一种从细菌上清中分离纯化7-羟基环庚三烯酚酮的方法与流程

本发明属于生物工程、生物化学技术领域，具体涉及一种从细菌上清中分离纯化7-羟基环庚三烯酚酮的方法。

背景技术：

7-羟基环庚三烯酚酮类化合物是属于环庚三烯酮型化合物的一类天然产物，在很多个方面表现出多元的生物活性。由于在酮基的邻位多了一个羟基，使得7-羟基环庚三烯酚酮相对于环庚三烯酚酮表现出更强的抑制活性。一些研究显示7-羟基环庚三烯酚酮及其衍生物β-苧侧柏酚（β-thujaplicinol）、3,7-二羟基环庚三烯酚酮、软毛青霉酸（puberulic acid）、软毛青霉酮酸（puberulonic acid）可作为多种疾病的潜在治疗药物。7-羟基环庚三烯酚酮对于革兰氏阳性细菌表现出较强的抑制活性，如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）与藤黄微球菌（Micrococcus luteus）的MIC值为90 μM。7-羟基环庚三烯酚酮对于B16黑色素瘤细胞的IC50值为2.2 μM。7-羟基环庚三烯酚酮具有抗疟疾活性，对于对具有氯喹抗性的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）K1菌株的IC50值为6.4 μM。α-羟基环庚三烯酚酮类化合物对于双原子金属酶有抑制活性，7-羟基环庚三烯酚酮对于双原子金属酶肌醇单磷酸酶（IMPase）、碱性磷酸酶（APase）、多巴胺β-氧化酶（DBM）的IC50值分别为8、60、3 μM。7-羟基环庚三烯酚酮还可以抑制细菌内氨基糖苷2”-O-腺嘌呤转移酶，可作为氨基糖苷类抗生素的增强性共药物。

在1953年，日本科学家Nozoe利用环庚三烯酚酮为前体，通过过硫酸钾氧化合成7-羟基环庚三烯酚酮。1982年美国科学家Kirst利用相同的合成方法合成7-羟基环庚三烯酚酮，分离方法是反应混合物调至pH 4，乙醚萃取去除未反应环庚三烯酚酮，水相调至pH 1.9，蒸气浴加热，用氢氧化钠调至pH 4.2后用乙醚萃取。乙醚萃取物蒸干后，产物用对流分配系统分离纯化，溶剂系统为氯仿-甲苯-甲醇-水（15:15:23:7）。最终25 g环庚三烯酚酮可收得3.8 g7-羟基环庚三烯酚酮。在微生物中7-羟基环庚三烯酚酮最先是由美国科学家Allen在寝屋川链霉菌（Streptomyces neyagawaensis）的发酵液中作为一种具有广谱抗微生物活性的抗生素分离纯化出来的。他们利用HP-20与Sephadex G-10柱层析在寝屋川链霉菌（Streptomyces neyagawaensis）发酵液中提取7-羟基环庚三烯酚酮，其纯度约为25%。之后德国科学家Korth从一株假单胞菌中也分离得到7-羟基环庚三烯酚酮，所用分离方法为将培养物上清调至pH 3，用二氯甲烷萃取三次，将有机相蒸干溶剂后在100℃下使剩余物升华结晶得到7-羟基环庚三烯酚酮产品。

7-羟基环庚三烯酚酮具有极大药用潜力，目前主要来源是化学合成，但化学合成方法中存在易燃、易爆、有害试剂等问题。现有的微生物发酵提取7-羟基环庚三烯酚酮也存在产量、纯度不高，回收率低等问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种从细菌上清中分离纯化7-羟基环庚三烯酚酮的方法，该方法适合工业生产高纯度7-羟基环庚三烯酚酮。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种从细菌上清中分离纯化7-羟基环庚三烯酚酮的方法，包括以下步骤：

（1）收集东湖假单胞菌（Pseudomonas donghuensis）HT发酵液，离心后将上清过滤去除剩余菌体与不溶物，得到菌液上清。所述的东湖假单胞菌HT保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏日期：2015年8月6日，保藏地址：中国. 武汉. 武汉大学），其分类命名为Pseudomonas donghuensis HT，保藏编号为CCTCC NO：M 2015481。

（2）将菌液上清用乙酸乙酯萃取，用以去除疏水性的杂质，保留下层的水相。将水相的pH调至酸性，将水相再次用乙酸乙酯萃取，收集上层有机相。

（3）将有机相中的乙酸乙酯减压蒸干，余下的物质溶于无水乙醇中。

（4）利用Sephadex LH-20进行色谱纯化，流动相为无水乙醇。收集有螯铁活性的组分，将收集的有螯铁活性的组分中的无水乙醇减压蒸干结晶得到7-羟基环庚三烯酚酮晶体。

步骤（1）中所述的离心条件优选为：8000-10000 rpm离心25-30 min。

步骤（2）中所述的酸性优选为pH= 2-3。

步骤（2）中水相的pH优选用盐酸调节至pH = 2-3。

步骤（2）中萃取菌液上清的乙酸乙酯的量优选为菌液上清体积的1/2，优选萃取两次。

步骤（2）中萃取水相的乙酸乙酯的量优选为水相体积的1/2，优选萃取两次。

步骤（2）优选为：将菌液上清用其1/2体积的乙酸乙酯萃取两次，保留下层的水相。将水相的pH用盐酸调至pH = 2-3，将水相再次用其1/2体积的乙酸乙酯萃取两次，收集上层有机相。

