一种猪伪狂犬病毒株的制作方法

本发明涉及一种猪伪狂犬病毒毒株。

背景技术：

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(PRV)所引起的家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。该病1813年首见于美国，由于其临床表现与狂犬病类似，故称为伪狂犬病。1902年，匈牙利学者Aujeszky首先报道了该病，因此该病亦被命名为Aujeszky氏病。猪是该病的自然宿主和主要传染源，PRV可以感染不同年龄段的猪，但以妊娠母猪和哺乳仔猪感染最为严重：导致妊娠母猪流产、死胎以及木乃伊胎；初生仔猪出现明显的神经症状、麻痹、衰竭死亡，多为急性致死性经过，死亡率几乎高达100％。该病广泛分布于世界各国。我国刘永纯1947年首先从猫体内分离到该病毒。该病在我国流行已相当广泛，许多猪场发生过此病，是母猪繁殖障碍、仔猪死亡率高的主要原因之一。特别是近些年，随着我国养猪业集约化、规模化的发展，猪伪狂犬病在不少地区暴发流行，并有逐渐扩大蔓延的趋势，给养猪业造成巨大威胁，严重阻碍了我国养猪业的可持续发展。自发现本病以来，已对其进行了极其广泛的研究，并取得了很大进展，目前很多国家已成功根除或控制了该病，对该病的研究和防控也已成为研究分子病毒学和成功控制病毒病的典范。

在生产实践中，主要依靠疫苗尤其是基因工程缺失疫苗对PR进行防制，从而使该病得到有效控制。2012年春季以来，在河南、吉林、黑龙江等多地区使用PRV基因缺失苗免疫的猪场出现疑似PR病例，母猪产弱仔、死胎或木乃伊胎，仔猪出现神经症状、死亡，死亡率达10％～50％，给我国养猪业造成了巨大经济损失。因此从河南免疫猪场送检的临床样品中，分离并鉴定PRV河南流行株，阐明河南省猪群中PRV流行毒株的遗传变异情况，并进行相关生物学特性研究就显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病毒株，分类命名：疱疹病毒科猪疱疹病毒I型猪伪狂犬病毒PRV／HN2012，拉丁文学名：Herpesviridae。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏日期：2013年5月28日，保藏编号CCTCC NO：V201314。

本发明的技术方案是：一种猪伪狂犬病毒株，猪伪狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCC NO：V201314。

本发明的有益效果是：本发明将PRV/HN2012株传至第7代，并对第7代病毒进行了病毒滴度TCID50的测定，结果TCID50为109.0。并将PRV/HN2012株接种小鼠，攻毒24h后，PRV/HN2012株感染组小鼠即出现神经症状，攻毒48h后，小鼠全部死亡，表明该毒株具有很强的毒性。基于此，通过对PRV/HN2012株理化特性研究，结果表明该毒株对分析纯氯仿敏感，属于有囊膜病毒；对酸、碱有较强的抵抗力，pH3.0的盐酸、pH 11.0的NaOH处理1h使其失活；对热有较强抵抗力，56℃水浴处理1h才能失活；对胰蛋白酶敏感，紫外线处理30min，对其感染性影响不明显(表1)。这些理化特性均符合猪伪狂犬病毒的理化特性。经电镜观察，可看到大小均一、近似圆形的病毒粒子，大小约110～150nm，囊膜表面有呈放射状排列的纤突，与已报道的PRV形态基本吻合。因此，本发明成功分离出PRV/HN2012株，并对PRV/HN2012株进行了理化特性试验和形态学观察，为控制猪伪狂犬病在河南的流行提供了理论依据。

附图说明

图1为组织病料中PRV的PCR扩增结果,M.DNA Marker DL2000；1-9.病料中PRV的PCR产物；10.阴性对照。

图2为感染分离毒PRV的ST细胞(100×),A.正常的ST细胞对照；B.分离毒PRV感染的ST细胞。

图3为PRV gE基因扩增结果,M.DNA Marker DL2000；1-3.PCR产物；4.阴性对照。

图4为PRV PRV/HN2012株电镜照片。

图5为PRV gE全基因扩增结果,M.DNA Marker DL2000；1-4.PCR产物；5.阴性对照。

图6为重组质粒PCR鉴定,M.DNA Marker DL2000；1-9.PCR产物；N.阴性对照。

图7为重组质粒的酶切鉴定图,M.DNA Marker DL5000；1-3.重组质粒经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切产物；4.空载质粒的酶切产物(阴性对照)。

图8为PRV不同分离株gE全基因的核苷酸序列同源性分析。

图9为PRV gE基因推导的氨基酸序列的比较。

图10为PRV分离株gE基因核苷酸序列的系统进化树。

图11为PRV gC基因的PCR扩增,M.DNA marker DL2000；1.PCR产物；2.PCR产物；3.阴性对照。

图12为重组质粒PCR鉴定,M.DNA Marker DL2000；1-4.PCR产物；5.阴性对照。

图13为重组质粒的酶切鉴定图,M.DNA Marker DL5000；1-2.空载质粒的酶切产物(阴性对照)；3-4；重组质粒经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切产物。

图14为PRV不同分离株gC全基因的核苷酸序列同源性分析。

图15为PRV gC基因推导的氨基酸序列同源性分析。

图16为PRV分离株gC基因核苷酸序列的系统进化树。

具体实施方式

一种猪伪狂犬病毒毒株，分类命名：疱疹病毒科猪疱疹病毒I型猪伪狂犬病毒PRV／HN2012，拉丁文学名：Herpesviridae。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏日期：2013年5月28日，保藏编号CCTCC NO：V201314。

本发明采用PCR方法对河南采集的疑似PR的病料进行PCR检测，通过接种猪睾丸(ST)细胞分离到1株病毒，命名为HN2012。通过观察细胞病变、生物学特性研究、电镜观察病毒的形态等途径证实分离病毒为猪伪狂犬病毒。

将PRV/HN2012株病毒液，经甲醛灭活后与弗氏佐剂混合制成油乳剂，接种健康6周龄雌性昆明小鼠，同时设置Bartha-K61疫苗株商品苗、湖北98疫苗株商品苗免疫组以及阴性对照组，28d后采血分离血清，分别进行血清中和试验，检测中和抗体水平，并用PRV/HN2012株进行攻毒保护试验，结果PRV/HN2012株灭活油乳剂免疫组小鼠完全保护，表明PRV/HN2012具有良好的免疫原性。

一、猪伪狂犬病毒PRV/HN2012的分离鉴定和生物学特性研究

1材料与方法

1.1材料

1.1.1组织病料、细胞株及实验动物

病料来源于河南PR免疫猪场疑似PRV感染的临床发病样品，于2013年3月采集，包括病死仔猪的脑、肝脏、脾脏和淋巴结。猪睾丸(ST)细胞购自中国兽药监察所，由本发明室冻存。6周龄雌性昆明小鼠购自河南省实验动物中心。

