艺中，通常要求所使用的酶能够在酸性或偏酸性条件下作用。脱胶酶能够具有较好的热稳定性，以及具有广泛的底物作用活性等。本发明所提供磷脂酶的最适合作用pH为4.0,具有良好的热稳定性，其同时还具有能够作用于多种不同类别磷脂底物的特性。另外，本发明磷脂酶与其它磷脂酶A1或磷脂酶A2不同，其在作用的过程中直接产生甘油磷酰胆碱等水溶性非常好的产物而非具有一定乳化特性的溶血磷脂，因而其脱胶效率会更优于普通的磷脂酶A1或A2。综上所述，本发明磷脂酶非常适合于油脂脱胶工艺中。

因此，本发明的磷脂酶可应用于油脂精炼、磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药工业等多个方面，包括但不限于用于烘烤、用于洗涤剂、改善水溶液或糖浆的过滤性以及制备溶血磷脂等。本发明的磷脂酶还可以应用于奶酪生产工艺中。

本发明的多肽可以纯的酶制品的形式提供，也可以组合物的形式提供。组合物可以是粉末组合物，也可以是液体组合物，或糊状组合物。以组合物形式提供时，根据该含酶组合物的不同用途，该组合物可含有不同的辅料。可将本领域已知的辅料添加到本发明的组合物中，这类辅料包括但不限于山梨醇、山梨酸钾、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、蔗糖、甘露糖、海藻糖、淀粉、氯化钠、氯化钙等稳定剂或其他物质中的一种或多种。

本发明也提供一种使用本发明多肽进行油脂精炼、磷脂改性、改良饲料、食品制备、药品制备的方法，所述方法(以及本文中提及的使用本发明多肽的其它方法)优选在以下条件下进行：

(A)温度为37℃-60℃，优选为45±5℃；和/或

(B)pH为3.7-7.0，优选3.4-4.5；和/或

(C)0-3.0mM的钙离子。

本发明还提供一种水解磷脂的方法，该方法包括使含磷脂的成分与本发明的多肽接触。优选的接触条件如上文(A)－(C)点所述。优选的磷脂是大豆磷脂。

本发明方法中使用的本发明多肽的量可根据实际情况加以确定。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989)所述的条件，或按照 制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。

磷脂酶活力检测方法-滴定法：

称取7g的大豆粉末磷脂加入至100ml的4％的聚乙烯醇溶液中，而后进行高速剪切乳化，得到约7％的大豆粉末磷脂底物溶液。

取4ml的上述大豆粉末磷脂底物溶液，加入5ml的0.2M pH值为4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，最后再加入1ml的一定活力的本发明多肽或商品磷脂酶。空白对照管则加入1ml的蒸馏水。而后放置于40℃水浴振荡器中，150rpm振荡反应1小时后取出，立即加入15ml的无水乙醇终止反应。

而后用pH计精确测定空白对照管的pH值，样品管则用0.05M KOH溶液滴定至空白管的pH值，记下所消耗的KOH的体积数，并由此计算出反应所产生的游离脂肪酸的量，再根据反应时间、体积等参数计算得到每个样品的酶活力值。

脂肪酶活力检测方法-滴定法：

量取25ml的橄榄油加入至75ml的4％的聚乙烯醇溶液中，而后进行高速剪切乳化从而得到25％的橄榄油底物溶液。

取4ml的上述橄榄油底物溶液，再加入5ml的0.2M pH值为4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，最后再加入1ml的一定活力的本发明多肽。空白对照管则加入1ml的蒸馏水。而后放置于40℃水浴振荡器中，150rpm振荡反应1小时后取出，立即加入15ml的无水乙醇终止反应。

而后用pH计精确测定空白对照管的pH值，样品管则用0.05M KOH溶液滴定至空白管的pH值，记下所消耗的KOH的体积数，并由此计算出反应所产生的游离脂肪酸的量，再根据反应时间、体积等参数计算得到每个样品的脂肪酶活力值。

培养基：

LB培养基：1wt％胰蛋白胨，0.5wt％酵母提取物，1wt％NaCl；

YPD琼脂培养基：1wt％酵母提取物，2wt％蛋白胨，1wt％葡萄糖，1-2％琼脂；

YPD培养基：1wt％酵母提取物，2wt％蛋白胨，1wt％葡萄糖；

BMGY液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，pH7.0，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油；

BMMY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，pH7.0，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇)。