步骤（3）和（4）中所述的减压蒸干优选为用旋转蒸发仪在40-42℃水浴中减压蒸干。

本发明具有以下优点：

本发明利用东湖假单胞菌HT为出发菌株，通过微生物发酵出含7-羟基环庚三烯酚酮的发酵液，避免了化学合成方法中易燃、易爆、有害试剂等问题。将发酵液通过离心过滤取上清，乙酸乙酯萃取，柱层析的简单过程，可得到纯度达90%以上的7-羟基环庚三烯酚酮结晶产品。涉及仪器试剂简单易实现，避免了一些繁琐工艺与有毒试剂的参与，更加经济与环保。

东湖假单胞菌HT产7-羟基环庚三烯酚酮的量约为80 mg/L。通过本发明每升菌液上清可得到50-60 mg 7-羟基环庚三烯酚酮，回收率大于60%。

附图说明

图1是提纯的7-羟基环庚三烯酚酮的紫外可见光光谱图。

图2是提纯的7-羟基环庚三烯酚酮的高效液相色谱图，A：检测波长为258 nm， B：检测波长为330 nm，C：检测波长为375 nm。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 7-羟基环庚三烯酚酮的分离、纯化与鉴定

（1）7-羟基环庚三烯酚酮的提取与纯化

培养东湖假单胞菌HT与提纯7-羟基环庚三烯酚酮的培养基为MKB液体培养基。每升MKB液体培养基中含有成分：15 mL甘油，3.28 g三水磷酸氢二钾，5 g酸水解酪蛋白，2.5 g七水硫酸镁，pH 7-7.2；MKB液体培养基中铁离子与亚铁离子总含量不高于1 μM。东湖假单胞菌HT保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏日期：2015年8月6日，保藏地址：中国. 武汉. 武汉大学），其分类命名为Pseudomonas donghuensis HT，保藏编号为CCTCC NO：M 2015481。

1）将东湖假单胞菌HT接种在含有5 mL液体MKB培养基的试管中，30 ℃摇床震荡培养过夜活化。

2）将培养过夜后的菌液按1%（V/V）的接种量转接于含有50 mL液体MKB培养基的250mL三角摇瓶中，30 ℃摇床震荡培养12 h。

3）将培养12 h后的菌液用大型冷冻离心机室温10000 rpm离心30 min，收集上清。通过0.22 μm millipore微孔过滤器过滤上清去除剩余菌体与不溶物。

4）将过滤后的上清用上清体积的1/2的乙酸乙酯萃取两次，用以去除疏水性的杂质，保留下层的水相。将水相的pH用浓盐酸调至pH=2，将pH调至2的水相再次用水相体积的1/2的乙酸乙酯萃取两次，此时7-羟基环庚三烯酚酮进入到乙酸乙酯中，保留上层有机相。将有机相中的乙酸乙酯用旋转蒸发仪在40 ℃水浴中减压蒸干，此时瓶底会出现淡黄色针状晶体。将淡黄色针状晶体溶于10 ml无水乙醇中进行色谱纯化。

5）利用Sephadex LH-20进行色谱纯化，流动相为无水乙醇。所用Sephadex LH-20柱柱高13 cm，柱径1 cm。每次上样量为200 μL。利用CAS检测液测定收集组分的螯铁活性，有螯铁活性的组分即为含有7-羟基环庚三烯酚酮的组分，将有螯铁活性的组分收集下来。

6）将收集的有螯铁活性的组分用旋转蒸发仪在40 ℃水浴中减压蒸干结晶，即得到纯化后的7-羟基环庚三烯酚酮晶体。

（2）7-羟基环庚三烯酚酮的鉴定

将分离纯化的7-羟基环庚三烯酚酮进行紫外可见光光谱和高效液相色谱检测，结果显示所分离纯化7-羟基环庚三烯酚酮紫外可见光光谱特性与文献中报道一致，其纯度达90%以上，每升菌液上清经上述方法提取与纯化可得到50-60 mg 7-羟基环庚三烯酚酮。7-羟基环庚三烯酚酮的检测结果如下：

1）紫外可见光光谱检测，所用的分光光度计型号为shimadzu UV 2550。检测结果如图1所示，纯化样品的紫外可见光光谱在258、330、375、365 nm有吸收峰，258 nm处的吸收峰代表不饱和键的吸收，330、375、365 nm处的吸收峰与共轭结构有关。纯化样品的紫外可见光光谱与化学合成的7-羟基环庚三烯酚酮的紫外可见光光谱和文献（Yoshinaga Oka, Shigeki Matsuo. 1956. Spectrophotometric Studies on Organometallic Complexes Used in Analytical Chemistry on the Germanium Complex with 3-hydroxytropolone. Tohoku University. Ser. A, Physics, chemistry and metallurgy. 8, 532-539.）中报道一致。根据Yoshinaga Oka的研究，1×10^-4 M的7-羟基环庚三烯酚酮在中性环境下在330 nm处的吸收值约为0.9左右，而在东湖假单胞菌HT上述培养12h的上清在330 nm处的最大吸收约为5-6，经过计算得出7-羟基环庚三烯酚酮在东湖假单胞菌HT菌株上清的产量约为80 mg/L，即上述分离纯化方法的回收率在60%以上。

2）高效液相色谱检测，所用的高效液相色谱仪器型号是Agilent 1100。所用色谱柱是Eclipse plus C18反相色谱柱 4.6×250 mm，流动相为甲醇:水=4:6（V/V），流动相速率设置为1 mL/min，每次上样量为10 μL，检测波长为258、330、375 nm。结果显示有一个明显的洗脱主峰（图2），说明纯化样品中的组成单一，7-羟基环庚三烯酚酮纯度达90%以上。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。