1.1.2 主要试剂

Prime GXL酶、EX Taq酶、DNA Marker DL2000等购自大连宝生物工程有限公司； RPM-1640培养液、胎牛血清、胰蛋白酶等购自索莱宝科技有限公司。琼脂糖购自Promega公司；蛋白酶 K购自华美生物工程公司；乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、十二烷基硫酸钠（SDS）、饱和酚、氯仿、异戊醇购自上海生物工程有限公司。

1.2 引物设计

参照GenBank中发表的PRV gH（X61696）、gE（AF171937）基因序列，使用引物设计软件设计了2对引物，引物P1和P2用于扩增部分gH基因，目的片段长度为352 bp，引物P3和P4扩增片段长度为425 bp，用于扩增部分gE基因，引物由上海生物工程有限公司合成。

P1：5'-GCGTGTGCGACTGCGTGTT-3'，

P2：5'- CCTGGCGTTTATTAACCGAGA-3'；

P3：5'- TACACGTTCGACCTGATG-3'

P4：5'- CCTTGACCGTGACGTACT-3'。

1.3 组织病料中PRV DNA的PCR检测

取采集的脑、淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏等组织剪碎、混合后研磨成匀浆，加入PBS液（含1000单位的青、链霉素），制成10%~30%的悬液，反复冻融3次。取上清液400 μL，采用蛋白酶K法提取DNA。以病料组织DNA为模板，进行PCR扩增。在PCR反应体系中，模板DNA 3 μL，上、下游引物P1/P2各0.5 μL，Taq DNA聚合酶12 μL，补水至25 μL；混匀瞬时离心后进行PCR扩增。PCR扩增程序为95℃ 5 min；94℃ 1 min，53℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min; 4℃10 min。反应结束后，取5 μL PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L EB）进行电泳检测PCR的结果。

1.4 病毒的分离与培养

将PCR检测为阳性的病料匀浆液，经8000 r/min离心10 min，在上清液中加入双抗，4℃作用12 h，经0.22 μm的细菌滤器过滤除菌后分别接种ST细胞，37℃吸附2 h后弃上清，加入适量的含2%胎牛血清的RPMI-1640维持液继续培养72 h后收获病毒。并在ST细胞上连续培养传至第6代。培养过程中同时设立不接毒的细胞培养物作为阴性对照。传代过程中，利用PRV特异性引物P1/P2，定性检测有空泡病变的ST细胞中PRV。

1.5 PRV gE基因的检测

将收获的PRV细胞毒，冻融3次以裂解细胞，6000 r/min离心6~8 min，取上清抽提DNA，方法同1.3。以提取的细胞毒DNA为模板，用引物P3/P4进行PCR扩增。在PCR反应体系中，模板DNA 3 μL，上、下游引物P3/P4各0.5 μL，二甲基亚砜（DMSO） 1 μL，Ex Taq Mixture 12 μL，补水至25 μL ；PCR扩增程序为94℃5 min；95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃8 min，4℃10 min。反应结束后，取5 μL PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L EB）进行电泳检测PCR的结果。

1.6 病毒滴度TCID50的测定

将消化吹散的ST细胞悬液接种到96孔板中，每孔200 µL，培养24 h后，分别取PRV不同毒株的第7代细胞培养物连续倍比稀释10^-1～10^-10，每孔接种100 µL，在细胞培养箱中孵育1 h后，每孔加入100 µL含2%胎牛血清的RPMI-1640维持液继续培养，每个稀释度各作8个重复，逐日观察细胞病变情况，并按照Reed-Muench法计算病毒滴度TCID50。

1.7 PRV感染小鼠试验

将20只6周龄雌性昆明小鼠分成2组，一组将分离株的第7代细胞培养物接种小鼠，500 µL/只，肌肉注射，空白对照组小鼠接种细胞培养液，500 µL/只，肌肉注射。逐日观察小鼠的发病及死亡情况。

1.8 PRV/HN2012株理化特性研究

取8只灭菌的EP管，在超净台内分别加入500 µL PRV/HN2012株第7代细胞液。第1管加入终浓度为4.8%的分析纯氯仿混合振荡，置于4℃作用30 min，随后用500 rpm/min的速度离心5 min，然后吸取上层液体；第2管用0.1 mol/L的盐酸调pH至3.0，于37℃水浴作用1 h，再用0.1 mol/L的NaOH溶液将pH值调回至7.2；第3管用0.1 mol/L的NaOH溶液调pH至11，于37℃水浴作用1 h，再用0.1 mol/L的盐酸溶液将pH值调回至7.2；第4管置于56℃水浴中作用1 h；第5管加入等体积的胰蛋白酶置37℃水浴作用1.5 h后，用4mL灭活胎牛血清终止其作用；第6管加入体积比1%的分析纯甲醛混合震荡，37℃作用2 d，用2000 rpm的速度离心20 min，然后吸取下层液体；第7管紫外照射30 min；第8管不处理作为正常对照。然后分别接种ST传代细胞按常规方法测定其TCID50。

1.9 PRV/HN2012株形态学观察

取200 mL PRV/HN2012株第8代细胞培养物净反复冻融后于4℃下，8000 r/min离心1h，取上清4℃下，30000 r/min离心2 h，沉淀用10 mLpH7.2 0.01 mol/L PBS重悬，再在4℃下，8000 r/min离心1 h，取上清4℃下，30000 r/min离心2 h，最终用20 µL pH7.2 0.01 mol/L PBS重悬沉淀。取10 µL重悬液和10 g/L醋酸铀染液滴于封口膜上，将有支持膜的铜网先置于样品滴上，3-5 min后用镊子夹起，用干净滤纸片从铜网边缘吸去液体，稍干后置于染色液上染色3 min，再用滤纸吸去染液，在Hitachi TEM透射电镜下观察病毒形态并拍照。

2 结果

2.1 组织病料中PRV DNA的PCR检测结果

将疑似PRV感染的病料无菌研磨制成悬液，提取DNA。以提取的DNA为模板，进行PCR扩增。取PCR扩增产物5 μL，用10 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L EB）进行电泳检测，扩增出1条350 bp左右的条带（图1），与预期扩增片段大小相符。

2.2 PRV的细胞培养与细胞病变观察

将PCR检测为阳性的河南病料组织匀浆液用双抗处理，无菌过滤后接种ST细胞，并进行传代。各代次均出现PRV典型的细胞空泡病变，并且利用PRV gE特异性引物，对细胞毒DNA进行PCR扩增，均能检测出PRV gE特异性目的片段，而正常ST细胞核酸为模板进行PCR扩增，结果为阴性。接毒第3代后细胞病变稳定，接毒24 h即出现病毒蚀斑，蚀斑周围细胞变圆，脱落，部分细胞碎片粘附在培养瓶壁上（图2）。接毒72 h后细胞脱落可达75%以上。表明病毒已适应ST细胞，并能在ST细胞上增殖。将分离的PRV命名为PRV/HN2012。

2.3 PRV gE基因的PCR扩增结果

将收获的PRV细胞培养物，冻融3次以裂解细胞，6000 r/min离心6-8 min，取上清抽提DNA，以提取的细胞毒DNA为模板用引物P3/P4从PRV基因组DNA中扩增出1条约为450 bp的片段（图3），与预期扩增结果相一致。