实施例1：本发明多肽野生酶的分离纯化和部分氨基酸序列信息鉴定

取2支新鲜培养的枝孢霉WBRD00050(CGMCC No.7508)斜面(PDA培养基28℃培养120h)，每支斜面中加入10ml的无菌水，充分洗涤获得孢子悬浮液，合并所有的孢子悬浮液。而后按照1ml/瓶的接种量将孢子悬浮液接种至发酵摇瓶中。发酵摇瓶为250ml规格，装液量为50ml。发酵摇瓶的培养条件为：28℃、200rpm，培养时间为120小时。

发酵培养基的组成如下：

蔗糖1％，蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.5％，玉米浆0.5％，Na₂HPO₄0.25％，KH₂PO₄0.15％，硫酸镁0.1％，七水合硫酸锌0.2％，无水氯化钙0.1％，硫酸铵0.1％，吐温800.2％，大豆粉末磷脂0.5％，玉米粉0.5g/摇瓶。

收集培养好的发酵液，用滤纸过滤除去菌丝体，得到澄清的发酵清液约800ml。而后使用10KDa的超滤膜(Omega，美国PALL公司)进行超滤浓缩并置换成20mM Tris-HCl pH8.0的缓冲系统，获得浓缩的酶液约80ml。

采用5ml的DEAE FF预装色谱柱(Novoprotein，上海近岸科技有限公司)对上述浓缩酶液进行层析纯化。层析条件如下：

缓冲液A：20mM Tris-HCl pH8.0

缓冲液B：20mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl

流速：2ml/min

梯度：0-100％缓冲液B，60倍柱体积

收集：每2ml收集

采用平板法(参考Kim M.K.等人的1994年发表的文献，Biotech.Tech.1994，8(9):635-638)检测每个收集样品管是否具有磷脂酶活性。

收集平板法检测活性相对较高的样品管，用分子量为10KDa的离心超滤管(Ultra，密理博公司)浓缩至2ml左右。

将上述的2ml的浓缩液用凝胶过滤层析法(层析柱为HiloadTM16/60Superdex TM100pg，GE Healthcare)进行纯化，层析缓冲液为含有0.15M NaCl的20mM Tris-HCl pH7.50溶液。层析流速为0.7ml/min，按照1ml/管的量进行收集。

对收集的样品管同样采用平板法进行检测，方法同上。合并含有磷脂酶活性的样品管，加入5倍体积的20mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液进行稀释。而后采用高效的离子交换层析柱进行层析分离，层析条件如下。

层析柱：MonoQ TM 4.6/100PE，GE Healthcare

缓冲液A：20mM Tris-HCl pH8.0

缓冲液B：20mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl

流速：1ml/min

梯度：0-100％缓冲液B，90倍柱体积

收集：每2ml收集

用上述的平板法对每个样品管进行活性检测，而后对活性较高的样品管进行SDS-PAGE检测。选择SDS-PAGE纯度较高的样品管进行活性酶谱电泳，结果见附图1，图中第1栏显示Marker，第2栏显示酶的SDS-PAGE电泳结果，第三栏显示活性酶谱电泳结果，箭头显示底物被酶消化。

酶谱分析的方法参考Cadirci(Cadirci B.H.，Yasa I.，An organic solvents tolerant and thermotolerant lipase from Pseudomonas fluorescens P21.J.Mol.Catal.B:Enzym.2010，64:155–161)，Yadav(Yadav R.P.，Saxena R.K.，Gupta R.等，Rapid zymogram for lipase.BioTechniques 1998，24(5):754–756)，Masayama(Masayama A.，Kuwana R.，Takamatsu H.等，A Novel Lipolytic Enzyme，YcsK(LipC)，Located in the Spore Coat of Bacillus subtilis，Is Involved in Spore Germination.J.Bacteriol.2007，189(6):2369–2375)等人脂肪酶酶谱检测方法基础上建立的。该检测方法与普通SDS-PAGE在凝胶准备、上样和电泳过程等都基本相同。不同的是该方法在电泳样品准备阶段使用的上样缓冲液中不含有DTT或2-巯基乙醇等还原剂，另外电泳样品只是室温放置不能加热或煮沸变性；酶谱检测方法在电泳时与普通SDS-PAGE不同的是要使得电泳过程尽可能少产热，因此可以在90V或更低的电压下电泳。在电泳结束后将含有待检测样品的凝胶放置于0.5-2.5％的Triton X-100缓冲液中进行两次室温振荡，每次30min。而后取出凝胶用20mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液洗涤3次每次10min以除去残余的Triton X-100并实现酶蛋白的复性。而后将该凝胶置于磷脂平板上，而后于37℃放置数小时后即可用肉眼观察到明显白色条带。

