一种用于血管钙化诊断的血浆标志物、引物对、试剂盒及应用的制作方法与工艺

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种用于血管钙化诊断的血浆标志物、引物对、试剂盒及应用。

背景技术：
血管钙化(Vascularcalcification)是糖尿病、高血压、动脉粥样硬化性血管病变及其他血管损伤等疾病普遍存在的病理改变，是心脑血管疾病高发病率及高死亡率的重要因素之一，甚至被认为是一个精确预测心血管不良事件的指标。以往认为血管钙化是钙盐在细胞内及细胞外基质的被动沉积。然而，近年发现血管钙化是一个主动的、高度可调的生物学过程，其过程类似于骨形成。血管平滑肌细胞作为心血管系统主要的构成细胞，其由收缩表型向成骨细胞样表型转变，是血管钙化发生、发展的关键病理过程。目前临床上对于血管钙化尚缺乏安全有效的治疗方法。通过冠脉造影术和双能源CT扫描技术等影像学检测方法确认血管钙化病灶时，患者的血管钙化情况一般已经较为严重，不易根治，且费用较为昂贵。即使新近发展起来的旋磨切除术或切割球囊血管成形术对已形成的钙化病灶进行治疗的效果也不甚理想。因此，寻找有效、特异的早期诊断指标及治疗靶点，对临床及时预防和治疗血管钙化具有重要意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是长度约18～22个氨基酸的小分子非编码调控RNA，它通过与靶基因mRNA的3′端非编码区(3′UTR)相互配对结合，降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译，从而在转录后水平负调控靶基因的表达。由于血管钙化与骨形成有相似的机制，同时与血管的氧化应激、血管损伤、血管平滑肌表型改变、血脂代谢的异常及动脉粥样硬化等密切相关，故认为参与调节血管损伤、血管平滑肌表型改变及动脉粥样硬化的miRNA，尤其是调节骨形成的miRNA极可能参与血管钙化的发生。此外，Chen等的研究已初步证实miRNAs可作为糖尿病等疾病的血浆生物学标志物(ChenX,etal,CharacterizationofmicroRNAsinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases.CellRes,2008,18(10):997-1006)，这也使血浆miRNAs作为疾病的诊断标记分子应用于临床成为可能。研究表明miR-32-5p在调节骨再生方面具有重要作用(PalmieriA,etal，Medporregulatesosteoblast'smicroRNAs[J].BiomedMaterEng,2008.18(2):91-97)，它在血管钙化过程中可能同样起到关键性作用。目前尚无将血浆miR-32-5p作为血管钙化相关标志物的报道，我们首先发现miR32-5p在血管钙化血浆中的高表达，可以为开发试剂盒作为临床依据。如果能检测出miR-32-5p在血管钙化患者血浆中的显著性表达差异，将对血管钙化的临床早期诊断和治疗产生重要的指导价值。