2.4 病毒滴度TCID50结果

对PRV/HN2012的第7代病毒液进行TCID50测定，通过倒置显微镜观察，接毒后3 d待细胞出现变圆、脱落等明显的CPE后，统计并按Reed-Muench方法计算毒株的TCID50，结果为10^9.0。

2.5病毒感染小鼠试验结果

攻毒24 h后，PRV/HN2012株感染组小鼠即出现神经症状，蜷缩痉挛，且咬烂注射点的皮肤，导致局部被毛脱落、皮肤出血。攻毒48 h后，PRV/HN2012株感染组小鼠全部死亡；其他8个毒株感染组小鼠攻毒72h后先后出现神经症状，攻毒120 h后全部死亡。空白对照组小鼠注射144 h后仍健康存活。

2.6 PRV/HN2012株理化特性研究结果

从表1可以看出，分离获得的病毒PRV/HN2012株对分析纯氯仿敏感，属于有囊膜病毒；对酸、碱有较强的抵抗力，pH3.0的盐酸、pH11.0的NaOH处理1 h使其失活；对热有较强抵抗力，56℃水浴处理1 h才能失活；对胰蛋白酶敏感，紫外线处理30 min，对其感染性影响不明显。这些理化特性均符合猪伪狂犬病毒的理化特性。

表1 理化特性的检测结果

2.7 病毒形态学观察结果

将PRV/HN2012株细胞毒做适当纯化处理后，置电镜下观察。可在视野内看到大小均一、近似圆形的病毒粒子，大小约110~150 nm，囊膜表面有呈放射状排列的纤突(图4)，与已报道的PRV形态基本吻合，未见其它形态的病毒粒子。

3 结论与讨论

gE基因是PRV的主要毒力基因之一， gE基因缺失疫苗在病毒侵入神经系统方面被认为比其他单个费必须糖蛋白缺失苗更安全，同时gE基因缺失不会影响病毒的复制和中和抗体的产生，因此被世界动物卫生组织规定为基因缺失疫苗的缺失基因。又由于gE是所有野毒株均表达的一类糖蛋白，因此本研究从河南PR免疫猪场送检的疑似病料中，分离PRV并进行传代培养，通过标志基因gE的扩增，鉴定了所分离的病毒均为野毒株。PRV gE基因的G+C含量高达73%，具有复杂的二级结构，因此gE基因的引物设计和PCR扩增难度较大。本发明参考已公布的Ea株gE基因序列，设计了1对引物，以分离株的DNA为模板，扩增gE基因部分片段（425bp），建立了区分伪狂犬病毒疫苗免疫株和野毒株的特异性PCR扩增方法。

将PCR检测为阳性的河南病料组织研磨、稀释制成匀浆液，用处理后接种ST细胞，分离出PRV/HN2012。接毒第3代后细胞病变稳定，接毒24 h即出现病毒蚀斑，蚀斑周围细胞变圆，脱落，部分细胞碎片粘附在培养瓶壁上（图2B），接毒72 h后细胞脱落可达75%以上。提取细胞毒DNA，利用PRV gE特异性引物，对细胞毒DNA进行PCR扩增，均能检测出PRV gE特异性目的片段，而正常ST细胞核酸为模板进行PCR扩增，结果为阴性。将 PRV/HN2012株接种6周雌性小鼠，均出现典型的PR症状，蜷缩痉挛，且咬烂注射点的皮肤，导致局部被毛脱落、皮肤出血等，这与彭金美等报道的2011年后PRV新分离HeN1株接种小鼠试验结果相似。

本发明将PRV/HN2012株传至第7代，并对第7代病毒进行了病毒滴度TCID50的测定，结果TCID50为10^9.0。并将PRV/HN2012株接种小鼠，攻毒24 h后，PRV/HN2012株感染组小鼠即出现神经症状，攻毒48 h后，小鼠全部死亡，表明该毒株具有很强的毒性。基于此，通过对PRV/HN2012株理化特性研究，结果表明该毒株对分析纯氯仿敏感，属于有囊膜病毒；对酸、碱有较强的抵抗力，pH3.0的盐酸、pH 11.0的NaOH处理1 h使其失活；对热有较强抵抗力，56℃水浴处理1 h才能失活；对胰蛋白酶敏感，紫外线处理30 min，对其感染性影响不明显（表1）。这些理化特性均符合猪伪狂犬病毒的理化特性。经电镜观察，可看到大小均一、近似圆形的病毒粒子，大小约110~150 nm，囊膜表面有呈放射状排列的纤突，与已报道的PRV形态基本吻合。因此，本发明成功分离出 PRV/HN2012株，并对PRV/HN2012株进行了理化特性试验和形态学观察，为控制猪伪狂犬病在河南的流行提供了理论依据。

二、猪伪狂犬病毒PRV/HN2012株gE全基因的克隆与序列分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及载体

感受态细胞DH5α、克隆载体pMD^®18-T均购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.2 工具酶及其它试剂

Prime GXL酶、rTaq酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker DL 2000、IPTG、X-gal、限制性内切酶EcoRⅠ、PstⅠ等购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；蛋白酶 K购自华美生物工程公司；琼脂糖购自Promega公司；乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、十二烷基硫酸钠（SDS）、饱和酚、氯仿、异戊醇购自上海生物工程有限公司。

1.1.3 病毒株

PRV/HN2012株由本实验室分离鉴定并保存。

1.2 引物设计

参照GenBank中发表的gE（AF171937）基因序列，使用引物设计软件设计了1对引物，用于扩增包含gE基因全序列的片段，长度为1855 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

P1：5'- GGTGTGGCGTTTTATCT-3'

P2：5'- TTTGGGCATGTCGGAATG-3'

1.3 病毒DNA的提取及gE全基因的扩增

将收获的PRV细胞毒，冻融3次以裂解细胞，6000 r/min离心6-8 min，取上清，用蛋白酶K法抽提DNA。以提取的细胞毒DNA为模板，用引物P1/P2进行PCR扩增。在PCR反应体系中，模板DNA 0.5 μL，上、下游引物P1/P2各0.5 μL，Primer STAR GXL DNA Polymerase 1μL，5×Primer STAR GXL Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，补水至25 μL ；PCR扩增程序为95℃3 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，68℃ 2 min，35个循环；4℃10 min。反应结束后，取5 μL PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L EB）进行电泳检测PCR的结果。

1.4 PRV gE全基因的克隆和鉴定

将PCR检测结果为阳性的产物回收纯化，将 PRV/HN2012株的基因片段进行加A尾处理后，连接到克隆载体pMD^®18-T中，经连接产物的转化、重组质粒的提取、重组质粒的PCR鉴定、酶切鉴定等过程，对鉴定的阳性克隆进行序列测定，由上海生物工程有限公司完成。

1.5 PRV gE全基因的序列分析

用MEGA4、DNAStar等软件对克隆的PRV gE全基因序列与GeneBank中下载的18株PRV gE全基因序列进行比对分析，对PRV gE全基因及gE糖蛋白的氨基酸序列进行比对分析。所有参考毒株（见表2）均为GenBank上收录的典型毒株。