小心从SDS-PAGE胶上切出目标蛋白条带，而后送样至上海博苑生物科技有限公司进行LC-MS/MS质谱鉴定法对该条带的蛋白进行鉴定。经过数据分析，得到了三个可靠的肽段信息如下，因为亮氨酸和异亮氨酸的分子量相同，所以其以小写的i表示。

肽段1：DATGiGTPEAEYiASR

肽段2：YQPVEVPCPDTALiVR

肽段3：EGAGFDTTiiDPWGR

实施例2：本发明多肽编码多核苷酸序列的克隆

根据Qiagen RNeasy Plant Mini Kit说明书操作，提取枝孢霉WBRD00050的总RNA。根据Promega Reverse Transcription Kit说明书操作，将RNA反转录为cDNA。 而后根据实施例1中所得的三个肽段的氨基酸序列信息设计兼并引物。SEQ ID NO:3是根据肽段1中的PEAEY序列设计的上游引物，其简并度为128。SEQ ID:4是根据肽段2中的YQPVE序列设计的上游引物，其简并度为128。SEQ ID NO:5是根据肽段3中的GAGFD序列设计的上游引物，其简并度为256。

以SEQ ID NO:3-5作为上游引物，以oligo dT作PCR的下游引物，以上述制备的cDNA为模板进行PCR。PCR条件为：Ex Taq 0.5μl，10×Ex PCR缓冲液5μl，dNTP混合物6μl，上游引物1μl，oligo dT 1μl，cDNA 1μl，水33.5ul。反应条件：95℃5min，35个循环(95℃30s，50℃30s，72℃2.5min)，72℃10min，16℃保温。所得阳性PCR产物胶回收后，直接送至上海生工生物工程有限公司测序。

经测序，以SEQ ID NO:4作为上游引物进行PCR反应所获的序列的长度最长，其包括了SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5作为上游引物的PCR产物。经过ORF阅读框寻找后发现其编码的多肽序列如SEQ ID NO:6所示。其相应的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

根据SEQ ID NO:7的结果，采用RLM-RACE Kit(Invitrogen)进行5’端序列的克隆，从而得到完整的目标蛋白的编码多核苷酸序列，见SEQ ID NO:1，该基因命名为cspl。

实施例3：本发明多肽表达载体及工程菌的构建

SignalP 4.1server软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对SEQ ID NO:2所示的多肽进行分析，结果确定第1-20位的氨基酸序列为信号肽序列。而后以去除信号肽的序列为基础，进行引物的设计，上游引物见SEQ ID NO:8，下游引物为SEQ ID NO:9。

以实施例2中所制备的cDNA为模版，用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的上下游引物作为引物进行目标序列的克隆。

使用1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化目标条带，并使用美国OmegaBio-Tek公司的E.Z.N.ATM胶回收试剂盒进行目标条带的回收。胶回收产物用Avr II和Not I两种限制性内切酶进行酶切反应，而后用OmegaBio-Tek公司的E.Z.N.ATM的产物回收试剂盒回收酶切产物。同时进行pPIC9K载体的酶切及酶切产物回收。

各取适量的上述两种回收的酶切产物进行混合，加入一定量的连接酶和连接酶缓冲液后，放置于22℃水浴中反应2小时左右。

取出1根装有100μl DH5α感受态细胞，冰浴融化后，相应加入20μl的连接产物，冰浴30min。而后于42℃热激90秒后，立即放置于冰浴中1-2min后，往每管 中加入880μl的LB培养基。而后于37℃，200rpm摇床进行预培养60min左右。而后于12000rpm离心3min后，去除部分清液，留约100ul清液，充分悬浮沉淀菌体后，取全部液体涂布于相应的含卡那霉素的平板上，37℃培养过夜。

取出培养过夜的转化平板，挑选部分菌落进行菌落PCR验证，挑选菌落PCR验证结果为阳性的重组子扩大培养。而后提取重组质粒，该质粒即为构建成功的表达载体，命名为pPIC9K-cspl，其结构见附图2所示。

将重组质粒用Sac I限制性内切酶线性化，而后使用OmegaBio-Tek公司的E.Z.N.ATM的产物回收试剂盒回收酶切产物。取酶切产物5μl分别与100μl新鲜毕赤酵母GS115感受态菌体混匀，移取至冰预冷的电转杯中，冰浴5min。以1.5kV、25μF、400Ω条件电击1次，立即加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，并移取菌液涂布于YPD琼脂培养基平板上。置于28℃培养48-55h，至单菌落出现。将经过鉴定为阳性的重组菌命名为GS115-pPIC9k-cspl。

