技术领域本发明具体涉及一种添加原儿茶酸促进谷氨酸棒杆菌生长及高产L-丝氨酸的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
L-丝氨酸属于非必需氨基酸，具有重要的生理功能和应用价值，广泛应用于医药、食品和化工领域。L-丝氨酸应用于氨基酸输液的成分；作为中间体用于嘌呤、胆碱、胸腺嘧啶以及多巴的合成；L-丝氨酸的羟基经磷酸化后生成磷酯酰丝氨酸，该物质具有重要的生理功能；L-丝氨酸作为母核衍生化反应的产物具有重要的药用功能。环丝氨酸是一种广谱抗生素用于治疗结核病，也是β-内酰胺抗生素合成的中间体；另外比较重要的衍生物就是偶氮丝氨酸，其除了用于治疗肿瘤的药物外还是谷氨酰胺的抗代谢物而用于急性白血病和柯杰金氏病的治疗；L-丝氨酸能够稳定滴眼液的pH，且对眼部无刺激性。目前L-丝氨酸的生产主要依赖于蛋白水解法、酶法转化法及微生物前体发酵法，然而这些方法存在产量小，生产成本高，环境污染大等问题，不适合进行大规模工业化生产L-丝氨酸。微生物发酵法利用可再生的糖质原料直接代谢生产L-丝氨酸是一种绿色环保可持续的生产方式，已经成为研究L-丝氨酸工业化生产的热点。然而这种生产方法由于受到菌株的限制，始终没有获得进一步的突破，这也使得L-丝氨酸成为瓶颈氨基酸。谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是重要的氨基酸生产菌株，广泛应用于发酵法生产谷氨酸、赖氨酸和缬氨酸等。目前在构建高产L-丝氨酸的菌株研究中，主要集中于解除L-丝氨酸对L-丝氨酸合成途径关键酶3-磷酸甘油酸(PGDH)的反馈抑制现象，降低L-丝氨酸的降解途径等。本实验室以一株诱变的谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a(菌株保藏号CGMCCNo.8667)通过解除L-丝氨酸对PGDH的反馈抑制，减少L-丝氨酸的降解等获得了能够利用蔗糖直接发酵生产L-丝氨酸的重组菌株SYPS-062-33aΔSSA(菌株保藏号CGMCCNo.8668)。本发明提供了一种添加原儿茶酸(PCA)促进谷氨酸棒杆菌生长及高产L-丝氨酸的方法，结果表明添加原儿茶酸至培养基中可以促进谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33aΔSSA的生长，谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33aΔSSAOD562达到54.32，菌体干重达10.3g/L，较未添加原儿茶酸时提高了87％；L-丝氨酸产量达到19.75g/L，较对照提高了1.78倍，提高了利用谷氨酸棒杆菌生产L-丝氨酸的效率。
技术实现要素：
本发明提供一种添加原儿茶酸促进谷氨酸棒杆菌生长提产L-丝氨酸产量的方法。为解决上述技术问题，本发明所提供的具体技术方案如下：按添加量为每升培养基添加10mg、30mg、50mg原儿茶酸，添加到谷氨酸棒杆菌发酵产L-丝氨酸的全合成培养基中，对谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33aΔSSA进行发酵培养，30℃，220rpm，检测谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33aΔSSA生长及产L-丝氨酸的情况。本发明的有益效果如下：将本发明提供的原儿茶酸添加到谷氨酸棒杆菌全合成培养基中进行摇床发酵培养，可使谷氨酸棒杆菌在全合成发酵培养基中的生物量提高约87％，L-丝氨酸产量(g/L)提高近1.78倍，提高了利用谷氨酸棒杆菌生产L-丝氨酸的效率。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。例如将原儿茶酸溶解在不同的溶剂中添加、添加不同浓度的原儿茶酸等。以下通过实例形式的具体实施方式对本发明的上述内容再做进一步详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术领域均属于本发明的范围。具体实施方式实施例1：未添加原儿茶酸时谷氨酸棒杆菌生长及产L-丝氨酸的能力1.菌种：以谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33aΔSSA(Corynebacteriumglutamicum)菌株(保藏号CGMCCNo.8668)作为出发菌进行L-丝氨酸的生产。2.种子培养基：蔗糖2％；BHI3.7％；硫酸铵1％；MgSO4·7H2O0.05％；NaH2PO40.03％；K2HPO40.02％；发酵培养基：蔗糖10.0％；(NH4)2SO43.0％；CaCO33.0％；K2HPO40.3％；MgSO4·7H2O0.05％；FeSO4·7H2O0.002％；MnSO4·H2O0.002％；Biotin50μg/L；Thiamine·HCl450μg/L；pH7.0-7.2；3.谷氨酸棒杆菌发酵培养：利用接种环将菌株划线于种子培养基固体平板中，将平板置于30℃恒温培养箱中培养至长出单菌落，接种环分别划取一环菌体接种至20ml种子培养基中，30℃，120rpm培养至对数生长中期，按照5％的接种比接种至25ml摇瓶发酵培养基中，30℃，120rpm发酵培养。每组做3个重复。4.生物量的检测：每12h发酵取样，利用分光光度计测定生物量(OD562)。生物量(g/L)＝0.1925*OD562-0.0994；5.