表2 参考毒株登录号

2 结果

2.1 PRV gE全基因的扩增结果

以提取 PRV/HN2012株细胞毒DNA为模板，用引物P1/P2进行PCR扩增，扩增片段经过琼脂糖凝胶电泳检测，出现1条约1900 bp的带（图5），扩增片段的长度与预期相符。

2.2 PRV gE全基因的克隆及重组质粒的PCR鉴定

将PCR产物回收纯化后，由于扩增全基因时所用酶为Primer GXL，该酶为高保真酶，具有3’到5’核酸外切酶的活性，导致PCR反应之后不会加尾，影响目的基因与T载体的连接效率，因此加A后连接到T载体上，转化连接产物，提取重组质粒，对重组质粒进行PCR鉴定，电泳出现1条约1900 bp的带（图6），与预期大小相符。

2.3 PRV gE全基因重组质粒的酶切鉴定

重组质粒经EcoRⅠ、PstⅠ双酶切，电泳出现2条带：其中一条带为载体质粒，约2 600 bp，另1条带为所克隆的PRV gE全基因片段，约2 000 bp（图7），与预期结果相符。

2.4 PRV gE全基因的测序结果

对PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序，测序报告的PRV/HN2012株gE基因核苷酸序列均为1855 bp，如SEQ ID No：1所示，包含一个完整的开放阅读框。gE基因是PRV的一种糖蛋白基因，位于US区，长1740 bp，编码579个氨基酸，G+C含量为73.91％。

GTGGCGTTTTATCTCCGTCCGCGCCGTTTTAAACCTGGGCACCCCCGCGAGTCTCGCACACACCGGGGTTGAGACCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCTCCACCGAGGCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGACGACGATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTGAGGGAGGCGCCCCCGGCCCATCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGGCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGCCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCGGTGACCACGGTGTGCTTCGAGACCGCGTGCCACCCGGACCTGGTGCTGGGCCGCGCCTGCGTCCCCGAGGCCCCGGAGATGGGCATCGGCGACTACCTGCCGCCCGAGGTGCCGCGGCTCCGGCGCGAGCCGCCCATCGTCACCCCGGAGCGGTGGTCGCCGCACCTGAGCGTCCTGCGGGCCACGCCCAACGACACGGGCCTCTACACGCTGCACGACGCCTCGGGGCCGCGGGCCGTGTTCTTTGTGGCGGTGGGCGACCGGCCGCCCGCGCCGGCGGACCCGGTGGGCCCCGCGCGCCACGAGCCCCGCTTCCACGCGCTCGGCTTCCACTCGCAGCTCTTCTCGCCCGGGGACACGTTCGACCTGATGCCGCGCGTGGTCTCGGACATGGGCGACTCGCGCGAGAACTTTACCGCCACGCTGGACTGGTACTACGCGCGCGCGCCCCCGCGGTGCCTGCTGTACTACGTGTACGAGCCCTGCATCTACCACCCGCGCGCGCCCGAGTGCCTGCGCCCGGTGGACCCGGCGTGCAGCTTCACCTCGCCGGCGCGCGCGCGGCTGGTGGCGCGCCGCGCGTACGCCTCGTGCAGCCCGCTGCTCGGGGACCGGTGGCTGACCGCCTGCCCCTTCGACGCCTTCGGCGAGGAGGTGCACACGAACGCCACCGCGGACGAGTCGGGGCTGTACGTGCTCGTGATGACCCACAACGGCCACGTCGCCACCTGGGACTACACGCTCGTCGCCACCGCGGCCGAGTACGTCACGGTCATCAAGGAGCTGATGGCCCCGGCCCGGGCCCCGGGCACCCCGTGGGGCCCCGGCGGCGGCGACGACGCGATCTACGTGGACGGCGTCACGACGCCGGCGCCGCCCGCGCGCCCGTGGAACCCGTACGGCCGGACGACGCCCGGGCGGCTGTTTGTGCTGGCGCTGGGCTCCTTCGTGATGACGTGCGTCGTCGGGGGGGCCATCTGGCTCTGCGTGCTGTGCTCCCGGCGCCGGGCGGCCTCGCGGCCGTTCCGGGTGCCGACGCGGGCGCGGACGCACATGCTCTCTCCGGTGTACACCAGCCTGCCCACGCACGAGGACTACTACGACGGCGACGACGACGACGACGAGGAGGCGGGCGTCATCCGCCGGCGGCCCGCCTCCCCCAGCGGAGACAGCGGCTACGAGGGGCCGTACGCGAGCCTGGACCCCGAGGACGAGTTCAGCAGCGACGAGGACGACGGGCTGTACGTGCGCCCCGAGGAGGCGCCCCGCTCCGGCTTCGACGTCTGGTTCCGCGATCCGGAGAAACCGGAAGTGACGAATGGACCCAACTATGGCGTGACCGCCAACCGCCTGTTGATGTCCCGCCCCGCTTAAATACCGGGAGAACCGGTCCGCCCGCATTCCGACATGCCC

2.5 PRV分离株 gE全基因序列同源性分析

使用DNAStar软件，将分离的 PRV/HN2012株与GenBank收录的毒株序列中选取18株来自不同国家和地区的PRV毒株进行gE基因序列分析，从图8可以看出， PRV/HN2012分离株与所有PRV毒株之间核苷酸序列同源性均较高，介于97.5%~99.6%，其中与中国Ea 株（AF171937）同源性最高（99.6%），而与比利时00V72株（FJ605133）同源性最低（97.5%）。

2.6 PRV分离株gE全基因推导氨基酸的序列分析

应用DNAStar，将我们分离的PRV/HN2012分离株gE全基因推导的氨基酸序列与河南株（EU561349，HNJZ）以及国内外代表毒株Ea株、P-PrV株、Yangsan株、Becker株等共18株PRV的gE全基因推导的氨基酸序列进行同源性分析，结果显示，PRV/HN2012分离株与国内外其他毒株的同源性介于95.3%~ 99.1%（图9），其中PRV/HN2012分离株与韩国Yangsan株（AY249861）的同源性最高，为99.1%；与比利时NS374株(FJ605135)和00V72（FJ605132）的同源性最低，均为95.3%。与国外Becker（AY368490）、Yangsan（AY249861）、CL/15（JF460026）、00V72(FJ605132)、75V19(FJ605133)、89V87(FJ605134)、NS374 (FJ605135)、NIA-1(FJ605136)、NIA-3 (EU502923) 相比，PRV/HN2012分离株有27处发生了变化，在48位和494位均插入1个天冬氨酸。与国内外其他毒株进行比较，PRV/HN2012分离株在448位和510位发生氨基酸置换（V⁴⁴⁸I，G⁵¹⁰S），而且在385位发生氨基酸置换（T→M）（表3）。