实施例4：重组酶的制备

将上述构建好的重组菌GS115-pPIC9k-cspl接种至30ml YPD液体培养基(培养GS115空宿主作为对照)。28℃，200rpm培养30-40h。取少量菌液接种至30ml BMGY液体培养基中，而后于28℃、200rpm摇至OD600达到2-6。

1500-3000g、4℃离心5min，收集细胞，去除上清，用30ml BMMY培养基等体积重悬细胞，28℃、200rpm条件下培养，使用0.5％甲醇进行诱导表达。每24h，加甲醇至终浓度为0.5％以继续诱导。

取lml诱导72h后的菌液，10000r/min离心1min，收集发酵上清液。而后用10KDa的离心超滤管浓缩并置换缓冲液，而后进行SDS-PAGE电泳分析，结果见附图3。

收集诱导的发酵液，8000rpm离心去除菌体，收集上清液即为制备好的本发明多肽的重组蛋白CSPL(SEQ ID NO:2第21－565位)。

实施例5：本发明多肽的酶学性质

(1)本发明多肽催化磷脂酰胆碱的产物TLC分析

用实施例4所制备的本发明多肽的重组蛋白水解磷脂酰胆碱(PC)。将0.01ml酶液、0.5ml的0.2M pH值4.5乙酸-乙酸钠缓冲液、0.5ml的4％磷脂酰胆碱水溶液(使用纯度超过98％的磷脂酰胆碱，购自阿拉丁试剂有限公司)混合，于40℃水浴，反应1小时左右。同时做一商品PLA1的对照样品。

反应结束后，加入1ml的正己烷进行萃取，振荡混匀，12000rpm离心2分钟， 取出上层有机相部分，加入至一新管中。取下层水相重复萃取、离心操作，收集、合并两次的正己烷萃取液，开盖，置于通风橱中将有机相挥发完全。每管中加15ul异丙醇，充份溶解。取5μl点层析板。进行TLC检测(TLC检测方法参见文献Toida J.等人.Bioscience Biotechnology Biochemistry，1998，62(4):759-763)，结果见附图4。

由附图4可以看出，本发明多肽和商品PLA1催化磷脂酰胆碱都产生大量的游离脂肪酸，说明本发明多肽是一种PLA或PLB类磷脂酶。

(2)pH值条件对本发明多肽磷脂酶及脂肪酶活力的影响

配制0.2M的pH值分别为3.0、4.0、5.0和6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液；配制0.2M的pH值为7.0和8.0的Tris-HCl缓冲液；配制0.2M浓度的pH值为9.0和10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

按照前述的滴定法检测磷脂酶和脂肪酶活力的方法分别检测在以上不同pH条件下的磷脂酶和脂肪酶活力值。以最高磷脂酶活力的pH点的磷脂酶活作为100％，其它pH的磷脂酶酶活除以该最高酶活，从而得到该pH的相对磷脂酶酶活，以相对磷脂酶酶活为纵坐标，pH值为横坐标，以平滑曲线依次连接各pH的相对磷脂酶酶活。以最高磷脂酶活力的pH点的磷脂酶活作为100％，所有pH的脂肪酶活除以该最高磷脂酶酶活，从而得到各pH的相对脂肪酶酶活，以相对脂肪酶酶活为纵坐标，pH值为横坐标，以平滑曲线依次连接各pH的相对脂肪酶酶活。本发明多肽在不同pH值条件下的相对磷脂酶酶活及相对脂肪酶酶活结果见附图5。

由附图5可以看出，本发明多肽在pH4.0时的磷脂酶活力最高，在pH8.0和pH3.0时的脂肪酶活力最高，但是仍没有达到10％的磷脂酶活力。在其他pH值时的脂肪酶活力较低几乎可以忽略。