技术实现要素：
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种用于血管钙化诊断的血浆标志物、引物对、试剂盒及应用。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：所述用于血管钙化诊断的血浆标志物为miR-32-5p，序列如SEQIDNO.1所示，该标志物可用于制备血管钙化诊断试剂。检测上述标志物的引物对包括miR-32-5p的PCR正向引物和PCR通用反向引物；所述miR-32-5p的PCR正向引物序列如SEQIDNO.2所示，所述PCR通用反向引物序列如SEQIDNO.3所示。血管钙化诊断试剂盒中含有权利要求2所述的引物对。优选地，所述试剂盒中还含有内参miR-16的PCR正向引物；所述内参miR-16序列如SEQIDNO.4所示，所述内参miR-16的PCR正向引物序列如SEQIDNO.5所示。检测上述标志物的方法包括如下步骤：(1)提取miRNA；(2)将miRNA逆转录成cNDA；(3)用上述试剂盒对cDNA进行扩增；(4)通过溶解曲线和扩增曲线分析，2-ΔΔCT法进行miR-32-5p的相对定量。发明人通过对比分析血管钙化患者及非钙化对照组血浆中的miR-32-5p的含量差异，发现miR-32-5p在血管钙化患者血浆中的含量明显高于对照组血浆，表明miR-32-5p与血管钙化呈正相关，以miR-32-5p含量水平为区分标准，可以进一步开发用于血管钙化诊断的检测试剂盒，为早期诊断血管钙化提供临床依据。本发明首次对血管钙化具有特异筛查价值的生物标记物miR-32-5p，发现血浆miR-32-5p检测可以用于血管钙化患者诊断；通过血管钙化相关的血浆标志物miR-32-5p和诊断试剂盒的开发和应用，可以快速诊断血管钙化病情并及时有效治疗，也为发掘新型有效的小分子药物靶标提供科学依据。附图说明图1为血管钙化患者与非钙化对照组血浆中miRNA表达水平比较。图2为血管钙化患者与非钙化对照组血浆中miRNA表达水平ROC曲线。具体实施方式实施例1：血浆miR-32-5p在血管钙化患者与非钙化对照组中的表达水平一、研究对象选择2013年6月至2014年5月间南华大学附属第一医院行冠状动脉冠脉造影术和双源CTC检查确诊冠脉钙化的患者66例。排除既往有心肌梗死病史，冠状动脉或外周动脉血运重建病史者，肝肾功能不全、甲状腺或肾上腺功能紊乱，钙代谢异常，慢性感染(活动性结核、COPD迁延期)、结缔组织病、肿瘤、免疫系统疾病或精神病及其他疾病的终末期等。根据冠脉CTA的Agatston法积分(CACS)分为冠脉钙化组与对照组，其中冠状动脉钙化积分等于0分患者即非冠脉钙化组33例，而冠状动脉钙化积分大于0分患者33例。研究过程中所涉及的资料收集及血样采集均在研究对象知情同意下进行。二、研究方法1.血浆收集所有纳入观察的患者均于术时抽动脉血约3ml置于10mlEDTA-K2抗凝管。标本采集后静置30分钟后，3000rpm离心10分钟取上清液血浆分装于EP管,置于-70℃低温保存血浆。2.采用miRNA提取分离试剂盒提取血浆中miRNA(miRNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号：DP501)(1)取200ul血浆加入等体积裂解液，振荡器振荡混匀30秒。室温放置5分钟。室温12000rpm离心10分钟，吸取上清转移到新管中。(2)加入200ul氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置5分钟，取水相转移至新管中。(3)量取转移液，加入转移液体积1/3的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin，室温放置2分钟，室温12000rpm离心30秒，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液。(4)量取流出液，缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2分钟，室温12000rpm离心30秒，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。(5)向吸附柱miRelute中加入500ul去蛋白酶MRD，室温静置2分钟，室温12000rpm离心30秒，弃废液。(6)向吸附柱miRelute中加入600ul漂洗液RW，室温静置2分钟，室温12000rpm离心30秒，弃废液。(7)重复步骤(5)。(8)将吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室温12000rpm离心1分钟，弃废液。(9)将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free1.5ml离心管中，加入20ulRNase-Free双蒸水，室温静置2分钟，室温12000rpm离心2分钟，收集得到纯净的miRNA。3.采用Mir-XTMmiRNA第一链合成试剂盒(试剂盒购自TAKARA公司,货号638313)(1)在冰上预冷RNaseFree的反应管内加入以下试剂至总体积10ul(2)移液器轻轻混匀上述配制的反应液，37℃反应60分钟，接着85℃反应5分钟，在所得的反应液中加入90μl双蒸水，即得到所需cDNA。4.荧光定量PCR反应按照Mir-XTMmiRNAqRT-PCR试剂盒说明书进行(试剂盒购自TAKARA公司，货号：638314)(1)荧光定量PCR反应体系配制(2)扩增反应程序设置如下：Stage1：预变性95℃10秒Stage2：PCR反应(40个循环)95℃5秒60℃20秒Stage3：溶解曲线分析95℃60秒55℃30秒95℃30秒以SYBRGreen作为荧光标记物，在ABI荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。扩增miR-32-5p的正向引物序列如SEQIDNO.2(GGCGGCGGTATTGCACATTACTAA)所示，miR-32-5p的序列如SEQIDNO.1(UAUUGCACAUUACUAAGUUGCA)所示，反向引物为通用反向引物，通用反向引物序列如SEQIDNO.3(GCGCAATGCATCGCATAGCAACTGT)所示。以miR-16作为内参基因，内参miR-16序列如SEQIDNO.4(UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG)所示，内参miR-16的PCR正向引物序列如SEQIDNO.5(GCGGCGGTAGCAGCACGTAAATA)所示，反向引物为SEQIDNO.3所示的通用反向引物。5.研究结果与分析采用实时荧光定量PCR测得的血浆miR-32-5p的表达量，用Ct32-5p表示，miR-16的表达量用Ct16表示。血浆miR-32-5p的相对表达量＝2﹣ΔΔCt，[ΔΔCt＝(Ct32-5p-Ct16)血管钙化-(Ct32-5p–Ct16)对照]。结果如附图1所示，与非钙化对照组相比，血管钙化患者血浆中miR-32-5p的含量明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。miRNA引物探针信息及目标序列如表1所示：表1.miRNA引物探针信息及其成熟序列实施例2：miR-32-5p对血管钙化患者的诊断效果评价ROC曲线分析显示，miR-32-5p作为生物标记物对血管钙化具有较高诊断价值(AUC为0.831)，详细分析结果见表2。表2：ROC分析结果实施例3：血管钙化诊断试剂盒检测血浆miR-32-5p含量的血管钙化诊断试剂盒组成如表3所示：表3血管钙化诊断试剂盒的组成表3中，用于血管钙化诊断的试剂盒中miR-32-5p的PCR正向引物序列如SEQIDNO.2所示，miR-16的PCR正向引物序列如SEQIDNO.5所示；相应PCR技术所需的常用试剂，如：逆转录酶，逆转录缓冲液，SYBR预混物，ROX染料，RNase-Free双蒸水等，都是本领域技术人员熟知的；另外还可以含有标准品和对照品。