2.7 PRV分离株 gE全基因系统发育进化关系分析

利用软件MEGA5.0中的Boot-strapped Neigh-bor-Joining绘制PRV gE全基因进化树，从PRV gE全基因进化树可以看出，PRV/HN2012与国内的Ea株（AF171937）、GDSH株（EF552427）亲缘关系最近，在同一进化较大的分支内（图10）；与SH株（AF207700）等国内其他5个毒株和马来西亚P-PrV株（FJ176390）、韩国Yangsan株（AY249861）分属同一大的进化分支，遗传关系相对较近；而与欧美分离株00V72株（FJ605132）、89V87株（FJ605134）、78V19株（FJ605133）、NS374株（FJ605135）、Becker株（AY368490）、CL15株（JF460026）、NiA-3株（EU502923）和NiA-1株（FJ605136）分属不同的进化分支，亲缘关系最远。

3 结论与讨论

猪伪狂犬病对仔猪和繁殖母猪危害最为严重，仔猪感染后死亡率为100%，母猪感染引起流产、产死胎。猪伪狂犬病毒基因缺失疫苗在猪伪狂犬病发挥了重要作用，使得该病得到有效控制。尤其自2011年以来，猪伪狂犬病例在我国又呈现出了增长趋势，发病区域迅速扩大，这更加引起了兽医工作者对于该病的高度重视。因此了解目前猪伪狂犬病毒在我国的遗传变异情况是至关重要的，可以对猪伪狂犬病毒的流行状况进行准确的把握，对于该病的防控具有重要意义。

伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科（Herpesuiridae）α-疱疹病毒亚科。PRV的毒力主要由gE、gD、gI和TK协同控制，其中gE基因是PRV的主要毒力基因之一，也是世界动物卫生组织所规定基因缺失疫苗的缺失基因。gE糖蛋白长约1.7kb，含577个氨基酸残基，属于典型的I型跨膜蛋白。gE为病毒复制非必需的糖蛋白，可介导病毒在细胞间的扩散，对PRV在神经系统的侵袭和传播起重要作用。

PRV gE基因的G+C含量高达73%，具有复杂的二级结构，因此gE基因的引物设计和PCR扩增难度较大。本研究参照GenBank中发表的gE（AF171937）基因序列，使用引物设计软件设计了1对引物。通过PCR扩增、克隆，获得PRV/HN2012分离株gE基因序列。毒株全序列进行同源性比较和进化树分析，此PRV/HN2012分离株与其他国内外的分离株之间同源性高达95.3%~99.1%，这表明gE基因具有严格的保守性，同时也说明PCR方法扩增PRV gE基因可靠性良好。通过比较PRV/HN2012分离株与国内外其它毒株gE基因推导的氨基酸序列发现，此PRV/HN2012分离株gE蛋白的氨基酸有27处发生了变化，在48位和494位插入1个天冬氨酸，在448位发生氨基酸置换（V⁴⁴⁸I），并且在385位和510位，仅有PRV/HN2012株发生氨基酸置换（T³⁸⁵M，G⁵¹⁰S）。从构建的进化树中可以看出，PRV/HN2012分离株与国内的Ea株、GDSH株和Yangsan株亲缘关系最近，而与来源欧美的Becker株和NiA3株的gE基因差异较大，亲缘关系较远，这说明PRV/HN2012分离株与近年国内的分离毒株具有较近的亲缘关系。这对于了解河南地区猪伪狂犬病毒的流行情况提供了科学的参考依据。

三、猪伪狂犬病毒河南流行株gC全基因的克隆与序列分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及载体

感受态细胞DH5α、克隆载体pMD^®18-T均购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.2 工具酶及其它试剂

Prime GXL酶、rTaq酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker DL 2000、IPTG、X-gal、限制性内切酶EcoRⅠ、PstⅠ等购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；蛋白酶 K购自华美生物工程公司；琼脂糖购自Promega公司；乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、十二烷基硫酸钠（SDS）、饱和酚、氯仿、异戊醇购自上海生物工程有限公司。

1.1.3 病毒株

PRV/HN2012株由本实验室分离鉴定并保存。

1.2 引物设计

参照GenBank中发表的gC基因序列，使用引物设计软件设计了1对引物，用于扩增包含gC基因全序列的片段，长度为1576 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

P1：5′-GGC GTT TCC TGA TTC AC-3′

P2：5′-GCC CTC GCT GTC GTT TAT TG-3′

1.3 病毒DNA的提取及gC全基因的扩增

将收获的 PRV/HN2012株细胞毒，冻融3次以裂解细胞，6000 r/min离心6-8 min，取上清，用蛋白酶K法抽提DNA。以提取的细胞毒DNA为模板，用引物P1/P2进行PCR扩增。在PCR反应体系中，模板DNA 2 μL，上、下游引物P1/P2各0.5 μL，Primer STAR GXL DNA Polymerase 1μL，5×Primer STAR GXL Buffer 5μL，dNTP Mixture 2μL，补水至25 μL ；PCR扩增程序为94℃3 min；98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 100s，35个循环；4℃10 min。反应结束后，取5 μL PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L EB）进行电泳检测PCR的结果。

1.4 PRV gC全基因的克隆和鉴定

将PCR检测结果为阳性的产物回收纯化，将 PRV/HN2012株的基因片段进行加A尾处理后，连接到克隆载体pMD^®18-T中，经连接产物的转化、重组质粒的提取、重组质粒的PCR鉴定、酶切鉴定等过程，对鉴定为阳性的克隆进行序列测定，由上海生物工程有限公司完成。

1.5 PRV gC全基因的序列分析

用MEGA4、DNAStar等软件对克隆的PRV gC全基因序列与GeneBank中下载的18株PRV gC全基因序列进行比对分析，对PRV gC全基因及gC糖蛋白的氨基酸序列进行比对分析。所有参考毒株均为GenBank上收录的典型毒株，见表4。

表4 参考毒株登录号

2 结果

2.1 PRV gC全基因的扩增结果

以提取的细胞毒DNA为模板，用引物P1/P2进行PCR扩增，扩增片段经过琼脂糖凝胶电泳检测，出现1条约1700 bp的带（图11），扩增片段的长度与预期相符。

2.2 PRV gC全基因重组质粒的PCR鉴定

将PCR产物回收纯化并连接到T载体上，经过连接产物的转化后，提取重组质粒，对重组质粒进行PCR鉴定，电泳显示1条约1700 bp的带（图12），与预期扩增大小相一致。

2.3 PRV gC全基因重组质粒的酶切鉴定

重组质粒经EcoRⅠ、PstⅠ双酶切，电泳出现2条带：其中一条带为载体质粒，约2 600 bp，另1条带为所克隆的PRV gC全基因片段，约1600 bp（图13），与预期结果相符。

2.4 PRV gC全基因的测序结果

酶切和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定，测序报告的PRV/HN2012株gC基因核苷酸序列均为1576 bp，如SEQ ID No：2所示，包含一个完整的开放阅读框（1464 bp），（G+C ）%为75.14% ，共编码487个氨基酸的多肽，相对分子质量为51961。gC基因推导的氨基酸序列有7个潜在的N-糖基化位点，有10个与二硫键形成有关的半胱氨酸。