氨基酸浓度的检测：HPLC法测定发酵液中氨基酸浓度条件如下；将发酵液用ddH2O稀释至合适浓度，以异硫氰酸苯酯(PITC)作为衍生剂将氨基酸衍生化，产物苯氨基酸硫甲酰衍生物(PTC-AA)在254nm有稳定的强紫外吸收，采用Venusil-AA氨基酸分析专用柱(4.6×250mm，5μm)，在紫外下检测衍生物。流动相A相：92.6mM乙酸钠，用冰醋酸将pH调节到6.50±0.05；流动相B相：80％乙腈，流速1.0ml/min，柱温：40℃，紫外检测器波长254nm。梯度洗脱程序为：0～4min，100％A；4～16min，97％A；16～17min，89％；17～32min，79％A；32～34min，66％A；34～38min，0％A；38.01，100％A。6.氨基酸标准品和样品衍生化步骤：(1)准确量取氨基酸混合标准液及样品200μl，分别置于1.5ml离心管中；(2)每管中准确加入正亮氨酸内标液20μl；(3)分别向每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液100μl，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μl，混匀，室温放置反应1h；(4)加入正己烷400μl，剧烈震荡后放置10min；(5)取下层PTC-AA溶液，用0.45μm针式过滤器过滤；(6)取滤过清液100μl，加入400μlddH2O稀释，摇匀，进样20μl样品衍生化反应中所需的溶液如下：三乙胺乙腈：三乙胺1.4ml+乙腈8.6ml，混匀；-20℃保存。异硫氰酸苯酯乙腈溶液：PITC25μl，加入乙腈2ml，混匀。(密闭，4℃放置保质期为7天)正亮氨酸内标液：称取正亮氨酸10mg，加入0.1M盐酸溶液10ml使其溶解，混匀，4℃保存。实验结果见表1，当不添加原儿茶酸，谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33aΔSSA生长缓慢且产酸效率较低。表1未添加原儿茶酸时谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33aΔSSA生长及产酸的能力时间(h)生物量(g/L)L-丝氨酸(g/L)00.0931ND602.09451.82591205.51327.1257实施例2：添加不同量原儿茶酸对谷氨酸棒杆菌生长及L-丝氨酸产量的影响1.菌种：以谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33aΔSSA(Corynebacteriumglutamicum)菌株(保藏号CGMCCNo.8668)作为出发菌进行L-丝氨酸的生产。2.种子培养基：蔗糖2％；BHI3.7％；硫酸铵1％；MgSO4·7H2O0.05％；NaH2PO40.03％；K2HPO40.02％；发酵培养基：蔗糖10.0％；(NH4)2SO43.0％；CaCO33.0％；K2HPO40.3％；MgSO4·7H2O0.05％；FeSO4·7H2O0.002％；MnSO4·H2O0.002％；Biotin50μg/L；Thiamine·HCl450μg/L；pH7.0-7.2；3.原儿茶酸的添加：按添加量为每升培养基添加10mg、30mg、50mg原儿茶酸，添加到谷氨酸棒杆菌发酵产L-丝氨酸的全合成培养基中；4.谷氨酸棒杆菌发酵培养：参照实施方式例一；5.生物量的检测：参照实施方式例一；6.氨基酸浓度的检测：参照实施方式例一；7.氨基酸标准品和样品衍生化步骤：参照实施方式例一；相关实验结果见表2、表3、表4，结果表明每升培养基添加30mg原儿茶酸效果最佳，谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33aΔSSA生长OD562达到54.32，生物量达10.3g/L，较未添加原儿茶酸时提高了87％；L-丝氨酸产量达到19.75g/L，较对照提高了1.78倍。表2每升培养基添加10mg原儿茶酸对谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33aΔSSA生长及产酸的影响时间(h)生物量(g/L)L-丝氨酸(g/L)00.09310120.13620.0972240.29150.2617361.39320.8251482.89101.6239605.51323.9812726.19827.1284846.95849.1920967.298310.41071087.527111.20631207.682912.5785表3每升培养基添加30mg原儿茶酸对谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33aΔSSA生长及产酸的影响时间(h)生物量(g/L)L-丝氨酸(g/L)00.09310120.24130.1832240.48200.5636361.70241.2525484.44942.5937606.82485.6443728.588110.1383849.450516.2729969.383217.437810810.224418.540912010.357219.7511表4每升培养基添加50mg原儿茶酸对谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33aΔSSA生长及产酸的影响时间(h)生物量(g/L)L-丝氨酸(g/L)00.09310120.19260.1535240.35050.4926361.52471.0129483.91222.2078606.13565.1204727.84929.3728848.539113.8617969.192015.31681089.623516.45214-->1209.854217.2190