(2)温度对本发明多肽的脂肪酶及磷脂酶活力的影响

分别在37℃、45℃、50℃、55℃和60℃一系列的温度下测定实施例4制备所得的本发明多肽的磷脂酶活力及脂肪酶活力。检测方法为滴定法，以最高磷脂酶酶活的温度点的磷脂酶酶活作为100％，其它温度点的磷脂酶活除以该最高酶活，从而得到该温度点的相对磷脂酶酶活，以相对磷脂酶酶活为纵坐标，温度点为横坐标，以平滑曲线依次连接各温度点的相对酶活，将这些相对酶活以平滑曲线连接，结果见图附图6。以最高磷脂酶酶活的温度点的磷脂酶酶活作为100％，所有温度点的脂肪酶酶活除以该最高磷脂酶酶活从而得到该温度点的相对脂肪酶酶活，以相对脂肪酶酶活为纵坐标，温度点为横坐标，以平滑曲线依次连接各温度点的相对酶活，将这些相对酶活以平滑曲线连接，结果见图附图6。

图6结果显示，本发明多肽的最适合作用温度为45℃。在几乎所有的温度条件下，本发明多肽的脂肪酶酶活力几乎可以忽略。

(3)金属离子及EDTA对本发明多肽的脂肪酶及磷脂酶活力的影响

分别配制250mM的钙离子、镁离子、锰离子、锌离子、钴离子、铜离子、镍离子、铁离子母液，配制250mM的EDTA母液。将上述母液分别按照2.5mM的量加入至磷脂酶和脂肪酶的反应体系中，测定酶活。以不添加任何离子及EDTA的样品所测的磷脂酶酶活力值为100％，作为对照，计算其它添加物的样品磷脂酶及脂肪酶的相对活力值，结果见附图7。

由附图7可以看出，2.5mM的钙离子可以显著提高本发明多肽的磷脂酶活性，提高幅度超过20％。而钴离子和镍离子则较强烈地抑制了对本发明多肽的磷脂酶活性，其活性相应下降超过50％和60％。另外，在这些金属离子及EDTA存在的条件下，本发明多肽的脂肪酶活性都非常低，基本可以忽略。

(4)本发明多肽的pH稳定性

将实施例4中所制备的本发明多肽与4倍体积的0.2M浓度的pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0一系列不同pH值的缓冲液进行混合后，置于4℃的环境中放置17小时后，按照前述的滴定法进行磷脂酶活力的测定。以实施例4中所制备的多肽的磷脂酶活力值为100％，计算各个pH值残留酶活力的相对值，以残留酶活力相对值为纵坐标，pH值为横坐标，以平滑曲线依次连接各pH的相对酶活，结果见图8。

图8的结果显示，本发明制备所得的多肽在pH3.0-10.0的范围内均比较稳定，其在pH10.0的体系里放置17个小时后仍能保留80％左右的活力。

(5)本发明多肽的温度稳定性

将酶液按照500μl量分装成若干小份，分别放置于4℃、37℃、45℃、50℃、55℃和60℃的水浴锅中保温1小时。而后用滴定法法进行磷脂酶活力的检测，以未孵育的样品的磷脂酶活力值为100％，其它温度点的磷脂酶酶活除以该酶活力值从而得到其相对酶活值，以相对酶活为纵坐标，温度为横坐标，以平滑曲线连接各温度点的相对酶活，结果见附图9。

图9的结果显示本发明多肽具有较好的热稳定性，在60℃孵育1小时后仍能保持超过85％的磷脂酶活力。

(6)本发明多肽对大豆粉末磷脂底物水解的TLC检测

取实施例4所制备的本发明多肽10μl加入至1ml体积的2％含量的pH4.5的大豆粉末磷脂底物溶液中，45℃反应5个小时后，加入1ml的氯仿进行萃取。经过离心 后，取出下相0.5ml置于通风橱中风干。风干结束后加入50μl体积的氯仿/甲醇溶液(95:5v/v％)进行溶解，而后取5μl进行点样进行薄层层析分析，结果见附图10。

取实施例4所制备的本发明多肽1μl，加入至1ml体积的2％含量的pH4.5的磷脂酰胆碱底物溶液中，45℃反应1个小时后，加入1ml的氯仿进行萃取。经过离心后，取出下相0.5ml置于通风橱中风干。风干结束后加入50μl体积的氯仿/甲醇溶液(95:5v/v％)进行溶解，而后取5μl进行点样进行薄层层析分析。同时用商品的磷脂酶A2作为对照，薄层层析结果见附图10。

磷脂的TLC检测方法参考Nzai J.M.等人1998年发表的文献(Nzai J.M.，Proctor A.Food Chemistry，1998，63(4):571-576)。

由附图10的结果看出，本发明多肽几乎可以水解大豆粉末磷脂中的所有磷脂成份。本发明多肽在水解磷脂酰胆碱的过程中不产生溶血磷脂。