GTTTCCTGATTCACGCCCACGCCCGTGTCGTTTTTAAAACCGCGATGGGGGGACGGGGGGCCATTCGCACGCGCCATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGATGCTCGCGCTGCTGGCGCTCTACACGGCGGCCATCGCCGCGGCGCCGTCGTCCACGACGGCGCTCGGCACGACGCCCAACGGGGGCGGGGGCGGCAACAGCAGCGCGGGCGAGCTCTCGCCCTCGCCGCCCCCGACGCCCGAGCCCGTCTCGGGGACGACGGGGGCCGCGGCCTCCACGCCCGCCACCGTCTCGACGCCCCGGGTCCCGCCGCCCTCGGTCTCGCGCCGGAAGCCCCAGCGGAACGGCAACAGGACGCGCGTCCACGGCGACAAGGCCACCTCGCACGGGCGCAAGCGCATCGTGTGCCGCGAGCGGCTGTTCTCGGCGAGGGTGGGGGACGCGGTCAGCTTCGGGTGCGCCGTCGTCCCGCGCGCCGGGGAGACCTTCGAGGTCCGCTTCTGCCGCCGCGGGCGCTTCCGCTCGCCCGACGCCGACCCCGAGTACTTTGACGAGCCCCCGCGCCCGGAGCTCCCGCGGGAGCGGCTCCTCTTCAGCTCCGCCAACGCCTCCCTCGCCCACGCGGACGCGCTCGCCTCCGCCGTCGTCGTCGAGGGCGAGCGCGCGACCGTCGCCAACGTCTCGGGCGAGGTGTCCGTGCGCGTGGCCGCGGCGGACGCCGAGACCGAGGGCGTCTACACGTGGCGCGTGCTGTCCGCCAACGGCACCGAGGTCCGCAGCGCCAACGTCTCGCTCGTCCTGTACCACCAGCCCGAGTTCGGCCTGAGCGCGCCGCCCGTCCTCTTCGGCGAGCCCTTCCGGGCGGTGTGCGTCGTCCGCGACTACTACCCGCGGCGCAGCGTGCGCCTGCGCTGGTTCGCGGACGAGCACCCGGTGGACGCCGCCTTCGTGACCAACAGCACCGTGGCCGACGAGCTCGGGCGCCGCACGCGCGTCTCCGTGGTGAACGTGACGCGCGCGGACGTCCCGGGCCTCGCGGCCGCGGACGACGCGGACGCGCTCGCGCCGAGCCTGCGCTGCGAGGCCGTGTGGTACCGCGACAGCGTGGCCTCGCAGCGCTTCTCCGAGGCCCTGCGCCCCCACGTCTACCACTCGGCGGCGGTCTCGGTGCGCTTCGTCGAGGGCTTCGCCGTCTGCGACGGCCTCTGCGTGCCCCCGGAGGCGCGCCTCGCCTGGTCCGACCACGCCGCCGACACCGTCTACCACCTCGGCGCCTGCGCCGAGCACCCCGGCCTGCTCAACGTGCGGAGCGCCCGCCCGCTGTCGGACCTCGACGGGCCCGTCGACTACACCTGCCGCCTCGAGGGCATGCCCTCGCAGCTGCCCATCTTCGAGGACACGCAGCGCTACGACGCCTCCCCCACGTCCGTGAGCTGGCCCGTCGTGACCAGCATGATCACCGTCATCGCCGGCATCGCCATCCTAGCCATCGTGCTGGTCATCATGGCGACGTGCGTCTACTACCGCCGGTCCGCGCTGTGACGCCCCCGCCCGCCCCGAATCAATAAACGACAGCGAG

2.5 PRV分离株 gC全基因序列同源性分析

使用DNAStar软件，将分离的PRV/HN2012与GenBank收录的毒株序列中选取19株来自不同国家和地区的PRV毒株进行gC基因序列分析，与分析的PRV毒株之间核苷酸序列同源性介于94.2%~99.9%（图14），其中与中国BJ株（EU719644）同源性最高（99.9%），而与日本Yamagata S-81株（D49435）同源性最低（94.2%）。

2.6 PRV分离株gC全基因推导氨基酸的序列分析

通过比较PRV/HN2012分离株与国内外其它毒株gC基因推导氨基酸序列发现，从图15可以看出，PRV/HN2012分离株与国内外其它毒株gC基因推导氨基酸序列同源性在90.9%-99.8%之间，其中与中国BJ/RD株（KF017273）同源性最高为99.8%，而与来自匈牙利Bartha株（EU719641）同源性最低为90.9%。PRV/HN2012分离株与BJ/RD、BJ、DG、Ea、Fa和P-PrV株均在63-69处插入7个氨基酸（AAASTPA）（表5），PRV/HN2012分离株还存在多处氨基酸发生变化，其中与中国HS、SN、SCZ、SQ、SS株，韩国NYJ株、日本Yamagata S-81株以及欧美分离株Becker株（M12778）、NIA3株（D49437）、Indiana S株（D49436）、Bartha株（EU719641）相比，PRV/HN2012分离株共存在41处氨基酸位点的变化，并且与所有参考毒株完全不同，PRV/HN2012株在280位发生氨基酸置换（F→L）。与BJ、DG和Ea相比，PRV/HN2012分离株在194位和280位发生氨基酸置换（G¹⁹⁴E，F²⁸⁰L）。

表5 PRV gC基因推导的氨基酸序列的比较

2.7 PRV分离株 gC全基因系统发育进化关系分析

利用软件MEGA5.0中的Boot-strapped Neigh-bor-Joining绘制PRV gC全基因进化树，从PRV gC全基因进化树可以看出，PRV/HN2012分离株与国内的BJ-RD株（KF017273）亲缘关系最近，在同一进化分支内；与Ea株（AF158090）等国内其他几个毒株和马来西亚P-PrV株（EU915280）分属同一大的进化分支（图16），遗传关系相对较近；而与韩国分离株PRV/HN2012J株（GQ325659）、日本Yamagata S-81株（D49435）以及欧美分离株Becker株（M12778）、NIA3株（D49437）、Indiana S株（D49436）、Bartha株（EU719641）分属不同的进化分支，亲缘关系最远。

3 结论与讨论

PRV基因组大小约150 Kb，G+C含量高达73%，具有复杂的二级结构和高级结构，因此对gC基因进行引物设计和PCR扩增难度较大。本发明参考已公布的Ea株gC基因序列，设计了1对引物，以分离株的DNA为模板，建立了gC全基因的特异性PCR扩增方法。由于扩增全基因是所用酶为Primer GXL，该酶为高保真酶，具有3’到5’核酸外切酶的活性，导致PCR反应之后不会加尾，为后续的TA克隆试验带来不便，因此本发明进行PRV/HN2012株gC全基因克隆之前使用rTaq酶将目的基因回收片段做72℃孵育20 min处理，以提高目的基因与T载体的连接效率。

此PRV/HN2012分离株gC基因核苷酸序列与其他国内外分离株之间同源性高达94.2%~99.9%，这表明gC基因具有严格的保守性，同时也说明PCR方法扩增PRV gC基因可靠性良好。在同源性分析及进化树中的位置可以看出，PRV/HN2012分离株与国内的BJ/RD株亲缘关系最近，在同一进化分支内；与Ea株等国内其他几个毒株和马来西亚P-PrV株分属同一大的进化分支，遗传关系相对较近；而与韩国分离株PRV/HN2012J株、日本分离株Yamagata S-81株以及欧美分离株Becker株、NIA3株、Indiana S株、Bartha株分属不同的进化分支，亲缘关系最远。这说明2012年秋季以来河南境内的新近流行毒株与近年国内的分离毒株具有较近的亲缘关系，对分离毒株生物学特性的进一步研究可以参照其他国内分离的其他流行毒株。

本发明通过对PRV gC基因序列比较发现，虽然不同PRV毒株gC基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别在94.2%和90.9以上，是相对保守的，但是仍存在不同程度的差异。这种差异主要体现在高度缺失区序列造成的第63位氨基酸后连续插入或缺失7个氨基酸（AAASTPA）和由其他部分核苷酸点突变导致所编码氨基酸的不同。表明不同地区gC蛋白存在明显的地区差异。目前，已有研究证明疱疹病毒科gC糖蛋白同源物N末端的前1/3部分保守性远低于C末端。本研究中再次得到证实，因为经过对PRV gC基因核苷酸序列比较发现，不同PRV毒株gC蛋白氨基酸的21处变异发生在第162位氨基酸前的区段内，占总变异数的52.5%，而gC蛋白的前1/3段是主要功能区，在gC的抗原表位尚未完全清楚的情况下，是否会影响PRV对宿主细胞的吸附以及病毒粒子的释放等功能，都有待进一步研究验证。

此外，PRV Bartha株是1961年匈牙利学者Bartha用猪源伪狂犬病强毒通过猪肾、鸡胚反复传代致弱的一个疫苗株。来自PRV Bartha株的伪狂犬Bartha-K61株是防控PR的经典弱毒疫苗株，已经在国内外沿用多年。自2012年春季我国许多曾使用伪狂犬Bartha-K61株免疫的猪场发生PR病例。分离自河南的PRV/HN2012分离株gC基因推导的氨基酸序列与其他国内外分离株进行比较发现，与Bartha株的同源性最低，仅为90.9%。从表5可以看出，PRV/HN2012株与Bartha株的gC蛋白氨基酸序列在16、25、43、52等19处都发生了氨基酸变化，表明PRV/HN2012分离株与Bartha株比较，PRV/HN2012分离株gC蛋白发生变异。这可能是目前猪场使用伪狂犬Bartha-K61株免疫仍发生PR的一个原因。

四、猪伪狂犬病毒PRV/HN2012株的免疫原性分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和细胞株

猪伪狂犬病毒PRV/HN2012株由本实验室分离鉴定和纯化，ST细胞购自中国兽医药品监察所，由本实验室冻存。

1.1.2 试验动物

6周龄雌性昆明小鼠购自河南省实验动物中心。

1.1.3 主要试剂

1640培养液、胎牛血清和胰蛋白酶购自Solarbio公司；甲醛购自烟台市双双化工有限公司；弗氏完全佐剂以及弗氏不完全佐剂均为SIGMA公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PRV病毒的增殖

按照常规方法培养ST细胞，以1640培养液并加入10%胎牛血清作为ST细胞的完全培养液；在细胞传代24 h后接种PRV/HN2012株第7代，置于5%CO2，37℃细胞培养箱中培养，换成含2%胎牛血清的1640维持液，继续培养48 h，当出现约80%的CPE时收获PRV/HN2012株第8代。将细胞培养物反复冻融3次，6000 rpm离心10 min去除细胞碎片，于-80℃保存备用。

1.2.2 病毒的TCID50测定

将消化吹散的ST细胞悬液接种到96孔板中，每孔200 µL，培养24 h后，取PRV PRV/HN2012株的第8代细胞培养物连续倍比稀释10^-1～10^-10，每孔接种100 µL，在细胞培养箱中孵育1h后，每孔加入100 µL含2%胎牛血清的RPMI-1640维持液继续培养，每个稀释度各作8个重复，逐日观察细胞病变情况，并按照Reed-Muench法计算病毒滴度TCID50。

1.2.3 病毒的灭活及其灭活检验

1.2.3.1 灭活时间

在病毒细胞液中加入甲醛，至终浓度为0.3%，在37℃条件下作用24 h，灭活期间，每4～6 h摇动一次。

1.2.3.2 灭活病毒液的检测

将灭活的病毒液和对照组同步接种到ST细胞上，连续盲传3代，期间观察细胞病变情况，并检测培养液血凝活性，以之判断灭活效果。

将灭活病毒液接种于普通肉汤和普通营养琼脂中，37℃培养24～48 h，观察有无细菌生长。

1.2.4 猪伪狂犬病毒乳化剂的制备

分别将5 mL弗氏完全佐剂和5 mL弗氏不完全佐剂用分散匀浆机打成油乳状，逐滴加入等体积的灭活病毒液，使之混匀并形成油包水的油乳剂型。

1.2.5 猪伪狂犬病毒乳化剂的检验

按兽用生物制品质量标准检验。

（1）外观检测

肉眼观察猪伪狂犬病毒乳化剂的外观。

（2）冷水表面试验

取一清洁吸管，吸取乳化剂缓慢滴于冷水中，观察油滴是否扩散。

（3）粘稠度检验

取口径为1.2 mm的l mL吸管于室温下吸满l mL乳化剂，以吸管呈垂直状态时自然流出0.4 mL油乳剂所需的时间作为判定标准。

（4）稳定性检验

将乳化剂加满5 mL小离心管，3000 rpm离心15 min，以不分层为稳定性良好；37℃放置21 d，观察是否有破乳、分层现象。

（5）无菌检验

将制成的乳化剂接种于普通肉汤，普通营养琼脂，血琼脂培养基，37℃培养观察3 d，无菌生长为合格。

1.2.6 小鼠免疫试验

（1）分组及动物试验

将60只6周龄雌性昆明小鼠分为4组，每组15只，即PRV/HN2012株注射组、Bartha-K61疫苗注射组、湖北98疫苗注射组和阴性对照组。PRV/HN2012株注射组每只小鼠注射0.5 mL PRV/HN2012株病毒液与弗氏完全佐剂乳化剂，两周后每只小鼠注射0.5 mL PRV/HN2012株病毒液与弗氏非完全佐剂乳化剂，再过两周后每只小鼠注射0.5 mL灭活PRV/HN2012株病毒液；Bartha-K61疫苗注射组、湖北98疫苗注射组每只小鼠注射0.5 mL稀释好的疫苗，阴性对照组每只小鼠注射0.5 mL1640培养基，每隔两周用相同剂量再免疫一次，与PRV/HN2012株注射组的免疫时间同步。32 d后将4组小鼠每组各分成两组，一组（10只）作PRV/HN2012株的攻毒处理，每只小鼠注射0.5 mL PRV/HN2012株第8代细胞培养物，每天观察小鼠临床表现，记录小鼠死亡时间；另一组（5只）采血，分离血清，进行血清作中和试验。

（2）PRV/HN2012株血清中和试验

a．待检血清的处理：待检血清56℃ 30 min水浴进行补体灭活；取500 μL灭活过的血清，做2倍连续稀释；

b．PRV/HN2012株病毒液的处理：将PRV/HN2012株第8代细胞培养物反复冻融3次，6000 rpm离心10 min去除细胞碎片，取上清，稀释成200个TCID50；

c．感作：取定量的病毒液和等体积不同稀释度的血清充分混匀37℃感作1 h；

d．接种：待感作完毕后，迅速将病毒血清混合物接种96孔板上的ST单层细胞，置于5%CO2，37℃细胞培养箱中培养，逐日观察CPE，待其充分出现感染效应，用Reed-Muench法判定和计算中和试验的半数保护量（PD50）。

2 结果

2.1 病毒滴度TCID50测定结果

常规培养ST细胞，接毒后通过倒置显微镜观察，待细胞出现变圆、脱落，形成空泡等明显的CPE后，统计并按Reed-Muench方法计算毒株的TCID50，结果得到PRV/HN2012株的TCID50 为10^-9.0。

2.2 病毒灭活效果检验

2.2.1 病变观察

用0.3% 甲醛灭活病毒，稀释10倍后，在ST细胞上盲传3代，均没有产生细胞病变。

2.2.2 灭活病毒液的无菌检测

取灭活后的病毒液分别接种于琼脂平板与营养肉汤中，37℃培养24～28 h后观察无细菌生长，符合生物制品规程要求。

2.3 PRV/HN2012株乳化剂的鉴定

2.3.1 外观检测

外观呈乳白色均质乳剂，静置后，不分层。符合质量标准。

2.3.2 冷水表面试验

制备的乳化型为水包油包水型。将制备的乳化剂滴于冷水表面，结果为先不扩散，再缓慢向四周散去。

2.3.3 黏度测定

用l mL吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7 mm)在25℃室温下吸满1 mL乳化剂，垂直放出0.4 mL需2 S。在2～6 S范围内，说明黏度合格，适合于注射用。

2.3.4 稳定性测定

将乳化剂经3000 rpm离心15 min后无分层和破乳现象，37℃放置21d后也无破乳、分层现象，说明其具有一定的稳定性。

2.4 PRV/HN2012株攻毒试验结果

分别从 PRV/HN2012株免疫组、Bartha-K61疫苗免疫组、湖北98疫苗免疫组和阴性对照组小鼠中随机各抽取10只小鼠，每只小鼠注射0.5mL PRV/HN2012株第8代细胞培养物，每天观察小鼠临床表现，记录小鼠死亡时间。阴性对照组的10只小鼠在接种后72 h内全部死亡，而Bartha-K61疫苗免疫组的10只小鼠在接种72 h内，仅2只发生神经症状，直至120 h时死亡5只小鼠，而湖北98免疫组在接种120 h后有3只小鼠才出现神经症状及死亡现象，各组小鼠死亡及死亡率见表6。

表6 PRV/HN2012株攻毒试验死亡率统计结果

2.5 PRV/HN2012株中和试验结果

分别从 PRV/HN2012株免疫组、Bartha-K61疫苗免疫组、湖北98疫苗免疫组和阴性对照组的小鼠中随机抽取5只小鼠，断尾采血，取血清，56℃灭活，2倍稀释，最低浓度稀释至2^-9，与PRV/HN2012株第8代（TCID50为10^-9/mL）进行中和实验，逐日观察细胞病变情况，结果表明PRV/HN2012株免疫组的血清1:42稀释可保护50%的细胞免于出现CPE（表7），而Bartha-K61疫苗免疫组和湖北98疫苗免疫组血清的中和效价相对较低，阴性对照不能保护细胞。

表7 PRV/HN2012株中和试验结果

3 结论与讨论

国外伪狂犬的净化方案一般是用伪狂犬活疫苗免疫加野毒检测淘汰感染猪的方法，疫苗毒株一般用Bartha-k61毒株的活疫苗，由于国外一般为大型规模化猪场，免疫到位，实验室检测及时，生物安全措施严格，所以使国外一些国家成功净化了伪狂犬。

国内猪场现用使用的伪狂犬疫苗基本为伪狂犬活疫苗，毒株有Bartha-k61和HB98两种，以Bartha-k61毒株用的最多，进口疫苗（勃林格、梅里亚、海博莱）和国产疫苗（普莱柯、广东永顺、大华农、中牧股份）等企业均为Bartha-k61毒株，在免疫程序上不管是用进口疫苗和国产疫苗，种猪：一般一年防疫4次，间隔3月1次，1头份/头；育肥猪：进口苗10周防疫一次，1头份/头；国产疫苗1-3 d滴鼻一次 1头份/头，6周龄肌肉注射1次，个别感染严重猪场10周加强免疫一次，剂量为1头份/头。

目前国内对于伪狂犬临床发病猪场，一般采样检测 gE抗体，若确定阳性即可确诊，对于确诊阳性场一般用伪狂犬疫苗紧急免疫接种，仔猪2头份，种猪4头份，由于大部分猪场野毒感染率较高，现采取检测淘汰野毒感染猪的较少。对野毒感染猪群主要采取疫苗加强免疫的办法。

2012年春季以来，中国大部分猪场开始爆发伪狂犬病，不管是疫苗免疫程序不完善的中小规模猪场和疫苗免疫程序合理的大规模猪场，不管是应用进口疫苗和国产疫苗的猪场均有发病现象，母猪产弱仔、死胎或木乃伊胎，仔猪出现神经症状、死亡，死亡率达10%~50%，给我国养猪业造成了巨大经济损失。以前个别已经净化的猪场也重新出现野毒感染情况，gE阳性率大部分都在50%以上，分析重新感染发病的原因：1. 以前伪狂犬疫苗的不合理、无序免疫造成野毒出现变异；2. 目前国内圆环病毒、蓝耳的感染率很高，而这两种病的感染会破坏机体的的免疫细胞，使疫苗的免疫效果下降；3. 饲料中霉菌毒素的广泛存在也可造成疫苗的免疫效果下降，使伪狂犬重新发病。

为确定这些猪场是否发生了PRV野毒感染，以及新流行株对猪伪狂犬病新疫苗的研究是否有参考意义，本发明对PRV/HN2012株进行免疫原性研究。将PRV/HN2012株、Bartha-K61株和湖北98株免疫小鼠后，分别用PRV/HN2012株进行攻毒试验，PRV/HN2012株接种组死亡率明显低于Bartha-K61株和湖北98株疫苗注射组；以50%CPE的血清稀释度作为最高中和效价的判定标准，PRV/HN2012株与自身的血清中和效价最高，其次为Bartha-K61株，与湖北98株的中和效价略低于Bartha-K61株，表明PRV/HN2012株与Bartha-K61株和湖北98株之间存在一定的抗原交叉性，但抗原性存在差异。彭金美等也报道2011年新分离PRV HeN1株与Bartha k61 株接种猪血清产生中和抗体水平较低，而与HeN1 分离株接种猪血清产生抗体水平高。但现有疫苗株对PRV/HN2012分离株免疫保护效果还有待动物试验来进一步验证。